紅樹莓花色苷的提取及其抗氧化性研究

楊曉娜 陳宏艷 陳自宏

（保山學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院，云南保山 678000）

樹莓（RubusidaeusL.）又稱為覆盆子、懸鉤子等，是薔薇科懸鉤子屬植物，灌木性果樹，其果實(shí)具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能，深受消費(fèi)者喜愛[1]。樹莓含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分及功能活性物質(zhì)，例如花色苷、黃酮等，紅樹莓除了鮮食外，還被加工成冷凍果、果醬、果汁、果酒等[2]。花色苷是一種天然色素，具有抗菌、降低血壓、強(qiáng)化免疫系統(tǒng)的功能等作用[3]，它也是一種天然的抗氧化劑，能夠很好地清除生物體內(nèi)常見的活性氧，普遍認(rèn)為花色苷的抗氧化性決定其生物活性和保健作用[2]。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，紅樹莓花色苷的提取方法主要集中在有機(jī)溶劑法[2，4]和超聲波提取法[5-13]。與常規(guī)的花色苷提取方法相比，雙水相提取易操作，可連續(xù)、可擴(kuò)大生產(chǎn)且綠色環(huán)保[14]，因而在天然活性成分的提取中得到廣泛應(yīng)用[15-16]。本研究采用超聲輔助雙水相提取紅樹莓花色苷，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化，在最佳工藝條件下提取紅樹莓花色苷，并研究其抗氧化活性，有利于提升紅樹莓的附加值，提高花色苷的含量，為紅樹莓作為抗氧化功能性產(chǎn)品提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅樹莓產(chǎn)自云南嵩明，其品種為西班牙Adilita，鮮果當(dāng)天采摘后空運(yùn)，分裝后置于-20℃下冷凍保存；無(wú)水乙醇、硫酸銨、無(wú)水乙酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鉀等分析純：津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平（CP114）：奧豪斯儀器有限公司；九陽(yáng)料理機(jī)（JYL-C012）：杭州市九陽(yáng)有限公司、智能靜音超聲波清洗機(jī)（XM-800UVF）：小美超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)（UV-5500PC）：上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅樹莓花色苷最大吸收波長(zhǎng)

冷凍紅樹莓先解凍，用料理機(jī)打成勻漿，備用。用燒杯稱取紅樹莓勻漿2 g，40%乙醇體積分?jǐn)?shù)、1∶20 料液比、800 W 超聲功率、0.4 g/mL 硫酸銨濃度、50℃、提取50 min，將靜置分層后取上相液進(jìn)行可見光區(qū)光譜掃描[17]，確定紅樹莓花色苷最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2 紅樹莓花色苷含量測(cè)定方法

緩沖溶液的制備方法參看文獻(xiàn)[18]。用pH示差法[18]測(cè)定花色苷含量。

根據(jù)下式計(jì)算溶液中花色苷的含量（mg/g）：

? 代表摩爾吸光系數(shù)，?=26 900；L 代表比色皿的厚度（cm）；M 代表矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量，M=449.2 mg/mol；DF代表稀釋的倍數(shù)；V代表定容體積（mL）；W代表紅樹莓樣品質(zhì)量（g）

1.3.3 單因素試驗(yàn)方法

乙醇體積分?jǐn)?shù)17.5%～27.5%，硫酸銨濃度0.45～0.65 g/mL，超聲功率400～720 W，時(shí)間為10～50 min，料液比1∶10～1∶50，進(jìn)行花色苷提取。研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨濃度濃度、超聲功率、液料比、時(shí)間，對(duì)紅樹莓花色苷含量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素?cái)?shù)據(jù)，選取四個(gè)因素變量，以紅樹莓花色苷含量為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.6的Box-Behnken優(yōu)化超聲波輔助雙水相提取紅樹莓花色苷的工藝。

1.3.5 DPPH清除自由基能力測(cè)定方法

DPPH清除自由基能力測(cè)定方法，參看參考文獻(xiàn)[2]，各溶液添加量見表1。

表1 DPPH 清除自由基能力測(cè)定方法中各溶液的添加量

式中，A1表示DPPH 溶液+花色苷提取液的吸光值；A2表示無(wú)水乙醇+花色苷提取液的吸光值；A0表示無(wú)水乙醇+DPPH溶液的吸光值[18]。

1.3.6 羥自由基清除率測(cè)定方法

羥自由基清除率測(cè)定方法，參看文獻(xiàn)[19]，各溶液添加量見表2。

表2 羥基自由基清除能力測(cè)定方法中各溶液的添加量

式中，A0表示不加花色苷溶液的空白對(duì)照吸光度值；A1表示加花色苷溶液的吸光度值；A2表示無(wú)顯色劑時(shí)的吸光度值[18]。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Origin軟件統(tǒng)計(jì)，SPSS（20.0）進(jìn)行ANOVA鄧肯差異分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅樹莓花色苷可見光光譜特征

蒸餾水作空白對(duì)照，測(cè)定紅樹莓花色苷提取液的吸收光譜，花色苷的最大吸收峰通常在270～280 nm 和510～540 nm 的范圍內(nèi)[2]，紅樹莓花色苷的紫外光譜為圖1。如圖1 所示，紅樹莓花色苷最大吸收峰在532 nm處。

圖1 紅樹莓花色苷最大吸收峰

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)花色苷含量的影響

如圖2所示，花色苷含量呈現(xiàn)隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而增高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為22.5%，花色苷的含量達(dá)到最大時(shí)，為0.218 mg/g。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過22.5%時(shí)，含量開始下降。這可能是因?yàn)榛ㄉ諏儆跇O性較強(qiáng)的物質(zhì)，乙醇的體積分?jǐn)?shù)增大會(huì)引起溶液極性變?nèi)?，提取效果變差[15]。雖然乙醇體積分?jǐn)?shù)為22.5%與20%和25%相比，沒有顯著性差異，但是考慮到含量和耗能，于是選取了22.5%為花色苷提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)紅樹莓花色苷含量的影響

2.3 硫酸銨濃度對(duì)花色苷含量的影響

如圖3 所示，隨著硫酸銨濃度升高，紅樹莓花色苷含量是逐漸增大的。當(dāng)硫酸銨濃度達(dá)到0.55 g/mL 時(shí)，花色苷的含量最高，為0.149 mg/g，硫酸銨濃度超過0.55 g/mL 時(shí)，其含量開始下降，硫酸銨濃度從0.55 g/mL 到0.60 g/mL 時(shí)，含量下降明顯。這是由于花色苷溶于乙醇，當(dāng)增加硫酸銨的濃度時(shí)，其與乙醇競(jìng)爭(zhēng)水，乙醇減少，花色苷的量也隨之減少[16]。

圖3 硫酸銨濃度對(duì)紅樹莓花色苷含量的影響

雖然硫酸銨濃度0.5 g/mL 與0.45 g/mL 和0.55 g/mL 相比，沒有顯著性差異，但出于含量和耗能的原因，選取的最佳硫酸銨濃度是0.55 g/mL。

2.4 超聲功率對(duì)花色苷含量影響

如圖4 所示，隨著超聲功率增大，紅樹莓花色苷含量也在逐漸增大。超聲功率為560 W 時(shí)，花色苷的含量達(dá)到最大，為0.088 mg/g。超聲功率超過560 W 時(shí)，其含量開始下降，超聲功率從560 W 到640 W 時(shí)，花色苷含量下降較快，這是由于超聲波的機(jī)械效應(yīng)促使花色苷成分發(fā)生降解，使花色苷含量下降[14]。雖然超聲功率設(shè)置的梯度之間并沒有顯著性差異，但結(jié)合含量和耗能考慮，選取了560 W為最佳超聲功率。

圖4 超聲功率對(duì)紅樹莓花色苷含量的影響

2.5 超聲時(shí)間對(duì)花色苷含量的影響

如圖5所示，紅樹莓花色苷含量呈現(xiàn)隨超聲時(shí)間增加，較緩慢地增大后下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，花色苷的含量最高，為0.130 mg/g。超過30 min時(shí)，紅樹莓花色苷含量又開始下降。這是因?yàn)槌晻r(shí)間增加能促進(jìn)細(xì)胞壁破裂，使花色苷浸出速率和程度提高，但時(shí)間過長(zhǎng)的話會(huì)使花色苷成分被破壞，致使含量有所下降[14]。雖然超聲時(shí)間為30 min 時(shí)與20 min 和40 min 相比而言，并沒有顯著性差異，但出于對(duì)花色苷含量和耗能考慮，選取30 min為最佳超聲時(shí)間。

圖5 時(shí)間對(duì)紅樹莓花色苷含量的影響

2.6 料液比對(duì)花色苷含量的影響

如圖6 所示，隨著料液比增大，紅樹莓花色苷含量呈增大趨勢(shì)。在料液比是1∶20 時(shí)，花色苷的含量達(dá)到最大，得到0.238 mg/g。料液比＞1∶20 時(shí)，花色苷含量又開始下降，料液比從1∶20 到1∶25 時(shí)，花色苷含量下降較快。原因是隨著提取液增多，樣品與提取液接觸更加地充分，提取量上升，但提取液繼續(xù)增多的話，花色苷的溶出量達(dá)到了飽和，提取量就呈下降的趨勢(shì)[15]。1∶20 的料液比與其他梯度相比，差異顯著，且含量最高，故選取的最佳料液比為1∶20。

圖6 料液比對(duì)紅樹莓花色苷含量的影響

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

2.7.1 因素水平的選取

根據(jù)單因素結(jié)果，進(jìn)行4因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表3。

表3 實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2.7.2 響應(yīng)面分析

乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨濃度、超聲功率、料液比作為自變量，響應(yīng)值為花色苷含量，進(jìn)行Box-Beheken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

經(jīng)過回歸擬合，得到如下的回歸方程：

Y=0.17-8.900E-003A-7.708E-003B-0.014C+0.016D+0.020AB-0.023AC-9.375E-003AD-5.000E-003BC+0.017BD-0.021CD-5.875E-004A2-0.031B2+0.019C2-0.036D2

由表5 可知，模型的P 值＜0.000 1，表明擬合程度良好，模型極顯著。模型的相關(guān)系數(shù)為R2=0.929 9，紅樹莓花色苷含量與各個(gè)因素之間的線性關(guān)系顯著，失擬項(xiàng)P值為0.080 4（＞0.05），說明這個(gè)模型是可以用來分析和預(yù)測(cè)紅樹莓理論上的花色苷含量。B、AD、A2對(duì)模型影響不顯著，A、BC 影響顯著，C、D、AB、AC、CD、B2、C2、D2影響極顯著。均方值的大小表示因素影響的強(qiáng)弱，均方值越大就說明因素對(duì)花色苷含量的影響越大[7]。表4可知，四個(gè)因素對(duì)紅樹莓花色苷含量影響大小為：料液比（D）＞超聲功率（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）＞硫酸銨濃度（B）。因此，超聲輔助雙水相提取花色苷的最佳工藝為：25%的乙醇體積分?jǐn)?shù)、0.55 g/mL 的硫酸銨濃度、640 W 超聲功率、超聲30 min、1∶20的料液比，花色苷的含量為0.219mg/g。

通過Design-Expert 軟件，得到了各個(gè)因素之間相互作用的響應(yīng)面圖，見圖7。3D 響應(yīng)面圖傾斜度都反映了各因素之間的相互關(guān)系，傾斜度越高，坡度越陡，就說明兩因素交互作用越顯著[7]。圖7（a）顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)與硫酸銨濃度二者交互作用對(duì)花色苷含量的影響顯著。圖7（b）顯示，乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率二者交互作用對(duì)花色苷含量的影響顯著。圖7（c）顯示，曲面是相對(duì)平緩的，乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比二者交互作用對(duì)花色苷含量的影響不顯著。圖7（d）顯示，硫酸銨濃度與超聲功率二者交互作用顯著。圖7（e）顯示，曲面是相對(duì)平緩的，硫酸銨濃度與料液比二者交互作用對(duì)花色苷含量的影響不顯著。圖7（f）顯示，超聲功率與料液比交互作用對(duì)花色苷含量影響顯著。

2.7.3 樹莓花色苷對(duì)DPPH自由基的清除率

由圖8可知，隨著濃度的增大，花色苷和維生素C對(duì)DPPH清除率不斷增強(qiáng)，花色苷濃度較低時(shí)，清除率也是高于維生素C 的。當(dāng)溶液濃度達(dá)到4.8 mg/L 時(shí)，其清除率分別為94.93%和31.31%，相同濃度的紅樹莓花色苷溶液對(duì)DPPH 的清除能力比維生素C 的高。說明紅樹莓花色苷對(duì)DPPH 的清除能力較強(qiáng)，主要原因是由于花色苷為粗提物，成分復(fù)雜多樣，因此花色苷抗氧化的效果優(yōu)于維生素C。

圖8 DPPH自由基清除能力

2.7.4 樹莓花色苷對(duì)羥基自由基的清除能力

由圖9 可知，隨著紅樹莓花色苷和維生素C 濃度的增大，花色苷和維生素C 對(duì)羥自由基的清除率不斷增強(qiáng)，花色苷在低濃度時(shí)，清除率比維生素C 高。當(dāng)溶液濃度達(dá)到5.5 mg/L 時(shí)，其清除率分別為45.83%和22.15%，相同濃度的紅樹莓花色苷溶液對(duì)羥自由基的清除能力是高于維生素C 的。說明紅樹莓花色苷具有較強(qiáng)的對(duì)羥自由基的清除能力，主要原因可能是由于花色苷為粗提物，成分復(fù)雜多樣，因此花色苷抗氧化的效果優(yōu)于維生素C。

圖9 羥基自由基清除能力

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，采用超聲波輔助雙水相法提取紅樹莓花色苷，含量為0.219 mg/g。楊蕙菱[2]采用溶劑法對(duì)紅樹莓花色苷進(jìn)行提取，實(shí)際得到的花色苷含量為0.274 5 mg/g，優(yōu)于河南信陽(yáng)紅樹莓的（0.162 mg/g）。單一用超聲波輔助法，紅樹莓花色苷含量為0.163 mg/g[16]。

相比超聲提取，超聲輔助雙水相系統(tǒng)的提取量更高且節(jié)約耗能。下一步將以多種方法輔助雙水相來研究紅樹莓花色苷的提取工藝，進(jìn)一步提高其含量。紅樹莓花色苷對(duì)DPPH 和羥基自由基的清除能力隨著濃度的增大而增大，用相同濃度的維生素C溶液作對(duì)照，紅樹莓花色苷的清除率是高于維生素C。綜上，超聲輔助雙水相提取紅樹莓花色苷的提取效果較佳，且紅樹莓花色苷有較好的抗氧化性能力，具有開發(fā)潛力。本試驗(yàn)為紅樹莓的深加工提供了一種新途徑。