基于氣道炎癥調(diào)控的全真一氣湯干預腎氣虛型哮喘大鼠的機制研究*

張 晶 陳志斌 王春娥 李大治

（福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種氣道慢性炎癥性疾患，常反復發(fā)作，遷延不愈，嚴重影響患者的身體健康。哮喘的這種慢性氣道炎癥性疾患會引起氣道炎性細胞浸潤、氣道高反應(yīng)性及氣道黏液黏蛋白分泌的變化。近年來的多項研究均證實水通道蛋白5（AQP5）與氣道炎性細胞浸潤、氣道高反應(yīng)性及氣道黏液黏蛋白分泌的變化有著密切的關(guān)系，影響到哮喘的發(fā)生［1-3］。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，全真一氣湯能改善腎氣虛型哮喘患者臨床癥狀，但機制尚不明確［4］。本實驗通過觀察全真一氣湯對腎氣虛型哮喘大鼠AQP5的影響，旨在探討其對炎癥的調(diào)節(jié)機制，為全真一氣湯治療腎氣虛型哮喘的臨床應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠39只，體質(zhì)量（200±20）g，浙江省實驗動物中心提供。許可證編號：SCXK（浙）2014-0001。恒溫，恒濕，自由飲水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 藥物與儀器 全真一氣湯原方［熟地黃15 g，白術(shù)6 g，麥冬15 g，淡附子6 g，人參15 g（生曬參），牛膝15 g，五味子6 g］，于福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院中藥房加工成生藥含量0.2 g/mL的溶液。卵蛋白（貨號GradeⅡ，A5253，美國Sigma公司），滅活百日咳桿菌疫苗（上海生物制品研究所有限責任公司，批號20011103，規(guī)格2mL/支），Rat IL-4 ELISA試劑盒（R&D Systems，R4000），Rat TNF-α ELISA試劑盒（R&D Systems，RTA00），Rat AQP5 ELISA試劑盒（cusabio，CSBE08258r），BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）（碧云天），其分析級化學試劑購自南京化學試劑廠。

1.3 分組與造模 大鼠置于福建中醫(yī)藥大學屏山校區(qū)動物房清潔級設(shè)施內(nèi)，標準顆粒飼料喂養(yǎng)，自動取食飲水，室溫20℃，自然光照，預適應(yīng)7 d。后采取隨機數(shù)字表法隨機分為5組，對照組7只，每日予以正常飼料和飲用水喂飼；模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，各8只，依以下方法造模：通過腹腔注射1 mg卵蛋白、10 mg氫氧化鋁凝膠、5×108個滅活百日咳桿菌疫苗混合成的1 mL溶液，超聲霧化吸入1%的卵清白蛋白30 min，激發(fā)哮喘，同時通過驚恐刺激及在水深50 cm、水溫20℃的水槽中游泳，完成腎氣虛型哮喘大鼠模型的制備［5-6］。大鼠食量減少，體質(zhì)量增幅減輕，拱背蜷臥，皮毛蓬松無光澤，活動量減少，行動遲緩，懸尾抵抗力減弱，游泳時間縮短，哮喘激發(fā)后出現(xiàn)喘息、呼吸困難、咳嗽，四肢抓撓口鼻、躁動、口唇發(fā)紺，聽診雙肺聞及哮鳴音可納入研究范圍。

1.4 干預方法 對照組、模型組大鼠依正常組動物飼養(yǎng)方法每日喂養(yǎng)，模型組并每日給予0.9%氯化鈉注射液3 mL經(jīng)口灌胃；各中藥組除每日予以正常飼料和飲用水喂飼外，開始給予藥物干預，給予全真一氣湯［人參15 g（生曬參），麥冬15 g，熟地黃15 g，淡附子6 g，白術(shù)6 g，牛膝15 g，五味子6 g］原方湯劑生藥量按體重換算為大鼠劑量。每日灌胃3 mL，并分為低劑量治療組（8.33 g/kg）、中劑量治療組（16.66 g/kg）和高劑量治療組（33.32 g/kg），共30 d。

1.5 標本采集與檢測 1）取材方法。至少2人同時處理1只大鼠，稱重后腹腔注入20%烏拉坦（1 g/kg）麻醉，將大鼠仰臥位固定，沿正中線剪開皮膚和腹壁肌肉，剪斷兩側(cè)肋骨和胸肌，暴露胸腔，后從喉頭以上剪斷氣管，將胸腔臟器一并取出，摘除心臟，分離肺臟，與此同時另一助手立于尾端，剪開腹腔，于腹主動脈取血8～10 mL。于右主支氣管處切取右肺30 mg肺組織。標本血液送福建中醫(yī)藥大學附屬第二人民醫(yī)院檢驗科檢查。2）ELISA試劑盒測定血清IL-4、TNF-α、AQP5水平。根據(jù)試劑盒說明書，稀釋標準品，制作標準曲線，將包被好的96孔板取出，加入標準品和樣本，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)2 h后，去除溶液。每孔加入100 μL生物素標記的抗體，貼上封口膜。置于37℃培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)1 h后，加入200 μL清洗緩沖液洗5次，每孔加入100 μL HRP標記的抗生物素蛋白，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)1 h后，加入200 μL清洗緩沖液洗5次，每次2 min。每孔加入90 μL TMB反應(yīng)底物，置于37℃培養(yǎng)箱中避光孵育。每孔加入90 μL終止緩沖液，輕輕混勻。在酶標儀上450 nm波長處，檢測吸光度。3）蛋白的提取和BCA蛋白濃度測定。切取30 mg組織，加入500 μL RIPA裂解液（每1 000 μL RIPA中加入10 μL PMSF，臨用時加入），冰上研磨至無明顯沉淀，冰上裂解30 min。裂解完后，將裂解液移至預冷的1.5 mL離心管中（冰上操作）。4℃下12 000 r/min離心5 min。將離心后的上清轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，放于-20℃保存。根據(jù)碧云天BCA測定試劑盒說明書操作進行蛋白的含量測定。4）SDS-PAGE電泳。測完蛋白含量后，計算含30 mg蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至0.5 mL離心管中，加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×SDS，于沸水中煮5 min使蛋白變性。濃縮膠層所用電壓60 V，30 min電泳，進行轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉TBST溶液封閉，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。將一抗用含5%BSA的TBST溶液按照1∶1 000稀釋于4℃孵育過夜。之后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min。將二抗用TBST按照1∶5 000稀釋，室溫下孵育2 h后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min；進行化學發(fā)光反應(yīng)。采用Thermo ECL進行化學發(fā)光，按照試劑盒說明書操作。于Tanon凝膠成像儀下拍照，獲取圖片。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，兩組比較用t檢驗；多組比較用方差分析，偏態(tài)分布用非參數(shù)檢驗，指標之間用Spearman等級相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清IL-4、TNF-α、AQP5水平比較 見表1。腎氣虛型哮喘大鼠血清IL-4、TNF-α的水平均較對照組明顯升高（P＜0.01），給予藥物作用后，血清TNF-α、IL-4水平下調(diào)，且隨藥物劑量增加下調(diào)明顯（P＜0.01）；相對于對照組，腎氣虛型哮喘大鼠血清AQP5水平明顯降低，給予藥物作用后，隨藥物劑量的增加，其水平增加明顯（P＜0.01）。

表1 各組大鼠血清中IL-4、TNF-α、AQP5水平比較（±s）

表1 各組大鼠血清中IL-4、TNF-α、AQP5水平比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與全真一氣湯低劑量組比較，▲P＜0.01；與全真一氣湯中劑量組比較，□□P＜0.01。下同

組別對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 7 8 8 8 8 IL-4（ng/mL）3.316±0.102 8.686±0.909*6.893±0.205*△5.617±0.178*△▲4.581±0.306*△▲□TNF-α（pg/mL）3.560±0.193 8.530±0.837*6.546±0.313*△5.189±0.629*△▲4.369±0.446*△▲□AQP5（ng/mL）798.611±73.833 252.446±18.436*341.026±26.432*△394.450±75.908*△▲547.539±15.827*△▲□

2.2 各組大鼠肺組織AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表達水平比較 見表2，圖1。腎氣虛型哮喘大鼠肺組織MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA的表達水平均較對照組明顯升高（P＜0.01），給予藥物作用后，肺組織MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表達水平下調(diào)，且隨藥物劑量增加下調(diào)明顯（P＜0.01）；相對于對照組，腎氣虛型哮喘大鼠肺組織AQP5 mRNA表達水平明顯降低，給予藥物作用后，隨藥物劑量的增加，其表達水平增加明顯（P＜0.01）。

表2 各組大鼠肺組織AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表達水平比較（±s）

組 別n AQP5（GAPDH）MUC5AC（GAPDH）OX-62（GAPDH）對照組模型組低劑量組中劑量組高劑量組7 8 8 8 8 1.023±0.154 0.520±0.070*0.690±0.780*△0.819±0.059*△▲0.992±0.095△▲□0.532±0.116 1.131±0.098*0.964±0.410*△0.805±0.495*△▲0.709±0.048*△▲□0.517±0.134 1.201±0.089*1.070±0.094*△0.892±0.113*△▲0.765±0.109*△▲□

圖1 各組大鼠肺組織AQP5 mRNA、MUC5AC mRNA、肺組織OX-62 mRNA表達電泳圖

3討論

支氣管哮喘由多種細胞、細胞組分及介質(zhì)參與，它們之間的相互作用導致氣道的慢性炎癥，進而出現(xiàn)氣道高反應(yīng)性，表現(xiàn)反復發(fā)作性的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，一般于夜間和（或）清晨發(fā)作、加劇。AQP5分布于I型肺泡上皮細胞，其基因或蛋白的表達降低是I型肺泡上皮細胞損傷的特異性標志［7］。在氣道高反應(yīng)過程中，AQP5出現(xiàn)表達下調(diào)的結(jié)果［8］。AQP5表達的降低同時也會促進哮喘的發(fā)生［9］。本實驗結(jié)果顯示：腎氣虛型哮喘大鼠血清AQP5及肺組織AQP5 mRNA表達降低，氣道炎癥指標血清IL-4、TNF-α水平及肺組織MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表達水平均升高，表明AQP5水平的降低與腎氣虛型哮喘大鼠氣道炎癥之間存在密切的關(guān)系。應(yīng)用了逐漸增加劑量的全真一氣湯以后，出現(xiàn)了兩方面的結(jié)果，一方面腎氣虛型哮喘大鼠血清AQP5及肺組織AQP5 mRNA表達均升高，且與劑量呈正相關(guān)；而另一方面血清IL-4、TNF-α水平及肺組織MUC5AC mRNA、OX-62 mRNA表達水平均降低，且與劑量呈負相關(guān)，說明腎氣虛嚴重程度與AQP5降低水平及哮喘氣道炎癥嚴重程度之間存在相關(guān)性，而應(yīng)用全真一氣湯則能提高AQP5水平，改善腎氣虛型哮喘大鼠的氣道炎癥。

支氣管哮喘亦即中醫(yī)所指的哮病、哮喘。中醫(yī)“哮喘”之名由元·朱丹溪首創(chuàng)，并闡明病機專主于痰。痰的產(chǎn)生與體內(nèi)津液代謝失常有關(guān)，《醫(yī)門法律》云“上氣而作水雞聲，乃是痰礙其氣”。哮病具有遺傳性，幼兒哮病往往由于先天稟賦不足所致，有稱“幼稚天哮”，腎為先天之本，《素問·逆調(diào)論》說“腎者水臟，主津液”。腎的生理功能之一便是主水液，腎中精氣的氣化功能對于體內(nèi)津液的輸布和排泄，維持體內(nèi)津液代謝的平衡起著極為重要的調(diào)節(jié)作用，腎氣由腎精所化，為臟腑之氣中最重要者，腎氣涵有陰陽兩種成分，其中腎陽為一身陽氣之本，“五臟之陽氣，非此不能發(fā)”，若腎陽虛衰，溫煦、推動功能減退，機體新陳代謝減緩，津液的化生和運行輸布障礙，痰飲內(nèi)生；腎陰為一身陰氣之源，“五臟之陰氣，非此不能滋”，若腎陰不足，涼潤功能減退，機體新陳代謝相對加快，也可影響津液的正?；瓦\行輸布，從而水濕內(nèi)生，久之便可形成哮病的“宿痰”內(nèi)伏于肺，復加致病因素引動發(fā)而為病，周而復始，反復發(fā)作。因此，哮病“宿痰”的產(chǎn)生與腎氣虛程度有密切的關(guān)系。AQP5作為單純的水通道蛋白，其只介導水分子跨膜轉(zhuǎn)運，結(jié)合實驗結(jié)果，考慮“痰”的產(chǎn)生與AQP5的低表達之間存在密切的關(guān)系，同時也會加重腎氣虛型哮喘大鼠的氣道炎癥。因此提出腎氣虛型哮喘大鼠腎氣不足時，AQP5表達降低，肺水的通道不暢，肺水淤積于肺，則“宿痰”產(chǎn)生，氣道炎癥加重，促使哮喘的發(fā)生、發(fā)展。腎氣不足改善后，AQP5表達增加，肺水通道順暢，水分子正常通過，伏痰減少，氣道炎癥減輕，則哮喘癥狀改善。因此“補腎虛”便在腎氣虛型哮病大鼠的治療中發(fā)揮著重要的作用。全真一氣湯由熟地黃、白術(shù)、麥門冬、附子、人參、牛膝、五味子組成，為明清醫(yī)學大家馮兆張《馮氏錦囊秘錄》中的經(jīng)典方劑［10］。方中熟地黃、白術(shù)皆性甘，偏溫，分補腎與脾，用養(yǎng)陰生津的麥冬俾土生金，以滋脾肺；附子溫腎助陽，人參大補氣陰；牛膝兼具補腎下行之功，五味子斂肺補腎，兩者同用，更得納氣藏源?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，全真一氣湯所含附子等藥皆可以治療及改善支氣管哮喘的癥狀［11-18］。

綜上所述，腎氣虛型哮喘大鼠的氣道炎癥與AQP5低表達之間存在密切關(guān)系，全真一氣湯可以改善腎氣虛型哮喘大鼠的氣道炎癥，其機制考慮與提高AQP5表達的水平有關(guān)。