金剛藤顆粒對急性盆腔炎模型大鼠NLRP3炎癥小體通路及免疫功能的影響*

鄒學(xué)紅 汪 俊 王 芳 謝 環(huán)

（湖北省武漢市漢陽醫(yī)院，湖北 武漢 433000）

急性盆腔炎（APID）是指女性內(nèi)生殖器及盆腔腹膜等部位的炎癥性疾?。?］，主要表現(xiàn)為慢性下腹痛、嘔吐、惡心、月經(jīng)紊亂等癥狀，且由于該病炎癥擴(kuò)展范圍不同，患者臨床表現(xiàn)并不完全一致［2］。APID炎癥嚴(yán)重者可引發(fā)感染性休克、彌漫性腹膜炎等并發(fā)癥。NLRP3炎癥小體參與多種炎癥反應(yīng)，可促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）前體轉(zhuǎn)化為有活性的IL-1β，使其加重炎癥反應(yīng)。張強(qiáng)等研究報道NLRP3炎癥小體在腎臟炎癥損傷早期過程發(fā)揮重要作用［3］。研究報道，抑制NLRP3的表達(dá)，可減弱慢阻肺、心肌損傷等疾病中的炎癥反應(yīng)，但關(guān)于NLRP3在APID中的研究尚未見報道［4］。金剛藤顆粒具有解熱清毒、抗菌消腫的作用，可用于盆腔炎等婦科疾病的治療［5］。本研究采用金剛藤顆粒治療APID大鼠，探究其對大鼠NLRP3炎癥小體及免疫功能的影響，以期為臨床治療APID的機(jī)制提供更多的思路?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雌性SD大鼠105只由武漢大學(xué)動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2014-0004，使用許可證號SYXK（鄂）2014-0013，體質(zhì)量200～220 g。按照實驗動物飼養(yǎng)管理規(guī)定飼養(yǎng)，大鼠自由飲水，保持室內(nèi)通風(fēng)良好，光照時間為8∶00～20∶00，溫度為18～28℃，濕度為40%～70%。

1.2 試藥與儀器 1）試藥。金剛藤顆粒購于廣西潤達(dá)制藥股份有限公司，批號Z20030062；十二烷基硫酸鈉（SDS）、蛋白酶抑制劑、RIPA裂解液購于北京索萊寶科技有限公司；4%多聚甲醛、DEPC水購于江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司；IL-1β，IL-18 ELISA試劑盒購于北京全式金生物有限公司；Anti-NLRP3、Anti-IL-1β、Anti-Caspase-1、Anti-ASC、Anti-β-Actin購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）購于上海容創(chuàng)生物科技有限公司；蘇木素、伊紅染液購于美國Sigma公司；BCA試劑盒購于上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于美國Genecopoeia公司。2）儀器。低溫離心機(jī)購于德國Heraeus公司；尼康SMZ745光學(xué)顯微鏡購于上海普赫生物科技有限公司；微量移液槍、離心機(jī)、勻漿機(jī)、酶標(biāo)儀購于德國Eppendorf，GIS-500凝膠成像儀購于Miulab公司；超低溫冰箱購于日本Sanyo公司；電泳儀購于賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.3 模型制備 取15只大鼠作為對照組，不進(jìn)行模型制備，其余90只大鼠制備APID模型［6］，50 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，腹部剃毛、常規(guī)消毒，腹部正中切口3 cm，使用眼科手術(shù)器械打開腹腔，暴露子宮，4號頭皮針在子宮分叉處右側(cè)朝卵巢方向進(jìn)針，緩慢勻速注入25%苯酚膠漿0.05 mL，對側(cè)子宮不注射作自身對照，注射完畢后，分層關(guān)腹，消毒，消毒紗布覆蓋。APID模型制備過程中未出現(xiàn)大鼠死亡情況。保留15只大鼠只進(jìn)行開腹和關(guān)腹手術(shù)，不注射苯酚膠漿為假手術(shù)組。

1.4 分組與干預(yù) APID大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組及金剛藤顆粒低、中、高劑量組（分別含原生藥8.1 g/kg、40.5 g/kg、81.0 g/kg），陽性對照組（羅紅霉素82.74 mg/kg），每組均15只。分組后對照組、假手術(shù)組、模型組灌胃生理鹽水100 mL/kg，金剛藤顆粒溶解后灌胃治療，每日1次，連續(xù)15 d。實驗期間常規(guī)監(jiān)測動物的精神狀態(tài)、體質(zhì)量。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 灌胃15 d后，次日清晨處死大鼠，打開腹腔，腹主動脈采血，取血3 mL，室溫避光靜置30 min，3 000 r/min離心15 min，分離血清置于-20℃冰箱中保存待測。1）ELISA檢測大鼠血清IL-1β，IL-18水平。按照試劑盒說明書進(jìn)行。2）大鼠病理形態(tài)學(xué)觀察。打開腹腔，摘取雙側(cè)子宮，肉眼觀察子宮色澤、彈性、化膿及周圍組織是否粘連。觀察完畢后將大鼠部分子宮組織置于-80℃冰箱保存，部分組織于4%多聚甲醛溶液中固定，子宮組織切成5 μm的切片，蘇木精-伊紅（HE）進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察子宮組織的病理形態(tài)。3）實時定量PCR檢測NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平。取凍存的各組織標(biāo)本并按照Trizol試劑盒（Fermenas公司）說明書提取總RNA，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以其為模板進(jìn)行實時定量PCR檢測。反應(yīng)體系為25 mL：SYBR GreenⅠqPCR Master Mix 12 mL，上下游引物各1 mL，cDNA模板1 mL，ddH2O 10 mL。其中引物合成見表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；48 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)，并對所得數(shù)據(jù)Ct值進(jìn)行分析，以 GADPH 為內(nèi)參基因，采用 2-ΔΔCt算法計算NLRP3、ASC、IL-1、Caspase-1 mRNA的相對表達(dá)量。引物信息見表1。4）Western blotting檢測子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達(dá)水平：取出液氮中凍存的子宮組織剪切50～100 mg制備組織勻漿，蛋白裂解液反應(yīng)30 min，提取總蛋白；BCA試劑盒測定蛋白濃度，SDS變性蛋白；SDS-PAGE電泳跑膠，蛋白上樣量為20 μg，電泳結(jié)束后切除目的條帶凝膠，目的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，4℃進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)1 h，后用TBST清洗；5%脫脂奶封閉1 h，TBST洗3×5 min，一抗（NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1抗體，稀釋倍數(shù)1∶1 000）4℃過夜，TBST洗3×5 min；IgG二抗（稀釋倍數(shù)1∶5 000）室溫孵育1h，TBST洗3×5 min；ECL顯色液顯色，凝膠成像儀觀察蛋白表達(dá)情況，Image J進(jìn)行目的條帶的灰度光密度分析，以β-Actin為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，計量資料多組間對比采用單因素方差分析，兩兩對比采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 引物信息

2結(jié)果

2.1 各組大鼠子宮肉眼觀察的比較 對照組、假手術(shù)組大鼠行為、精神狀態(tài)、飲食均正常，大鼠子宮大小、顏色、形態(tài)正常，觸摸發(fā)現(xiàn)子宮硬度正常，漿膜面未見明顯腫脹出血；模型組大鼠子宮末端膨大，管腔擴(kuò)張迂曲，管壁變薄，管腔可見黃色膿液或者清涼液體，漿膜面明顯腫脹、充血，盆腔臟器粘連充血；金剛藤顆粒各組子宮腫脹、充血減輕，陽性對照組與金剛藤顆粒高劑量組無顯著差異。

2.2 各組大鼠子宮病理學(xué)比較 見圖1。HE染色結(jié)果顯示，對照組、假手術(shù)組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞脫落壞死，腔壁結(jié)構(gòu)紊亂，全層炎性細(xì)胞浸潤，有充血水腫，符合APID臨床病變。金剛藤顆粒治療組、陽性對照組較模型組有顯著改善，表明金剛藤顆粒對APID大鼠有良好的治療效果。

圖1 各組大鼠子宮病理學(xué)觀察（HE染色，10倍）

2.3 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較 見表2。ELISA檢測顯示，假手術(shù)組血清IL-1β、IL-18水平與對照組無顯著差異，模型組血清IL-1β、IL-18水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），金剛藤顆粒治療組、陽性對照組IL-1β、IL-18水平較模型組顯著降低（P＜0.05），且金剛藤高劑量組與陽性對照組無顯著差異，與假手術(shù)組無顯著差異（P＞0.05），表明金剛藤顆粒治療效果顯著。

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較（pg/mL，±s）

表2 各組大鼠血清IL-1β、IL-18水平比較（pg/mL，±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△P＜0.05；與模型組比較，◇P＜0.05；與金剛藤低劑量組比較，※P＜0.05；與金剛藤中劑量組比較，#P＜0.05。下同

組別對照組假手術(shù)組模型組金剛藤低劑量組金剛藤中劑量組金剛藤高劑量組陽性對照組n 15 15 15 15 15 15 15 IL-1β 16.23±4.02 16.41±3.98 8.26±9.55*△40.59±8.62*△◇30.18±7.22*△◇※19.13±6.16◇※#18.24±6.21◇※#IL-18 20.34±5.61 20.16±5.41 70.16±11.54*△53.16±9.64*△◇38.16±9.16*△◇※24.56±7.41◇※#23.21±7.26◇※#

2.4 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平比較 見表3。mRNA檢測顯示，假手術(shù)組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平與對照組無顯著差異，以下均在假手術(shù)組的基礎(chǔ)上進(jìn)行比較，模型組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），金剛藤顆粒治療組、陽性對照組各指標(biāo)水平較模型組顯著降低（P＜0.05），且金剛藤顆粒高劑量組與陽性對照組無顯著差異（P＞0.05）。

表3 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平比較（±s）

表3 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1 mRNA水平比較（±s）

組別對照組假手術(shù)組模型組金剛藤低劑量組金剛藤中劑量組金剛藤高劑量組陽性對照組n 15 15 15 15 15 15 15 NLRP3 1.03±0.04 1.01±0.05 5.26±0.52△4.59±0.32△◇3.18±0.22△◇1.23±0.12△◇1.18±0.08△◇ASC 1.04±0.03 1.06±0.02 4.46±0.54△3.16±0.37△◇2.38±0.26△◇1.16±0.14△◇1.11±0.09△◇IL-1β 0.97±0.02 0.99±0.01 6.11±0.48△4.39±0.42△◇2.38±0.20△◇1.10±0.16△◇1.08±0.13△◇Caspase-1 1.03±0.03 1.06±0.04 3.76±0.44△2.56±0.31△◇2.09±0.21△◇1.16±0.13△◇1.14±0.11△◇

2.5 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平比較 見圖2，表4。蛋白檢測顯示，假手術(shù)組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平與對照組無顯著差異，模型組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1水平顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），金剛藤顆粒治療組、陽性對照組各指標(biāo)水平較模型組顯著降低（P＜0.05）。

3討論

圖2 大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白檢測

表4 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平比較（±s）

表4 各組大鼠子宮組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白水平比較（±s）

組別對照組假手術(shù)組模型組金剛藤低劑量組金剛藤中劑量組金剛藤高劑量組陽性對照組n 15 15 15 15 15 15 15 NLRP3 0.23±0.04 0.25±0.05 0.84±0.05△0.57±0.03△◇0.39±0.04△◇0.33±0.05△◇0.31±0.07△◇ASC 0.34±0.03 0.26±0.03 0.91±0.04△0.76±0.05△◇0.58±0.04△◇0.46±0.05△◇0.41±0.04△◇IL-1β 0.17±0.02 0.19±0.05 0.81±0.03△0.69±0.04△◇0.60±0.05△◇0.51±0.07△◇0.46±0.03△◇Caspase-1 0.22±0.03 0.26±0.04 0.89±0.08△0.76±0.07△◇0.59±0.05△◇0.46±0.03△◇0.38±0.05△◇

近年來盆腔炎發(fā)病率逐年上升，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量及身心健康。盆腔炎的發(fā)生多因為產(chǎn)后感染、盆腔周圍炎癥擴(kuò)散等。APID多是由于致病微生物入侵生殖系統(tǒng)，引起生殖道及周圍組織的炎癥反應(yīng)［7］。APID治療前必須確定致病菌，再對癥下藥。目前治療APID常使用抗生素，青霉素可治療革蘭氏陽性菌、敏感性葡萄球菌等，但容易引起抗藥性；四環(huán)素主要針對衣原體、支原體感染［8］。雖然西醫(yī)治療效果良好，但易引起不良反應(yīng)及抗藥性，故本研究采用中藥治療APID大鼠，分析其治療效果及作用機(jī)制。

本研究采用灌注25%苯酚膠漿制備APID大鼠模型，造模15 d后處死大鼠肉眼觀察模型組大鼠子宮末端膨大，漿膜面明顯腫脹、充血，HE染色模型組大鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞脫落壞死，腔壁結(jié)構(gòu)紊亂，全層炎性細(xì)胞浸潤，有充血水腫，表明APID大鼠造模成功。以往研究表明APID容易引起大鼠炎性浸潤及內(nèi)膜充血水腫［9］，進(jìn)一步研究顯示血清IL-1β、IL-18水平顯著升高，表明大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

APID在中醫(yī)范疇屬于帶下痛經(jīng)，可通過降低炎癥感染的發(fā)生率來對癥治療［10］。金剛藤顆粒主要成分為金剛藤，其含有氨基酸、有機(jī)酸、皂基、生物堿等多種活性物質(zhì)，具有活血化瘀、清熱解毒之功效［11］。且金剛藤顆粒對革蘭氏陽性菌及革蘭氏陰性菌均具有較好的拮抗作用，可通過使用金剛藤顆粒起到抗感染的作用［12］。本研究顯示與模型組比較金剛藤顆粒治療組、陽性對照組大鼠子宮組織癥狀有一定改善，HE染色顯示子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)及炎癥細(xì)胞浸潤均得到改善，且IL-1β、IL-18水平降低，表明金剛藤顆粒能夠降低大鼠炎癥反應(yīng)。

病原菌入侵機(jī)體后可被機(jī)體免疫系統(tǒng)的模式識別受體（PRR）識別出來，引起機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起組織器官的免疫損傷［13］。NOD樣受體（NLR）是細(xì)胞內(nèi)重要的PRR，NLRP是NLR的一個亞家族，可活化組裝進(jìn)而形成炎癥小體，從而誘導(dǎo) IL-1β、IL-18等促炎因子的釋放［14］。炎癥小體由NLR、接頭蛋白ASC、效應(yīng)蛋白Caspase-1組成［15］。研究報道NLRP3炎癥小體可誘導(dǎo)無活性的IL-1β、IL-18的基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)炎癥因子的分泌；其還可通過NLRP3-ASC-Caspase-1炎癥小體誘導(dǎo)Caspase-1的活化，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β的活化［16-17］。研究報道，心肌損傷組織中NLRP3炎癥小體通路大量激活［18］。NLRP3炎癥小體在全身炎性反應(yīng)綜合征中參與肺組織損傷［19］。燙傷小鼠心肌組織中NLRP3炎癥小體通路大量激活，抑制NLRP3炎癥小體通路，可明顯減輕心肌損傷［20］。本研究中APID模型組NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1表達(dá)高于對照組，金剛藤顆粒治療后NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1顯著降低，表明NLRP3炎癥小體通路與APID損傷相關(guān)，金剛藤顆?？赡芡ㄟ^抑制NLRP3炎癥小體通路發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，金剛藤顆粒對APID大鼠炎癥損傷具有一定的保護(hù)作用，其可能通過NLRP3炎癥小體通路抑制炎癥反應(yīng)，本研究為APID的治療提供一定的理論參考，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。