多成分含量測定結合高效液相色譜指紋圖譜評價不同產地大青葉藥材質量

李 媛，張苗苗，張 鑫，張 楠，謝志民

（陜西省西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054）

大青葉為十字花科植物菘藍 Isatis indigotica Fort.的干燥葉，產于河北、江蘇、浙江、安徽、河南、湖北、甘肅等地，性味苦寒，歸心經(jīng)、胃經(jīng)，具有清熱解毒、涼血消斑的功效[1]，以及抗病毒[2]、抗內毒素[3]和抑菌[4]等活性，臨床用于各種病毒性流行性感冒、乙型腦炎、單純皰疹病毒性角膜炎、流行性腮腺炎和病毒性肝炎等傳染性疾病的治療[5]。大青葉化學成分以生物堿類為主，包括靛藍、靛玉紅等吲哚類和4（3H）喹唑酮、4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、色胺酮等喹唑酮類生物堿，此外還含有丁香酸、水楊酸等有機酸類[6]。采用單一指標性成分的含量進行中藥材質量控制存在一定缺陷[7-10]。指紋圖譜能全面表征藥材內在的化學成分種類和數(shù)量，可綜合反映和有效控制藥材整體質量[11-12]。借助色譜技術，可得到其化學成分的色譜圖，具有特征強、信息量大和整體性強的特點，已成為國際公認的控制中藥或天然藥材質量的有效手段[13-14]。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法同時測定大青葉中4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍和靛玉紅6種有效成分，并建立大青葉的指紋圖譜，能有效評價和控制藥材質量，可為完善大青葉質量標準提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；BT25S型，BT124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；磷酸（優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）；娃哈哈純凈水；4-羥基喹唑啉（批號為 A83DC-NR，含量 ＞98.0%）和2，4-羥基喹唑啉（批號為 I8ZKG-TO，含量 ＞98.0%）均由梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司提供；丁香酸（Sigma-Aldrich，批號為 BCBS3754V，含量≥98.0% ），色胺酮（Toronto research chemicals INC，批號為T947000，含量為 98.0% ），靛藍（批號為 110716-200610），靛玉紅（批號為0717-200003），均由中國食品藥品檢定研究院提供；10批大青葉藥材分別購自甘肅（S2，S10）、安徽（S1，S4，S6-S9，）、河北（S3）、江蘇（S5），經(jīng)西安市食品藥品檢驗所中藥室謝志民主任藥師鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Shim-pack GIST C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃ ；檢測波長：(0～29 min)225 nm，(29～85 min)254 nm；分析時間：85 min；進樣量：10 μL；流動相：甲醇（A） -0.1% 磷酸溶液（B），梯度洗脫條件見表 1；流速：1.0 mL ／min。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫條件

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

取 4-羥基喹唑啉 10.32 mg，2，4-羥基喹唑啉5.20 mg，丁香酸 8.60 mg，精密稱定，置同一 10 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液Ⅰ；分別取色胺酮 5.02 mg，靛藍 5.31 mg，靛玉紅 15.0 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，然后精密量取上述對照品貯備液Ⅰ1 mL，加氯仿10 mL超聲溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品貯備液Ⅱ。其中，4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍和靛玉紅質量濃度分別為 41.28，20.80，34.40，200.80，212.40，600 μg ／mL。取大青葉粉末約 3 g，精密稱定，置平底燒瓶中，加入50 mL氯仿，搖勻，稱定質量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質量，加氯仿補足減失的質量，搖勻，濾過，濾液濃縮至盡干，用甲醇-氯仿（8∶2）轉移定容至10 mL容量瓶，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：精密量取對照品貯備液Ⅱ0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 mL，置 25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度。按擬訂色譜條件進樣，以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果見表2。

表2 各成分回歸方程與線性范圍(n＝5)

精密度試驗：按擬訂色譜條件，精密量取對照品溶液 10 μL，連續(xù)進樣 6次，測定峰面積。結果 4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍和靛玉紅峰面積的 RSD分別為 0.64%，0.67%，0.65%，0.58%，0.66%，0.32%(n ＝ 6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品S3粉末3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下分別于 0，2，4，8，12，24 h時測定峰面積。結果4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍和靛玉紅峰面積的 RSD分別為1.52% ，1.64% ，1.72% ，0.92% ，0.87% ，0.53%(n＝6)，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批樣品S3粉末，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍和靛玉紅含量的 RSD 分別為 1.81% ，1.62% ，1.43% ，0.76% ，0.65%，0.48%(n ＝ 6)，表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品S3粉末1.5 g，精密稱定，共6份，每份加入相同量（為已知含量的100%）的4-羥基喹唑啉、2，4-羥基喹唑啉、丁香酸、色胺酮、靛藍和靛玉紅對照品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，計算加樣回收率。結果見表3。

表3 各成分加樣回收試驗結果（n＝6）

2.1.4 樣品含量測定

分別取10批大青葉粉末各3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，計算含量。結果見表4。

2.2 聚類分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件，對10批大青葉藥材中6種成分含量進行系統(tǒng)聚類，采用組間聯(lián)接法，平方歐式距離為區(qū)間，得到10批藥材的聚類分析圖，詳見圖2。不同產地大青葉藥材含量差異較大，同一類含量差異較小。

表4 樣品各成分含量測定結果（ g／g）

圖2 10批大青葉藥材系統(tǒng)聚類分析

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 色譜條件

同 2.1.1項下色譜條件。

2.3.2 方法學考察

精密度試驗：取同一批樣品S3粉末，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，以4號峰（色胺酮）的保留時間和峰面積為參照。結果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的 RSD分別在0.35%和0.94%以內(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣S3粉末3 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于 0，2，4，8，12，24 h時測定峰面積。結果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的 RSD分別在 0.46%和 1.73%以內(n＝6)，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定。

重復性試驗：取同一批樣品S3粉末，精密稱定，共6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的 RSD分別在0.62%和2.91%以內(n＝6)，表明方法重復性良好。

2.3.3 不同產地大青葉指紋圖譜建立

分別精密稱取10批大青葉樣品粉末，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定，得10批樣品圖譜。采用中國藥典委員會推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版軟件分析，以中位數(shù)法生成對照圖譜，時間窗寬度為0.5 min，根據(jù)匹配結果確定了大青葉共有峰為15個。由于4號峰（色胺酮）較穩(wěn)定，且與鄰近峰基本可達到基線分離，因此選擇此峰作為參照峰。10批大青葉的指紋圖譜與對照圖譜的相似度均在0.90以上。結果見圖3及表5。

圖3 10批大青葉的指紋圖譜

表5 10批樣品相似度結果

3 討論

考察了超聲提取、加熱回流提取2種方法對各成分的影響，結果采用加熱回流得到色譜峰個數(shù)和峰面積均較多，故選擇此方法提??；又采用了甲醇、甲醇-氯仿不同比例、二氯甲烷、氯仿等不同溶劑進行加熱回流提取，結果采用氯仿提取得到的各成分含量均較高，故確定為氯仿加熱回流提取。

考察了甲醇 -水、乙腈-水、甲醇 -0.1%磷酸溶液，最終確定甲醇-0.1%磷酸溶液及文中梯度洗脫方法，色譜圖中各成分分離效果最佳。4-羥基喹唑啉最大吸收波長為225 nm，靛藍和靛玉紅2015年版《中國藥典(一部)》方法波長為 606 nm和 289 nm[15]，為兼顧各成分的響應值，故采用變換波長的方法。

10批大青葉靛玉紅的含量均高于0.020%，質量符合2015年版《中國藥典(一部)》規(guī)定。但其他成分的含量差異較大，尤其是4-羥基喹唑啉和2，4-羥基喹唑啉。不同產地大青葉各成分含量差異較大，4個產地的吲哚類生物堿含量相當，而甘肅和河北產地的喹唑酮類生物堿含量相對較高，表明其地域影響明顯。同一產地的大青葉各成分含量也有差異，而已有文獻表明不同采收期會引起大青葉中靛玉紅含量差異明顯，頭刀葉含量大于二刀葉[16]，表明不同采收時間對大青葉中6種成分含量影響也較大，故使用和評價大青葉的質量時應考慮其產地和采收期的影響。

相似度考察結果表明，10批大青葉HPLC指紋圖譜相似度較高，均超過0.9，說明藥材成分構成基本一致，藥材質量穩(wěn)定；聚類分析結果將10批大青葉藥材聚為4類，說明不同產地的同種藥材之間存在一定差異。

HPLC法測定大青葉中6種成分的含量，以及建立指紋圖譜和聚類分析相結合的方法，不同于2015年版《中國藥典(一部)》方法的單成分指標控制，能更全面、準確地判別藥材的優(yōu)劣，可有效用于大青葉藥材的質量控制與鑒定。