129株非結核分枝桿菌采用兩種分子檢測技術行菌種鑒定的結果分析

劉佳文 呂紅艷 丁北川 張治國

非結核分枝桿菌(NTM)，也曾稱為非典型分枝桿菌，是指除結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex， MTC)和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌?，F(xiàn)有的文獻提示我國分離最多的NTM菌種為胞內分枝桿菌，在北方可達40%～60%[1]。近年來，隨認識的提高和檢查手段的提高，出現(xiàn)一些不常見的NTM菌種。四川省自貢市在國內首次報道外來分枝桿菌和奧巴涅分枝桿菌[2]。為探討NTM分子菌種鑒定方法臨床檢查的應用意義,本研究對129株 NTM 臨床分離株的菌種鑒定結果進行分析。

資料和方法

一、一般資料

NTM臨床分離株來源于2014年北京老年醫(yī)院(23株)、北京結核病控制研究所中心實驗室(69株)、北京市昌平區(qū)結核病防治所(37株)，共計129株。

二、試劑及方法

采用芯片雜交法(中國江蘇獵陣生物科技有限公司)和16S rRNA基因測序法鑒定分枝桿菌(北京六合華大基因科技有限公司)，2種方法實驗操作者之間采用雙盲法。芯片雜交法嚴格按廠家說明書進行操作。16S rRNA基因測序法來自文獻[3]。

(一)芯片雜交法鑒定分枝桿菌

1.主要儀器及試劑：分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(膜芯片法)(江蘇獵陣生物科技有限公司)，ETC811基因擴增儀，多孔板恒溫振蕩儀(型號：MB100-4A)。

2.分枝桿菌分離株DNA的提?。?1)取相應數(shù)量的1.5 ml的提取管標記。(2)向每個提取管中加入200 μl的“解液A”。(3)用Tip頭挑取少量培養(yǎng)的菌落，放到加了“解液A”的提取管中,蓋上蓋。(4)將提取管在超級恒溫混勻儀中進行金屬浴10 min(恒溫混勻儀參數(shù)設置：振蕩強度1600 r/min,溫度95 ℃)。(5)金屬浴后，12 800×g離心3 min,上清液即可作為擴增模板進行擴增。

3. PCR擴增：PCR擴增反應體系，17 μl擴增反應液，3 μl模板DNA，PCR擴增程序：50 ℃ 2 min；94 ℃ 4 min；采用94 ℃ 30 s，53 ℃ 45 s，72 ℃ 20 s進行35個循環(huán)后；再進行94 ℃ 30 s，68 ℃ 45 s，72 ℃ 20 s，20個循環(huán)；保持4 ℃。完成擴增反應后，PCR產物可立即檢測；如不立即檢測則置于-18 ℃及以下保存，并在1周內完成檢測。

4. 芯片雜交：(1)提前20 min打開恒溫振蕩儀，溫度設置在45 ℃。(2)拿出對應樣本數(shù)量的晶格，分別進行編號。(3) 每份樣本應將600 μl 分枝桿菌菌種鑒定(MY)反應液1和待檢樣本的20 μl PCR擴增產物加入反應槽中。(4)將晶格轉入恒溫振蕩儀，振蕩強度1500 r/min，振動10 min。(5)反應結束后將晶格取出，開蓋，將晶格略傾斜，吸凈每個反應槽內的液體。(6)向每個反應槽內分別加入1 ml MY反應液1, 振蕩強度1500 r/min，振動2 min。(7)反應結束后將晶格取出，開蓋，將晶格略傾斜，吸凈每個反應槽內的液體。(8)根據檢測數(shù)量，先預混合反應液1和反應液2至15 ml準備管中，反應液1每人份用量為600 μl，反應液2每人份用量為1 μl。(9)向每個反應槽內分別加入600 μl MY反應液1和MY反應液2預混合液, 振蕩強度1500 r/min，振動3 min。(10)反應結束后將晶格取出，開蓋，將晶格略傾斜，吸凈每個反應槽內的液體。(11)向每個反應槽內分別加入2 ml的MY 緩沖液，蓋上蓋，置于恒溫振蕩儀，振蕩強度1500 r/min，2 min。(12)重復“(10)、(11)”一次。(13)開蓋，將晶格略傾斜，徹底吸凈每個反應槽內的液體。(14)向每個反應槽內加入500 μl的MY反應液3，保證充分浸沒MY獵陣芯片，通過恒溫振蕩儀振蕩，強度1500 r/min，反應3 min。(15)每個反應槽內加入自來水，輕輕晃動晶格5 s，終止反應。直接在水中觀察每個MY獵陣芯片上的反應結果。DNA的提取、PCR擴增、芯片雜交及顯色操作參照試劑盒說明書。

(二)16S rRNA基因測序鑒定分枝桿菌

1.分枝桿菌分離株DNA的提?。?1)取80 μl無菌水置于1.5 μl EP管中，挑取生長良好的菌落4～5個(盡量不要取到培養(yǎng)基)于管中。(2)于100 ℃水中煮20 min，然后立即置于冰上10 min。13 000×g離心2 min。(3)取上清于新的1.5 μl EP管中，以此作為PCR擴增的DNA模板，存于-20 ℃。

2. 試劑：2包TaKaRa的Taq酶(大連TaKaRa公司)；兩對引物，上下游引物各2管，每管50 μl；6×載樣緩沖液。

3.主要儀器：BIO-RAD My Cycler PCR擴增儀(美國伯樂公司)。

4.引物: 引物NT1.1F(GAGATACTCGAGTGGCGAAC)，NT1.1R(GGCCGGCTACCCGTC-GTC)可擴增所有分枝桿菌16S rDNA基因，產生212 bp的目的片段；引物NT-3F(CACATGCAAGTCGAACGGAAAGG)，NT-3R(GCCCGTATCGCCCGCACGCT)擴增可得到500～700 bp的目的片段，擴增產物用于16S rRNA基因測序[3]。

5. PCR擴增：PCR擴增體系中，滅菌蒸餾水33.5 μl，TaKaRa Taq(5 U/μl)0.5 μl，10×PCR Buffer (Mg2+free) 5 μl，dNTP mixture(為dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合溶液)各2.5 mmol 4 μl，25 mmol MgCl23 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，模板2 μl。擴增條件：預變性94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 1 min，64 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，34個循環(huán)后，72 ℃延伸5 min，保持4 ℃。

6. 瓊脂糖凝膠電泳：擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，M2000的DNA Marker 5 μl，PCR產物7 μl，6×載樣緩沖液2 μl。

7. 16S rRNA基因測序：擴增產物送華大基因公司測序,送測序除PCR產物還送測序引物。測序引物既可送上游也可送下游引物。送“NT-3F”方向填 “正向”；送“NT-3R”方向填“反向”。測序樣本送30 μl。

8. 序列比對：使用的是北京胸科醫(yī)院國家結核病臨床實驗室開發(fā)的分枝桿菌菌種鑒定DNA序列比對系統(tǒng)，序列比對網址：http://111.207.168.134/NLC，以未知序列與標準序列比對結果中最高得分值的比對結果為判定對象，16S rDNA相似度≥99.0%，標準序列對應的細菌名稱即為未知序列的細菌名稱。

三、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 17.0軟件對NTM臨床分離株不同菌種在3家機構中的分布數(shù)據進行統(tǒng)計、分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

已知7株結核分枝桿菌和1株瘰疬分枝桿菌作為質控株，隨樣本一起隨機編號進行16S rRNA基因測序和芯片雜交法全程操作，2種方法中8株質控株檢測結果與目標結果相符。

129株NTM臨床分離菌株中，有107株進行分枝桿菌16S rRNA基因PCR擴增(NT1.1F，NT1.1R)陽性，并完成了16S rRNA基因測序(NT-3F，NT-3R)，其中59株為胞內分枝桿菌(55.1%)；29株為堪薩斯分枝桿菌(27.1%)；5株為龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌(4.7%)；3株為鳥分枝桿菌(2.8%)；2株為偶發(fā)分枝桿菌；2株為戈登分枝桿菌(1.9%)。129株NTM菌株中，有116株進行芯片雜交法鑒定分枝桿菌。結果見表1。

129株NTM菌株中，有96株同時進行芯片雜交法和16S rRNA基因測序鑒定分枝桿菌。2種方法的符合率為88.5%(85/96)，結果見表1。

表1 不同菌種分別在芯片雜交和16S rRNA基因測序進行菌種鑒定時的結果分析

注表中“其他NTM”為母牛分枝桿菌、明尼蘇達分枝桿菌、熊本分枝桿菌、提門分枝桿菌(M.temen)

11株NTM菌株采用芯片雜交法與16S rRNA基因測序的檢測結果不相符(表2)。16S rRNA基因測序結果發(fā)現(xiàn)有3株外來菌株，分別為明尼蘇達分枝桿菌、熊本分枝桿菌、提門分枝桿菌(M.temen)。

表2 芯片雜交法和16S rRNA基因測序檢測結果

3家機構NTM臨床分離株主要以胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌為主。除龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌外(χ2=12.867，P<0.05),其他種類分枝桿菌在3家機構臨床分離菌株中的構成比差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

討 論

北京老年醫(yī)院為北京市海淀區(qū)結核病診療委托醫(yī)院，每年患者標本中都能分離出NTM，但是由于條件限制，未及時準確地進行NTM菌種鑒定。沒有實驗室及時準確的NTM菌種鑒定，臨床不能做及時準確的診斷，只能采用經驗用藥，療效往往欠佳[4]。分離出來的NTM菌株是哪種NTM,是否是致病菌，該怎樣用藥，臨床需要實驗室的NTM數(shù)據來分析回答這些問題[1]。

用2種分子生物學方法進行NTM菌種鑒定，已有文獻報道[5-8]；還有采用MALDI-TOF MS(基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜)結合DNA測序方法進行菌種鑒定的報道[9-10]。首先NTM鑒定需要快，本研究采用的芯片法全流程只需要4 h，也有報道需要6 h[5]。芯片法雖然鑒別能力較直接的基因序列分析弱，但簡化了操作，并且具備鑒定臨床常見NTM的能力，能夠解決臨床大部分問題[1]。本研究中96株同時進行芯片雜交法和16S rRNA基因測序法鑒定分枝桿菌，兩種方法的符合率為88.5%(85/96)。用芯片雜交法解決了基因測序法88.5%的問題。關于芯片雜交法與16S rRNA基因測序法鑒定分枝桿菌的符合率有不同報道，有83.6%[11]、94.59%[6]和95.4%[5]等，大部分符合率相當高。這是選芯片雜交法用于初篩的理由。

表3 非結核分枝桿菌臨床分離株不同菌種在3家機構中的分布

注表中“其他NTM”為母牛分枝桿菌、明尼蘇達分枝桿菌、熊本分枝桿菌、提門分枝桿菌

其次，NTM鑒定需要準確，通過分析同源DNA序列組成差異可鑒定細菌至“種”的水平，是目前菌種鑒定的“金標準”[1]。因此，本研究在用芯片雜交法初篩后，選用16S rRNA基因測序法來確認。選用的16S rRNA基因鑒別能力雖然相對較低，但由于目前其相關數(shù)據庫最為完整，是推薦常規(guī)使用的方法[1]。這樣用兩種方法進行NTM菌種鑒定得到的數(shù)據既有臨床價值，也有流行病學科研意義[12]。

在分枝桿菌菌種鑒定過程中，質量控制至關重要[13]。用已知菌株來對測序和結果分析進行質量控制，以此來保證結果的準確性和可重復性。

本研究基因測序和芯片雜交兩種方法實驗操作者之間采用雙盲，最后由1名工作人員來揭盲，將每個標本鑒定結果和標本來源單位一一對應。盲法最大限度地減少了個人主觀判斷對結果的影響[14]。

結果表明，3個單位的菌株，以肺部NTM 感染最常見的菌種(胞內分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌)為主，超過80%。除龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌外,其他種類分枝桿菌在3家單位的構成比差異無統(tǒng)計學意義。說明在北京這3家機構分枝桿菌感染譜是相似的，可以合并來進行分析。合并3家菌株用測序進行分析，胞內分枝桿菌占55.1%，堪薩斯分枝桿菌占27.1%，龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌占4.7%，鳥分枝桿菌占2.8%，偶發(fā)分枝桿菌和戈登分枝桿菌均占1.9%,和蘇州地區(qū)報道的結果相似[15]。云南以鳥分枝桿菌為主[16]。胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、龜分枝桿菌/膿腫分枝桿菌用芯片雜交法和測序法之間的符合率為92.5%、92.3%、100.0%。芯片雜交法完全可以滿足初篩的需求[6-7, 11]。

綜上所述，先用芯片雜交法進行快速診斷，然后結合臨床和測序法的結果確定診斷，如此的工作流程具有臨床實用性。

張潔等[17]報道北京地區(qū)NTM菌種多達13種，可見新金色分枝桿菌及熊本分枝桿菌，本研究中北京結核病控制研究所中心實驗室送來的菌株中基因測序鑒定出3株外來菌株，分別為明尼蘇達分枝桿菌、熊本分枝桿菌、提門分枝桿菌。光產色菌“明尼蘇達分枝桿菌”主要來自周圍環(huán)境[18]；熊本分枝桿菌是不產色慢生長菌，可從有肺部感染的潛伏性結核感染者中分離到[17, 19]；提門分枝桿菌有報道能從HIV感染者身上分離到[20-21]。芯片雜交只能分析常見的15種菌，對這3種菌的鑒定都出現(xiàn)了錯誤。只有基因測序才能及時發(fā)現(xiàn),有利于及時分析外來菌株和評估外來菌株的生物安全風險，以便及時采取措施應對外來菌種的侵害。

本研究中由于條件所限，如3家單位之間，以及單位內部存在的信息孤島，臨床信息缺乏，即使發(fā)現(xiàn)有意義的菌種如提門分枝桿菌，也沒法進行深入的研究。因此，加強與臨床的溝通與信息的互聯(lián)互通，是接下來要做的工作。