金銀花提取物對(duì)重癥急性胰腺炎肺損傷大鼠ROS-NLRP3炎癥小體信號(hào)通路的影響*

阮輝輝 衛(wèi) 巍 許永富

（上海市第十人民醫(yī)院，上海 201106）

急性胰腺炎屬于腹部急性炎癥反應(yīng)疾病，而重癥急性胰腺炎（SAP）病情嚴(yán)重，致死率高，不僅表現(xiàn)為胰腺缺血、壞死，且合并全身多出器官損傷，其中肺損傷為SAP常見的并發(fā)癥，是導(dǎo)致SAP患者死亡的重要的原因［1］。有資料顯示，核苷酸結(jié)合域樣受體蛋白3（NLRP3）炎性小體通路在受到ROS激活后促進(jìn)炎性反應(yīng)，加重組織損傷，進(jìn)而而參與肺損傷的發(fā)病機(jī)制［2］，推測ROS-NLRP3炎性體通路可能在SAP肺損傷中發(fā)揮重要作用。金銀花屬于忍冬科植物，具有廣泛的藥理作用，如清熱解毒、抗鹽、抗氧化、抗腫瘤、降壓等，為多種中藥制劑的主要成分，對(duì)肺部炎癥疾病具有一定的治療效果［3-4］，然而在SAP合并肺損傷中的作用，目前尚不清楚。本研究采用自制金銀花水提取液（HFE）對(duì)SAP肺損傷大鼠進(jìn)行治療，探究其對(duì)SAP大鼠肺組織的改善，探討可能機(jī)制，以期為疾病的治療提供一定的參考?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SPF級(jí)成年SD大鼠，8周齡，雄性，體質(zhì)量220～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)為SYXK（京）2017-0033，所有大鼠均置于統(tǒng)一環(huán)境飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為23～25℃，濕度為50%～60%，嚴(yán)格遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》進(jìn)行飼養(yǎng)。本研究經(jīng)本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，審批號(hào)：IACUC20170328。

1.2 試藥與儀器 金銀花購于張仲景大藥房，置于50℃烘箱中烘干2 h，于研磨機(jī)中研磨成粉，稱取100 g，于1 L 50%乙醇中浸泡24 h，過濾后濾渣添加1 L 50%乙醇60℃浸泡3 h，收集濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中（65℃）濃縮，添加蒸餾水定容至100 mL，即為原藥液，濃度為1 g/mL；地塞米松購于廣西萬德藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)170314；?；悄懰徕c（貨號(hào)145-42-6）購于上海紫一試劑廠；HE染色試劑盒（貨號(hào)C0105）購于碧云天生物技術(shù)研究所；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（貨號(hào)hz-0011c）、白介素-18（IL-18）（貨號(hào)h-0253c）檢測試劑盒購于上海滬震實(shí)業(yè)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）（貨號(hào)A001-3）、丙二醛（MDA）（貨號(hào)A003-1）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；鼠抗NLRP3（貨號(hào)15101）購于美國CST公司；凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）（貨號(hào)AF3805-SP）、半胱天冬酶（Caspase-1）（貨號(hào)MAB601-SP）、IL-1β（AF6215-SP）抗體購于美國R&D公司；HRP標(biāo)記IgG二抗（貨號(hào)sc-51642）購于美國SantaCruz公司；80I顯微鏡購于日本Nikon公司。

1.3 分組與造模 參照文獻(xiàn)制備SAP大鼠［5］，隨機(jī)挑選80只大鼠，禁食不禁水12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1 mL/kg）充分麻醉大鼠，于腹正中切開，暴露十二指腸，區(qū)分胰膽管以及肝門部膽管，于近肝門端、近腸端胰膽管用動(dòng)脈夾夾閉，用注射器針頭穿刺胰管，緩慢推注5%?；悄懰徕c溶液，注射量為1.5 mL/kg，注射速率為0.2 mL/kg，10 min后，除去動(dòng)脈夾，當(dāng)胰腺組織出現(xiàn)水腫并伴有出血［6］，表明SAP模型制備成功，隨后退出針頭，按摩穿刺孔，用封閉膠將穿刺孔封閉后，復(fù)位腸管逐層關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠（16只）僅翻動(dòng)腸管。造模后將大鼠分為模型組及HFE低、中、高劑量組、地塞米松組，每組16只大鼠。

1.4 給藥方法 金銀花提取物組：造模后尾靜脈注射金銀花提取液，參考文獻(xiàn)［7］注射劑量分別為40、80、120 mg/kg；地塞米松組：造模后尾靜脈注射地塞米松溶液，參考文獻(xiàn)［7］注射劑量為0.5 mg/kg。假手術(shù)組、模型組尾靜脈注射等量0.9%氯化鈉注射液；各組大鼠均連續(xù)給藥4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）樣本收集。末次給藥后各組選取6只大鼠麻醉后，迅速于左肺進(jìn)行支氣管肺泡灌洗，收集支氣管肺泡灌洗液（BALF），重復(fù)3次，置于-20℃保存。采集各組剩余大鼠腹主動(dòng)脈血2 mL，離心后于-20℃保存上清；處死大鼠獲得左肺葉組織、胰腺組織，進(jìn)行組織濕/干質(zhì)量比分析，隨后一部分肺組織置于4%多聚甲醛中固定，一部分凍存-80℃。胰腺、肺組織濕重、干重測定。2）組織形態(tài)學(xué)檢測。常規(guī)制備4 μm胰腺、肺組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、脫水后，采用HE染色試劑盒對(duì)切片進(jìn)行染色，于顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化，參考Schimidit半定量評(píng)分系統(tǒng)對(duì)胰腺組織病理學(xué)情況進(jìn)行評(píng)定打分［9］。3）動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)檢測。利用全自動(dòng)血?dú)夥治鰴z測儀對(duì)腹動(dòng)脈血中氧分壓、二氧化碳分壓進(jìn)行檢測。4）BALF中炎性細(xì)胞及因子水平檢測。參考試劑盒檢測說明書進(jìn)行操作。采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)BALF沉淀細(xì)胞中總細(xì)胞數(shù)量和多形核白細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)檢測。5）肺組織中SOD、MDA、ROS水平。具體參照SOD、MDA檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)文獻(xiàn)中二氫乙啶（DHE）法檢測肺組織中的ROS相對(duì)水平，在熒光顯微鏡下分析氧化的DHE活性［11］。6）免疫印跡法檢測肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達(dá)。7）大鼠生存狀態(tài)評(píng)估。參考Zealongals標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組大鼠生存狀態(tài)進(jìn)行評(píng)定并打分［8］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（）描述，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩對(duì)比采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 各組大鼠生存情況比較 見表1。與假手術(shù)組相比，模型組生存狀況評(píng)分顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各組以及地塞米松組生存狀況評(píng)分均顯著升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。各組大鼠死亡率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠生存情況比較

2.2 各組大鼠胰腺、肺組織形態(tài)學(xué)情況比較 見圖1～圖2，表2。椵手術(shù)組胰腺組織、細(xì)胞形態(tài)正常；模型組胰腺組織中細(xì)胞發(fā)生變性和收縮、空泡樣改變，同時(shí)伴有炎性細(xì)胞浸潤（黑色箭頭）。HFE各劑量組以及地塞米松組細(xì)胞變性、腫脹減少、空泡變小，胰腺組織逐漸恢復(fù)。假手術(shù)組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺組織為發(fā)生水腫、炎性細(xì)胞浸潤；模型組肺泡壁增厚、肺間質(zhì)水腫、間隔變寬，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤。HFE各劑量組以及地塞米松組肺組織得到明顯改善，且隨著給藥濃度的升高，肺組織逐漸恢復(fù)正常。與假手術(shù)組相比，模型組胰腺、肺組織病理評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各劑量組以及地塞米松組胰腺、肺組織病理評(píng)分均顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

圖1 胰腺組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色，100倍）

圖2 肺組織形態(tài)學(xué)變化（HE染色，100倍）

表2 各組大鼠胰腺組織、肺組織病理評(píng)分比較（分，±s）

表2 各組大鼠胰腺組織、肺組織病理評(píng)分比較（分，±s）

組別假手術(shù)組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組n 10 10 10 10 10 10肺組織病理評(píng)分0.38±0.06 3.51±0.16*2.74±0.25*△2.16±0.36*△1.08±0.28*△0.94±0.19*△胰腺組織病理評(píng)分0.57±0.15 7.28±0.65*6.17±0.53*△4.25±0.49*△2.14±0.34*△1.94±0.28*△

表3 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)鈮?、組織干濕重比較（±s）

表3 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)鈮?、組織干濕重比較（±s）

組 別n 血氧分壓（mmHg） 二氧化碳分壓（mmHg） 胰腺組織（W/D） 肺組織（W/D）假手術(shù)組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組10 10 10 10 10 10 95.64±2.63 56.42±3.47*66.24±2.62*△70.82±2.48*△76.49±2.69*△78.16±2.71*△32.67±3.62 58.66±4.35*47.45±3.71*△42.17±3.59*△39.64±3.68*△38.65±3.14*△2.38±0.39 4.57±0.43*3.49±0.36*△3.13±0.48*△2.87±0.37*△2.75±0.32*△2.65±0.29 4.84±0.31*4.17±0.24*△3.94±0.28*△3.43±0.20*△3.37±0.24*△

2.3 各組大鼠動(dòng)脈血?dú)鈮骸⒔M織干濕重比較 見表3。與假手術(shù)組相比，模型組二氧化碳分壓、胰腺、肺組織W/D顯著升高，血氧分壓顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各劑量組以及地塞米松組二氧化碳分壓、胰腺、肺組織W/D顯著降低，血氧分壓顯著升高，呈劑量依賴性（P＜0.05）。2.4 各組大鼠BALF中炎性因子比較 見表4。與假手術(shù)組比較，模型組BALF中IL-1β、IL-18、總細(xì)胞數(shù)量、多形核白細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，HFE各劑量組以及地塞米松組BALF中IL-1β、IL-18、總細(xì)胞數(shù)量、多形核白細(xì)胞數(shù)量顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表4 各組大鼠BALF中炎性因子水平比較（±s）

表4 各組大鼠BALF中炎性因子水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組n 6 6 6 6 6 6 IL-1β（pg/mL）28.03±2.05 175.74±22.46 136.25±17.34 103.53±14.59 87.39±11.65 79.16±8.71 IL-18（pg/mL）22.34±3.11 219.28±30.65 172.47±18.32 143.62±25.44 128.56±19.07 115.65±3.14總細(xì)胞數(shù)量（×105）1.01±0.01 14.59±2.69 8.34±1.23 7.05±1.41 6.57±1.17 6.25±0.32多形核白細(xì)胞數(shù)量（×105）0.06±0.01 12.35±2.16 7.73±1.53 6.26±2.11 5.96±1.68 5.37±0.24

2.5 各組肺組織SOD、MDA水平比較 見表5。與假手術(shù)組比較，模型組肺組織SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，HFE各劑量組以及地塞米松組肺組織SOD水平顯著升高，MDA水平顯著降低，呈劑量依賴性（P＜0.05）。

表5 各組大鼠肺組織SOD、MDA水平比較（±s）

表5 各組大鼠肺組織SOD、MDA水平比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組n 10 10 10 10 10 10 SOD（U/mg）37.95±2.18 20.27±1.29*25.81±1.17*△28.56±1.19*△29.18±1.55*△29.79±1.64*△MDA（μmol/g）133.27±13.66 200.75±16.38*181.69±15.44*△166.33±13.85*△152.49±14.79*△148.63±16.49*△

2.6 各組大鼠肺組織中ROS、NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1水平比較 見表6，圖3。各組大鼠肺組織ROS水平比較：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織中ROS顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各劑量組以及地塞米松組肺組織中ROS顯著降低（P＜0.05）。各組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1表達(dá)情況：與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，HFE各劑量組以及地塞米松組肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

表6 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白及ROS表達(dá)量比較（±s）

表6 各組大鼠肺組織NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白及ROS表達(dá)量比較（±s）

組別假手術(shù)組模型組HFE低劑量組HFE中劑量組HFE高劑量組地塞米松組n 10 10 10 10 10 10 NLRP3 0.17±0.06 1.26±0.16*1.02±0.14*△0.92±0.12*△0.76±0.08*△0.62±0.03*△ASC 0.19±0.02 0.94±0.11*0.81±0.11*△0.68±0.08*△0.42±0.05*△0.39±0.04*△IL-1β 0.22±0.03 0.85±0.09*0.72±0.07*△0.68±0.08*△0.58±0.06*△0.42±0.03*△Caspase-1 0.26±0.05 0.88±0.06*0.57±0.07*△0.41±0.09*△0.36±0.07*△0.32±0.05*△ROS 1.00 4.62±0.57*3.71±0.63*△2.67±0.49*△2.14±0.61*△2.06±0.53*△

圖3 免疫印跡法檢測肺組織中NLRP3、ASC、IL-1β、Caspase-1蛋白表達(dá)

3討 論

本研究采用逆行膽管注射?；悄懰徕c制備SAP模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組胰腺組織中細(xì)胞發(fā)生變性和收縮、空泡樣改變，胰腺泡破壞，同時(shí)伴有炎性細(xì)胞浸潤，胰腺W/D比值增大，表明胰腺水腫，與臨床水腫型胰腺炎病理特征相似［12］，提示SP大鼠制備成功。進(jìn)一步對(duì)肺部檢測發(fā)現(xiàn)肺泡壁增厚、肺間質(zhì)水腫、間隔變寬，伴隨大量炎性細(xì)胞浸潤，肺W/D比值、大鼠動(dòng)脈血二氧化碳分壓升高，氧分壓降低，大鼠肺BLAF中總細(xì)胞數(shù)和多形核白細(xì)胞數(shù)量顯著升高，表明SAP不僅引起大鼠胰腺組織損傷，且可誘發(fā)大鼠肺水腫及組織損傷，提示SAP肺損傷模型制備成功。

藥理研究顯示金銀花具有抗病毒、解熱、抗內(nèi)毒素、抑菌、抗炎等功效，對(duì)肺炎具有一等的治療作用［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)與模型組相比，HFE各劑量組胰腺組織、肺組織病理學(xué)評(píng)分均顯著降低，胰腺、肺W/D比值降低，氧分壓升高，二氧化碳分壓降低，大鼠肺BLAF中總細(xì)胞數(shù)和多形核白細(xì)胞數(shù)量顯著，呈劑量依賴性，其高劑量組與Dex組效果相似，提示HFE能夠改善SAP引發(fā)的肺組織損傷，降低組織炎性反應(yīng)，然而具體機(jī)制目前尚不清楚。

肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-18、IL-1β等促炎性細(xì)胞因子，引發(fā)肺部炎癥反應(yīng)［15］。肺損傷大鼠研究中發(fā)現(xiàn)，給予IL-1β抗體治療可顯著降低炎癥反應(yīng)，緩解肺損傷［16］。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β炎性細(xì)胞因子上調(diào)可促進(jìn)肺組織中性粒細(xì)胞浸潤，加重炎癥損傷［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠BALF中IL-18、IL-1β、總細(xì)胞數(shù)、多形核白細(xì)胞數(shù)量顯著升高，提示SAP大鼠肺組織炎性損傷；給予金銀花提取液干預(yù)后IL-18、IL-1β、總細(xì)胞數(shù)和多形核白細(xì)胞數(shù)量降低，提示HFE可能通過抑制肺組織炎性細(xì)胞浸潤，降低炎癥因子水平從而緩解肺組織損傷。

氧化應(yīng)激反應(yīng)為肺損傷的重要病理機(jī)制，急性胰腺炎相關(guān)性肺損傷動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)小鼠肺組織中氧化應(yīng)激水平較高，同時(shí)伴有炎性細(xì)胞浸潤［18］。此外肺損傷后組織中SOD抗氧化因子水平異常導(dǎo)致氧自由基、MDA水平升高，造成氧化應(yīng)激反應(yīng)升高損傷肺組織［19］。本研究發(fā)現(xiàn)模型組肺組織中SOD水平降低，MDA水平升高，給予HFE干預(yù)后SOD水平升高，SOD水平降低，提示HFE可能通過抑制肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)減輕肺組織損傷。

近來研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體參與肺損傷的發(fā)生發(fā)展［20］。NLRP3為NLRP3炎性小體通路的核心蛋白，研究顯示在多種外源性和內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)刺激下激活NALP3炎性小體，可改變NALP3結(jié)構(gòu)，ATP作用下形成NALP3蛋白復(fù)合體，促進(jìn)ASC、Caspase-1集合，激活pro-Caspase-1向Caspase-1分裂，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β成熟并分泌細(xì)胞外引發(fā)炎癥反應(yīng)［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，HFE能夠抑制大鼠肺組織中NLRP3、Caspase-1、ASC、Caspase-1、IL-1β的表達(dá)，推測HFE可能是通過抑制肺組織NLRP3炎癥小體活化，進(jìn)而抑制Caspase-1的成熟、IL-1β分泌，發(fā)揮抗炎作用，進(jìn)而改善肺組織損傷。肺組織中ROS等激活劑的產(chǎn)生可激活NLRP3炎癥小體，因此ROS常作為NLRP3炎癥小體激活劑調(diào)節(jié)NLRP3的表達(dá)［23］。本研究中Model大鼠肺組織中ROS水平顯著升高，給予HFE干預(yù)后，ROS水平降低，結(jié)合過往研究推測，HFE可能通過抑制肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而抑制NLRP3炎癥小體的活化。

綜上所述，HFE對(duì)SAP大鼠肺損傷具有保護(hù)作用，且這種作用可能通過抑制ROS產(chǎn)生，進(jìn)而抑制NLRP3炎癥通路介導(dǎo)的促炎因子IL-1β和IL-18的分泌，緩解肺組織炎癥損傷。然而HFE僅能緩解大鼠肺組織損傷，并不能逆轉(zhuǎn)肺組織損傷，可能與藥物劑量有關(guān)，也有可能與SAP肺損傷其他作用機(jī)制有關(guān)，這還有待后續(xù)深入研究。