Th17相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子在天皰瘡發(fā)病中的作用

葉珊珊 李瑩潔 李 卉 姚香君 王再興

天皰瘡(pemphigus)是一種侵犯皮膚、黏膜的慢性自身免疫性大皰病，以患者血清中測得橋粒芯糖蛋白抗體為該病的主要特征[1]。Th17細(xì)胞是一種新型的T細(xì)胞亞群，作為免疫反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，在自身免疫性疾病、慢性炎癥的發(fā)生中起著關(guān)鍵性作用[2]。目前已有許多自身免疫性疾病被報道與Th17有關(guān)，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡及銀屑病等[1]，但在天皰瘡中的研究非常少見，相關(guān)的細(xì)胞因子與趨化因子在天皰瘡中的作用也不清楚。本文通過檢測患者血清中Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子與趨化因子，探討其在天皰瘡發(fā)病中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2017年12月至2018年8月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科收治的31例天皰瘡患者作為病例組，男15例，女16例，平均年齡(57.23±14.56)歲，經(jīng)臨床、組織病理和天皰瘡自身抗體檢測明確診斷分型的尋常型天皰瘡18例(58.06%)，落葉型天皰瘡7例(22.58%)，紅斑型天皰瘡6例(19.35%)。另選取明確診斷為大皰性類天皰瘡(Bullous pemphigoid，BP)初發(fā)患者15例，男6例，女9例，平均年齡(67.20±10.87)歲及20名排除自身免疫性疾病、惡性腫瘤、感染等疾病的健康體檢者作為對照組，其中男9名，女11名，平均年齡(52.75±13.50)歲。在31例天皰瘡患者中，有23例患者疾病控制穩(wěn)定后留有血清樣本。

按照目前國際公認(rèn)的天皰瘡病情評估方法，即天皰瘡面積指數(shù)(pemphigus disease area index, PDAI)，將患者入院時的皮膚及黏膜活動性的損害情況進(jìn)行嚴(yán)重程度的量化分級，根據(jù)患者病情所獲分值，分為輕度(0～8分)、中度(9～24分)、重度(≥25分)。其中輕度組6例(19.35%)、中度組15例(48.39%)、重度組10例(32.26%)三組。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理 抽取31例治療前和23例治療后天皰瘡患者、15例BP及20名健康對照者外周靜脈血5 mL，靜置沉淀2 h后，以3000 r/min的速度離心，5 min后吸取上層血清樣本，置于-80℃冰箱保存以備檢測。

1.2.2 實驗方法 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中Th17相關(guān)的細(xì)胞因子IL-6、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23和趨化因子CXCL-8、CCL-5水平。實驗嚴(yán)格按照試劑盒(Abcam產(chǎn)品，英國)標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 病例組與兩組對照組細(xì)胞因子與趨化因子的比較 病例組與類天皰瘡組及健康對照組兩兩比較發(fā)現(xiàn)，病例組血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子水平明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；而病例組與類天皰瘡組比較發(fā)現(xiàn)IL-21在兩組間具有顯著的差異性(P<0.05)，即病例組中IL-21水平明顯低于類天皰瘡組，而其它細(xì)胞因子未見明顯差別(P>0.05)。見表1。

表1 三組細(xì)胞因子與趨化因子水平比較

注：*病例組與類天皰瘡組比較，P<0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異

2.2 不同亞型天皰瘡患者血清細(xì)胞因子與趨化因子的比較 尋常型、落葉型、紅斑型天皰瘡三組間經(jīng)方差分析比較，差異無顯著性(P>0.05)。見表2。

2.3 不同嚴(yán)重程度的天皰瘡患者血清細(xì)胞因子與趨化因子的比較 三種不同嚴(yán)重程度的天皰瘡患者血清中Th17相關(guān)因子水平的統(tǒng)計結(jié)果顯示：IL-17、IL-21、IL-22、IL-23、CCL-5與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)(P<0.05)；并且血清IL-23水平在三組間比較具有明顯差異，且疾病程度越重，細(xì)胞因子表達(dá)水平越高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；IL-6、CXCL-8差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

2.4 天皰瘡患者治療前后細(xì)胞因子與趨化因子的比較 在天皰瘡患者治療前后血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子與趨化因子的比較發(fā)現(xiàn)，IL-6、IL-10、IL-17、IL-21、IL-22、IL-23和CXCL-8均較治療前呈現(xiàn)明顯下降趨勢(P<0.001)，而CCL-5水平也有下降，但不顯著(P>0.05)。見表4。

表2 不同亞型天皰瘡患者血清細(xì)胞因子與趨化因子的比較

表3 不同嚴(yán)重程度的天皰瘡患者血清細(xì)胞因子與趨化因子的比較

注：*P<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義

表4 治療前后細(xì)胞因子與趨化因子水平比較

3 討論

天皰瘡是一種自身抗體導(dǎo)致的皮膚疾病，在患者血清和皮損處檢測出針對橋粒芯糖蛋白1和 3(desmoglein，Dsg1和Dsg3)特征性IgG自身抗體，B細(xì)胞產(chǎn)生致病性抗體是引起棘層細(xì)胞松解，皮膚、黏膜出現(xiàn)特征性水皰的關(guān)鍵因素，而T細(xì)胞亞群及其相關(guān)因子在誘導(dǎo)和維持天皰瘡抗體的產(chǎn)生中起著重要作用[1]。近年來，新型CD4+亞群Th17細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)參與了多種自身免疫性疾病的發(fā)病過程而逐漸受到關(guān)注。直至2008年，Arakawa等[2]通過免疫組化染色試驗，發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者皮損中Th17細(xì)胞及其細(xì)胞因子IL-17呈現(xiàn)高度表達(dá)狀態(tài)，首次揭開了探討Th17細(xì)胞及相關(guān)因子在天皰瘡發(fā)病機制研究的序幕。

Th17細(xì)胞是一種分泌特征性IL-17的輔助T細(xì)胞亞群[3]。初始CD4+-CD161+Th細(xì)胞在特異性的細(xì)胞因子，如TGF-β、IL-6、IL-1β、IL-21、IL-23協(xié)同作用下激活STAT3信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)RORγt的過度表達(dá)，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和細(xì)胞因子IL-17、IL-22的產(chǎn)生[4]。趨化因子作為一種調(diào)節(jié)細(xì)胞運輸、控制免疫細(xì)胞遷移的信號肽[5]，與Th17細(xì)胞介導(dǎo)組織炎癥和自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。目前，國內(nèi)對趨化因子在天皰瘡中的作用尚無相關(guān)研究。

體內(nèi)B細(xì)胞分泌主要的自身抗體IgG1和IgG4，與表皮結(jié)構(gòu)蛋白相結(jié)合后可能直接誘導(dǎo)水皰的形成，或間接激發(fā)炎癥通路，包括補體激活、白細(xì)胞向病灶聚集、大量蛋白酶釋放導(dǎo)致皮損的發(fā)生[6]。IL-6是一種炎性細(xì)胞因子，參與炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖、終末分化及免疫球蛋白的分泌[7]；而IL-21作為Th17細(xì)胞自分泌細(xì)胞因子，與IL-4協(xié)同后可誘導(dǎo)CD40L刺激性B細(xì)胞產(chǎn)生IgG1抗體[8]從而發(fā)揮致病作用。我們實驗結(jié)果與既往研究一致的是，在天皰瘡患者血清或皮損檢測到IL-6、IL-21的強陽性表達(dá)[9，10]，兩種因子或許也可在細(xì)胞免疫階段促進(jìn)B細(xì)胞抗體分泌，致高濃度的抗Dsg抗體產(chǎn)生而導(dǎo)致天皰瘡的發(fā)病。IL-21促進(jìn)了Th17作用，同時也抑制幼稚CD4+T分化為Treg細(xì)胞的能力，致使兩種細(xì)胞失衡[11]；另有研究表明，刺激離體Dsg3后也檢測到了分泌IL-21的特異性自身反應(yīng)性T細(xì)胞[10]，這些發(fā)現(xiàn)均提示與疾病的發(fā)生有關(guān)。

IL-17是Th17細(xì)胞最重要的效應(yīng)因子，為T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)早期的啟動因子，活化后的T細(xì)胞產(chǎn)生的CCL-5/RANTES具有很強的募集單核細(xì)胞、Th1、Th17和嗜酸粒細(xì)胞的能力,從而誘導(dǎo)炎性因子的過度表達(dá)[12]，而與炎癥反應(yīng)過程中產(chǎn)生的CXCL-8/IL-8共同作用下，可募集中性粒細(xì)胞趨化至炎癥部位[13]；在我們的實驗中，也發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者血清中三者均有不同程度的升高，這或許可在一定程度上解釋天皰瘡病理中見真皮淺層中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞等浸潤的原因。而有學(xué)者認(rèn)為，IL-8的增加可能不是導(dǎo)致天皰瘡形成的直接原因，是皮膚屏障受損后炎癥反應(yīng)的結(jié)果[1]。但也有研究表明，在表皮中炎癥因子和趨化因子的過度表達(dá)，如IL-6、CXCL-8、MCP-1可導(dǎo)致中性粒細(xì)胞活化，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROC)的釋放，導(dǎo)致真皮表皮交界處的破壞[14]。在皮膚中，IL-22介導(dǎo)表皮的增生、脫落，角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和終末分化等生物學(xué)過程。同時有研究發(fā)現(xiàn)， CCL-5與IL-22具有相互抑制現(xiàn)象[15]，但在我們的研究中，并未體現(xiàn)這一特點。曾有學(xué)者發(fā)現(xiàn)天皰瘡患者治療后，IL-22的水平呈現(xiàn)上升趨勢[16]，并且不同以往的研究[15，17]，IL-22在不同亞型比較也未發(fā)現(xiàn)明顯的差異性，這或許與本實驗樣本量有限有關(guān)，目前還需擴大樣本數(shù)量作深入研究。

IL-23不僅是啟動Th17細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素，也是增強Th17擴增、穩(wěn)定細(xì)胞、維持功能、發(fā)揮慢性炎癥反應(yīng)的重要因子[5]。Timoteo等[17]在天皰瘡患者血清中同樣發(fā)現(xiàn)IL-23水平升高，并且伴隨IL-6與IL-17的表達(dá)增強，這與我們的發(fā)現(xiàn)一致。而在我們的研究中，IL-23不僅在天皰瘡患者血清中明顯升高，并且與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，提示其表達(dá)水平可用于評估天皰瘡的嚴(yán)重程度。有人提出，Th17細(xì)胞的致病性與IL23/IL23R信號通路過度激活有關(guān)[18]?；蛟S，IL23/Th17軸可能是揭示天皰瘡發(fā)病機制的新途徑[19]，為天皰瘡的治療提供最有希望的靶點之一。

綜上所述，我們通過研究發(fā)現(xiàn)Th17相關(guān)細(xì)胞因子和趨化因子在天皰瘡等自身免疫性皰病中呈異常表達(dá)，并且在疾病控制穩(wěn)定后細(xì)胞因子水平呈現(xiàn)下降的趨勢，因而認(rèn)為它們可能在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、趨化效應(yīng)細(xì)胞，以及誘導(dǎo)B細(xì)胞分化特異性抗體等方面，參與疾病的發(fā)生。部分因子水平與天皰瘡嚴(yán)重程度具有一定相關(guān)性，這也提示著Th17相關(guān)因子與疾病狀態(tài)有關(guān)，并且IL-23的表達(dá)差異有助于判斷天皰瘡的嚴(yán)重程度，為臨床的診斷治療提供了重要依據(jù)。

在后續(xù)研究中，我們擬進(jìn)一步檢測天皰瘡皮損及皰液中Th17相關(guān)因子的水平，并分析天皰瘡特異性抗體與分子水平的相關(guān)性，對Th17相關(guān)細(xì)胞因子在天皰瘡發(fā)病中的作用進(jìn)行深入研究。