表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯明膠納米粒的制備及體外透皮性質(zhì)研究

宋 娟 于緒東 王 棟

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)是綠茶提取物茶多酚的主要活性成分，約占兒茶素含量的80%[1]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗腫瘤、抗菌抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化及降壓降糖等[2-4]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究證實(shí)EGCG能夠有效的治療白癜風(fēng)、痤瘡、銀屑病、帶狀皰疹等，在皮膚科應(yīng)用中獲得了廣泛的青睞[5-7]。然而，EGCG為強(qiáng)的水溶性藥物，制成普通經(jīng)皮給藥制劑其滲透率較低，且EGCG極易在光照、高溫、堿性等條件下發(fā)生氧化、聚合、縮合等變化，導(dǎo)致其分解快速，穩(wěn)定性較差，進(jìn)一步限制了其在皮膚科領(lǐng)域中的應(yīng)用。

明膠納米粒是以明膠為基質(zhì)的納米級(jí)微粒。明膠是一種天然的高分子材料，具有安全無(wú)毒、生物相容性好、可生物降解的特點(diǎn)，此外，明膠還廣泛應(yīng)用于皮膚病的治療，如皮膚皸裂、皮膚瘙癢、魚(yú)鱗病等[8,9]。而納米粒載體系統(tǒng)又以其獨(dú)特的皮膚靶向性、緩控釋性和保護(hù)藥物的作用，為明膠納米粒在皮膚病領(lǐng)域的應(yīng)用展開(kāi)了廣闊的前景[10]。因此，本文將EGCG包載于明膠納米粒中制備了EGCG-明膠納米粒(EGCG-N)，并對(duì)EGCG-N的制劑學(xué)性質(zhì)及體外透皮性質(zhì)進(jìn)行考察。

1 材料

1.1 儀器 Thermo Fisher高效液相色譜儀(UltiMate3000泵、UltiMate3000檢測(cè)器、Chromeleon Console色譜工作站，美國(guó)Thermo Fisher公司)；JEM-1200EX 電子透射電鏡(日本JEOL公司)；BS110S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；TK-12A型 Franz 擴(kuò)散池(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)；LP 220S型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；Nano ZS90粒度儀(英國(guó)Malvern 公司)；DF-101S集熱式磁力加熱攪拌器(中國(guó)金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.2 試藥 EGCG(杭州禾田生物科技有限公司，純度為98%)；明膠(克拉瑪爾試劑有限公司，Type B)；甲醇為色譜純；其他藥品、試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 EGCG-N的制備 將明膠與EGCG分別溶于純化水中(明膠與EGCG的質(zhì)量比為2∶1)，37℃保溫條件下將EGCG逐漸加至上述明膠水溶液中，攪拌10 min，即得EGCG-N。

2.2 EGCG-N質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 EGCG-N的形態(tài) 采用透射電子顯微鏡(TEM)磷鎢酸負(fù)染法觀察所制備的EGCG-N的形態(tài)。取EGCG-N適量，用水稀釋10倍，用覆有碳膜的銅網(wǎng)沾取少量的樣品溶液，用濾紙吸取多余樣品，然后用2%的磷鎢酸溶液負(fù)染2 min，染色后的銅網(wǎng)自然晾干，置于TEM下，觀察EGCG-N的形態(tài)。

2.2.2 EGCG-N的粒徑及Zeta電位 取EGCG-N適量，以水為稀釋介質(zhì)，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定EGCG-N的粒度及其分布和Zeta電位。

2.2.3 EGCG-N的載藥量和包封率 采用超濾-HPLC測(cè)定EGCG-N的載藥量和包封率。

游離藥量的測(cè)定：精密量取EGCG-N加純化水稀釋一倍，搖勻，取稀釋后的樣品，置超濾離心管中(超濾膜截留分子量50 KDa)，10000 rpm離心20 min，精密量取超濾液0.2 mL置10 mL量瓶中，加純化水定容至刻度，精密量取20 μL注入液相色譜儀，即為游離藥物濃度。

總藥量的測(cè)定：另取EGCG-N 0.2 mL置10 mL量瓶中，加甲醇5 mL，超聲后用流動(dòng)相稀釋至刻度，精密量取20 μL注入液相色譜儀，即為總藥量。色譜條件如下：

色譜柱：Elite-ODS柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相:甲醇∶水∶乙酸=23∶75∶2；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：272 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

按如下公式計(jì)算EGCG-N的載藥量和包封率。包封率(%)=(C-Ca)/C×100%；載藥量(%)=(C-Ca)/(C+C0)×100%；Ca為游離藥物濃度；C為總藥物濃度；C0為初始投入的明膠質(zhì)量除以水相體積所得理論材料濃度。

2.2.4 pH值 采用PB-10型pH計(jì)對(duì)EGCG-N的pH值進(jìn)行測(cè)定。

2.2.5 EGCG-N的體外釋放 分別精密量取EGCG-N 及EGCG溶液劑各2 mL置于透析袋中，放入釋放介質(zhì)中，于37℃以150 rpm恒速攪拌，分別于0.5 h、1 h、3 h、5 h、8 h、12 h、24 h定時(shí)吸取5 mL釋放液，并及時(shí)補(bǔ)充等量恒溫的釋放介質(zhì)。采用 HPLC測(cè)定介質(zhì)中藥物的含量并計(jì)算累積釋放度。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，EGCG的累積釋放度為縱坐標(biāo)，繪制EGCG-N的體外釋放曲線。

2.3 大鼠體外經(jīng)皮滲透性及皮膚滯留量考察

2.3.1 體外經(jīng)皮滲透性試驗(yàn) 取處理好的大鼠皮膚固定于Franz 擴(kuò)散裝置上，進(jìn)行體外經(jīng)皮滲透性實(shí)驗(yàn)，分別取2 g EGCG-N及EGCG溶液劑，置于供給池中并將其頂部密封。在接受池中注滿接受液，接受液與鼠皮充分接觸且無(wú)氣泡。將該裝置置于(32±0.5)℃恒溫水浴中，磁力攪拌速度為400 r/min，分別于不同時(shí)間點(diǎn)取出5 mL接受液，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，并立即補(bǔ)加同溫同體積新鮮接受液，采用 HPLC法測(cè)定不同時(shí)間接受液中EGCG的濃度，按如下公式計(jì)算單位面積累積透過(guò)量(Q)。以時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，Q為縱坐標(biāo)作圖，得到藥物體外經(jīng)皮滲透曲線。

Q=Cn校×V/A；Cn校=Cn測(cè)+Vi/V×∑Cp；式中Q為t時(shí)間單位面積累積透過(guò)量(μg/cm2)，Cn校為校正后接受液中藥物的濃度；Cn測(cè)為第n次取樣測(cè)得接受液中藥物的濃度；V和Vi分別為接受池中接受液的總體積和每次取樣體積；∑Cp為該取樣點(diǎn)前各點(diǎn)的測(cè)定濃度之和；A為有效透皮擴(kuò)散面積。

2.3.2 皮膚內(nèi)藥物滯留量試驗(yàn) 體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下鼠皮，反復(fù)用蒸餾水洗凈皮膚表面殘存的EGCG，濾紙吸干后剪去周邊的皮膚，稱重，將皮膚剪碎，置于超聲管中，加入5 mL 甲醇，超聲5 min，將上清液移入至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，過(guò)濾，取續(xù)濾液加流動(dòng)相對(duì)倍稀釋后，過(guò)0.45 μm 濾膜，精密量取20 μL進(jìn)樣，測(cè)定皮膚中滯留的EGCG濃度，計(jì)算皮膚中EGCG的滯留量。

3 結(jié)果

3.1 EGCG-N的質(zhì)量評(píng)價(jià)

3.1.1 EGCG-N的形態(tài) 采用TEM對(duì)EGCG-N進(jìn)行外觀形態(tài)的觀察結(jié)果顯示(圖1)，EGCG-N呈球形。

3.1.2 EGCG-N的粒徑及Zeta電位 制備的EGCG-N粒徑分布均勻，平均粒徑為72.63±0.47 nm(圖2a)，Zeta電位為-28.0 mV(圖2b)。

3.1.3 EGCG-N的載藥量和包封率 采用超濾-HPLC測(cè)定EGCG-N中EGCG的載藥量和包封率分別為(29.82±2.16)%和(83.91±0.93)%。

3.1.4 pH值 本文測(cè)得EGCG-N的pH值為6.12±0.13，不但有利于藥物的穩(wěn)定性，而且對(duì)皮膚無(wú)明顯的刺激性。

3.1.5 體外釋放 EGCG-N在釋放介質(zhì)中的釋放曲線見(jiàn)圖3。由圖可知，EGCG溶液劑釋放較快，24 h已經(jīng)基本釋放完全，累積釋放量達(dá)(96.79±1.25)%，而EGCG-N在的釋放介質(zhì)中釋放較慢，5 h的累積釋放量為(34.43±7.20)%，24 h的累積釋放量?jī)H為(49.03±0.40)%。上述結(jié)果證實(shí)，所制備的EGCG-N具有較好的緩釋作用。

3.2 大鼠體外經(jīng)皮滲透性及皮膚滯留量考察

3.2.1 體外經(jīng)皮滲透性實(shí)驗(yàn) 體外經(jīng)皮滲透曲線結(jié)果見(jiàn)圖4，由圖可知，與EGCG溶液劑相比，EGCG-N中EGCG較易透過(guò)皮膚進(jìn)入接受液中，EGCG-N中EGCG 24 h單位面積累積透過(guò)量為(133.77±22.79)μg/cm2，而EGCG溶液中EGCG 24 h單位面積累積透過(guò)量?jī)H為(53.30±21.12)μg/cm2。

圖1 EGCG-N的形態(tài)

圖2a:EGCG-N的粒徑;b:EGCG-N的Zeta電位

圖3 EGCG-N的體外釋放曲線

圖4 EGCG-N和EGCG溶液劑的大鼠皮膚經(jīng)皮滲透曲線

3.2.2 皮膚內(nèi)藥物滯留量實(shí)驗(yàn) 24 h體外滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，EGCG-N及EGCG溶液劑在大鼠皮膚內(nèi)EGCG的平均滯留量分別為(492.57±37.68)μg/g及(165.88±17.96)μg/g (P<0.01)，EGCG-N在大鼠皮膚內(nèi)EGCG的平均滯留量是EGCG溶液劑的2.97倍。

4 討論

4.1 作為天然蛋白的水解產(chǎn)物，明膠結(jié)構(gòu)中存在大量的-NH2及-OH等活性基團(tuán)，能與EGCG通過(guò)氫鍵及疏水作用力相結(jié)合，自組裝形成納米粒。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，EGCG與明膠的質(zhì)量比對(duì)EGCG-N的包封率及載藥量具有顯著的影響，當(dāng)明膠與EGCG的質(zhì)量比為1∶1時(shí)，EGCG-N的包封率僅為46.93%，當(dāng)明膠與EGCG的質(zhì)量比為2∶1時(shí)，EGCG-N的包封率及載藥量明顯提高，當(dāng)繼續(xù)增加明膠與EGCG的質(zhì)量比卻發(fā)現(xiàn)，EGCG-N的載藥量有所下降，分析原因可能是：當(dāng)明膠與EGCG的質(zhì)量比為1∶1時(shí)，明膠提供的活性基團(tuán)不能夠完全與EGCG結(jié)合，有部分EGCG仍處于游離狀態(tài)，繼續(xù)增加明膠與EGCG的質(zhì)量比時(shí)，載藥量與包封率明顯增加，當(dāng)繼續(xù)增加明膠與EGCG的質(zhì)量比至4∶1時(shí)，對(duì)EGCG來(lái)說(shuō)，明膠是過(guò)量的，因此，EGCG-N的載藥量明顯降低。

4.2 本文制備EGCG-N的Zeta電位為-28.0 mV，EGCG-N所帶相同電荷之間的排斥作用能夠有效的阻止納米粒的相互聚集，提高EGCG-N的聚集穩(wěn)定性，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，EGCG-N放置2個(gè)月后，粒徑略有增加，但與0 h相比并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[(72.63±0.47)nm vs.(76.60±1.78)nm，P>0.05]。

4.3 體外經(jīng)皮滲透性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，EGCG-N中EGCG的累積透過(guò)量及皮膚滯留量要顯著大于EGCG溶液劑組，這是由于明膠納米粒的納米結(jié)構(gòu)能夠使其緊密的粘附在角質(zhì)層，形成連貫的具有閉塞效應(yīng)的膜，增加皮膚的水合作用，減少水分的散失從而提高藥物的滲透性；通過(guò)對(duì)兩種制劑的皮膚滯留量研究發(fā)現(xiàn)，EGCG-N與EGCG溶液劑相比能顯著提高EGCG在皮膚中的滯留量，有利于皮膚科疾病的治療。

綜上所述，本研究制備的EGCG-N具有制備工藝簡(jiǎn)單、質(zhì)量穩(wěn)定、能夠顯著提高EGCG的經(jīng)皮滲透量的特點(diǎn)，有望成為一種新型的皮膚科外用制劑。