真武湯治療慢性心力衰竭的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)機(jī)制研究

伍燕宏， 鄭景輝， 朱梓銘， 羅蔚

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西南寧 530011）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是由于心臟結(jié)構(gòu)或功能異常致使心室充盈受阻或射血分?jǐn)?shù)降低的復(fù)雜臨床綜合征[1]，也是心血管疾病發(fā)展進(jìn)程的最終階段。近年來(lái)，心力衰竭患者在全球高達(dá)兩千萬(wàn)人，且仍在繼續(xù)以二百萬(wàn)的速度在遞增。據(jù)《中國(guó)心血管病報(bào)告2017（摘要）》最新發(fā)布統(tǒng)計(jì)，我國(guó)心力衰竭患者已有450萬(wàn)[2]。大量數(shù)據(jù)資料顯示，CHF已嚴(yán)重危及人類健康。西醫(yī)學(xué)認(rèn)為CHF治療以改善心室重塑為主，但總體效果不佳[3]，而中醫(yī)藥治療CHF具有明顯的優(yōu)勢(shì)及鮮明的特色。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為CHF病機(jī)主要包括心氣不足和水濕痰瘀兩方面，治療應(yīng)溫陽(yáng)益氣、化痰逐瘀[4，5]。真武湯源于《傷寒論》，是陽(yáng)虛水泛證CHF治療的常用方劑。但是真武湯治療CHF的機(jī)制尚未明確，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)真武湯治療CHF的機(jī)制進(jìn)行了探討，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料來(lái)源登錄在線中醫(yī)藥生物信息學(xué)分析工具（BATMAN-TCM）（http：//bionet.ncpsb.org/batmantcm/），輸入關(guān)鍵詞“真武湯”，進(jìn)行系統(tǒng)查詢。再?gòu)纳鲜霾樵兊恼嫖錅珒?nèi)容中尋找治療CHF的數(shù)據(jù)，顯示有11種預(yù)測(cè)靶蛋白，具體見(jiàn)圖1。

1.2方法分別利用Metascape對(duì)上述11種預(yù)測(cè)靶蛋白富集總分析，通過(guò)David 6.7在線進(jìn)行基因本體論（GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）信號(hào)通路分析，同時(shí)基于BATMAN-TCM自身的網(wǎng)絡(luò)繪制工具得出疾病——靶點(diǎn)——成分相關(guān)數(shù)據(jù)[6]。

2 結(jié)果

2.1預(yù)測(cè)靶蛋白選取查詢到真武湯治療CHF的預(yù)測(cè)蛋白共有11種，分別是血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）、α2A腎上腺素能受體（ADRA2A）、α2B腎上腺素能受體（ADRA2B）、腎上腺素能β受體激酶1（ADRBK1）、血管緊張素II 1型受體（AGTR1）、鈉鉀ATP酶α1亞基（ATP1A1）、鈉鉀ATP酶α2亞基（ATP1A2）、α1G T型鈣離子通道蛋白（CACNA1G）、α1LT型鈣離子通道蛋白（CACNA1L）、可溶性鳥苷酸環(huán)化酶（GUCY1B3）、腫瘤壞死因子（TNF）。調(diào)整后的P值為2.70E-03。

圖1 BATMAN-TCM系統(tǒng)查詢結(jié)果Figure 1 The search results from BATMAN-TCM

2.2 Metascape分析對(duì)11種預(yù)測(cè)靶蛋白進(jìn)行Metascape熱圖富集總分析及預(yù)測(cè)靶蛋白途徑和通路富集分析。對(duì)于每個(gè)給定的基因列表，本研究都使用以下的本體來(lái)源進(jìn)行路徑和過(guò)程富集分析：KEGG通路、GO生物學(xué)進(jìn)程、靶基因表達(dá)集合、典型通路和蛋白復(fù)合體數(shù)據(jù)庫(kù)（CORUM）。基因組中的所有基因都被用作富集背景。此次收集P＜0.01的項(xiàng)，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子＞1.5（富集因子是觀察到的計(jì)數(shù)與隨機(jī)期望的計(jì)數(shù)之比），并根據(jù)它們的隸屬度相似性將其分組到集群中。因此，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些預(yù)測(cè)靶蛋白與血液循環(huán)、環(huán)磷酸鳥苷酸（cGMP）——蛋白激酶G（PKG）信號(hào)通路、肌肉收縮、心臟收縮、細(xì)胞分泌的調(diào)節(jié)、腎素分泌、脂質(zhì)代謝負(fù)調(diào)控、氮化合物細(xì)胞應(yīng)答有關(guān)。其中血液循環(huán)、cGMP-PKG信號(hào)通路、平滑肌收縮3項(xiàng)占比高。詳見(jiàn)圖2和表1。

2.3 GO富集分析及KEGG通路分析通過(guò)David 6.7在線對(duì)GO富集分析的結(jié)果顯示：這些蛋白主要的生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）分析共47條，P≤0.01有28條，涉及血管收縮的調(diào)節(jié)、平滑肌收縮的調(diào)節(jié)、血壓調(diào)控、糖苷化反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)通路激活表皮生長(zhǎng)因子受體、腎上腺素分泌的負(fù)調(diào)節(jié)、通過(guò)腎上腺素能受體信號(hào)通路激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性、腎素——血管緊張素調(diào)節(jié)全身動(dòng)脈血壓、心臟收縮的負(fù)調(diào)節(jié)、鉀離子通過(guò)質(zhì)膜內(nèi)流、膜復(fù)極化等方面，見(jiàn)圖3。細(xì)胞組件（cellular component，CC）分析顯示 14條，P≤0.05有11條，其預(yù)測(cè)蛋白主要在質(zhì)膜、核內(nèi)體、鈉鉀交換ATP酶復(fù)合體、電壓門控鈣通道復(fù)合體、橫小管、膜的完整成分、閏盤、細(xì)胞外囊泡、質(zhì)膜的完整成分、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、小窩等，見(jiàn)圖4。分子功能（molecular function，MF）分析12條，P≤0.05有11條，預(yù)測(cè)蛋白涉及緩激肽受體結(jié)合、低電壓門控鈣通道活性、α2腎上腺素能受體活性、甾類激素綁定、腎上腺素結(jié)合、鈉鉀交換ATP酶活性、鈉離子綁定、鉀離子結(jié)合、核苷酸綁定、藥物綁定、分子伴侶等功能，見(jiàn)圖5。從數(shù)據(jù)中我們發(fā)現(xiàn)，GO分析生物學(xué)過(guò)程排位靠前的主要是血管調(diào)節(jié)、平滑肌調(diào)節(jié)、血壓調(diào)節(jié)。生細(xì)胞組件分析結(jié)果提示，質(zhì)膜、膜及其組成部分比例較大。分子功能分析結(jié)果提示，核苷酸綁定占比明顯。KEGG通路分析共顯示14條，P≤0.05有12條，其中9條信號(hào)通路與本研究疾病相關(guān)。炎癥相關(guān)通路（1條）：MAPK信號(hào)通路；與神經(jīng)——體液代謝有關(guān)（6條）：心肌細(xì)胞腎上腺素能信號(hào)傳導(dǎo)、腎素分泌、醛固酮的合成與分泌、腎素——血管緊張素系統(tǒng)、近端小管重碳酸鹽吸收、醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收；與心臟功能和血管舒張有關(guān)（2條）：cGMP-PKG信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路。見(jiàn)圖6。

圖2 Metascape熱圖富集總分析Figure 2 Metascape enrichment total analysis

表1 預(yù)測(cè)靶蛋白途徑和通路富集分析Table 1 The predicted target protein pathways and pathway enrichment analysis

圖3 BP分析Figure 3 BP analysis

圖4 CC分析Figure 4 CC analysis

圖5 MF分析Figure 5 MF analysis

圖6 KEGG通路分析Figure 6 KEGG pathway analysis

2.4 “靶點(diǎn)——通路——疾病”網(wǎng)絡(luò)對(duì)BATMANTCM自身預(yù)測(cè)到的候選目標(biāo)（包括已知目標(biāo)）Score cutoff≥124的每種成分，進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析。顯著富集KEGG通路/GO分析/TTD疾病/OMIM疾病，調(diào)整后P＜0.05，獲得“靶點(diǎn)——通路——疾病”網(wǎng)絡(luò)。為清晰呈現(xiàn)，本文僅提供部分“靶點(diǎn)——通路——疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖7，圖中顯示：與心力衰竭疾病相關(guān)的預(yù)測(cè)靶蛋白ADRA2B與神經(jīng)——體液代謝、cGMP-PKG信號(hào)通路有關(guān)。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是依托組學(xué)和大數(shù)據(jù)高速發(fā)展基礎(chǔ)，結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)、網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、藥理學(xué)等多門學(xué)科的交叉互接，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)組學(xué)分析對(duì)基因、靶點(diǎn)、藥物、疾病間復(fù)雜關(guān)系進(jìn)行新藥開發(fā)及新興方法設(shè)計(jì)[7，8]。可以說(shuō)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)打破常規(guī)“一藥、一靶，一病”的局限研究模式，對(duì)復(fù)方藥物“多成分、多路徑、多靶點(diǎn)”的開展提供廣闊前景，尤其是中藥配伍規(guī)律的探索。中藥復(fù)方運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究可更明確中藥治療疾病的機(jī)制，為臨床選擇中藥治療疾病鋪設(shè)了一個(gè)較好的基礎(chǔ)。

圖7 部分“靶點(diǎn)——通路——疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Figure 7 Part“Target-pathway-disease”network

CHF屬于心血管器質(zhì)性疾病中最嚴(yán)重的并發(fā)癥。雖然目前治療遵循“強(qiáng)心”、“利尿”、“擴(kuò)冠”為基礎(chǔ)原則，旨在阻止心肌重構(gòu)過(guò)程的發(fā)展，但仍不能扭轉(zhuǎn)終末期心力衰竭快速進(jìn)展演變的過(guò)程。同時(shí)，西藥對(duì)患者個(gè)體存在差異，出現(xiàn)許多不良反應(yīng)，致使西醫(yī)治療CHF最終束手無(wú)策。真武湯具有強(qiáng)心利水、擴(kuò)血管、改善血液循環(huán)及護(hù)腎之功，其在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中已被證實(shí)[9]。方中：附子溫腎利水，兼暖脾；茯苓、白術(shù)健脾化濕、利水；白芍一者利小便、行水氣，二者柔肝同時(shí)可止腹痛，三者斂陰舒筋；配之生姜溫散兼助附子散寒氣。諸藥配伍共奏溫陽(yáng)利水治療心力衰竭有效[10]。但其治療CHF的機(jī)制尚未明確，因此，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)理論探討真武湯治療CHF的機(jī)制。

本次研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)BATMAN-TCM系統(tǒng)檢索真武湯后，共有11種預(yù)測(cè)靶蛋白，將11種預(yù)測(cè)靶蛋白進(jìn)行David 6.7在線GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析得出，預(yù)測(cè)靶蛋白與血管、平滑肌調(diào)節(jié)，細(xì)胞器、核苷酸結(jié)合關(guān)系較密切。KEGG通路分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些預(yù)測(cè)蛋白基本與神經(jīng)——體液調(diào)節(jié)、信號(hào)通路有關(guān)聯(lián)，且腎素——血管緊張素——醛固酮系統(tǒng)（RAAS）是主要的調(diào)節(jié)機(jī)制，MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生炎癥反應(yīng)影響疾病病理過(guò)程，cGMP-PKG信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路共同調(diào)節(jié)血管收縮及舒張。

RAAS系統(tǒng)主要由神經(jīng)——內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)節(jié)，也是影響CHF預(yù)后的重要因素[11]。預(yù)測(cè)靶蛋白ACE在RAAS中起重要作用，它是ACEI的作用靶點(diǎn)，可將AngI催化水解成AngⅡ，調(diào)節(jié)電解質(zhì)、血壓和體液穩(wěn)態(tài)。機(jī)體AngⅡ被ACE激活后，兒茶酚胺和ALD不斷釋放、分泌，加速膠原沉積及心肌細(xì)胞增殖，致使左心室肥厚、心室重構(gòu)改變，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞快速凋亡，最終促進(jìn)CHF形成。陳亮等[12]研究ACE基因多態(tài)性與老年CHF心室重構(gòu)發(fā)現(xiàn)，ACE DD型水平較Ⅱ型水平高，且DD型組的左室射血分?jǐn)?shù)明顯低于ID型及II型基因組，證明ACE DD型患者血清及心肌內(nèi)ACE活性相對(duì)較高。現(xiàn)學(xué)者一致認(rèn)為造成此現(xiàn)象與ACE DD基因型有關(guān)。孫勇[13]研究ACE多態(tài)性與CHF患者運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，DD/ID型基因患者運(yùn)動(dòng)耐力低的同時(shí)還有較高的對(duì)抗運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練。張博等[14]研究也發(fā)現(xiàn)DD型患者CHF左心室較ID、Ⅱ基因型患者明顯增大，且心功能亦較差，經(jīng)ACEI治療后DD型基因組患者出現(xiàn)良性心室重構(gòu)的逆轉(zhuǎn)，而ID及Ⅱ型基因組患者左心室改善幅度較小，提示ACE DD型基因與CHF發(fā)病率有關(guān)。ADRA2A、ADRA2B兩個(gè)同源亞型屬于α2腎上腺受體（α2-AR），作用機(jī)制是α2-AR選擇性與兒茶酚胺類物質(zhì)識(shí)別結(jié)合后，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘發(fā)CHF病理、生理的多種反應(yīng)[15，16]。預(yù)測(cè)蛋白AGTR1也是RAAS中一個(gè)關(guān)鍵影響因素。在CHF過(guò)程中，因腎血流量灌注減少，AngⅡ與AGTR1受體結(jié)合后，激活磷脂酶C，二磷脂酞肌醇隨之發(fā)生水解，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+快速釋放，從而導(dǎo)致血管收縮，進(jìn)一步使細(xì)胞凋亡，最終誘發(fā)心室重構(gòu)的演變。目前研究學(xué)者認(rèn)為AGTR1影響CHF可能與A1166C等位基因有關(guān)。因此，AGTR1靶蛋白在CHF中的作用仍需進(jìn)一步探究，以期為今后的研究者提供新的突破口。

炎癥反應(yīng)是心血管事件發(fā)生的一個(gè)重要機(jī)制，其活化程度與CHF過(guò)程有關(guān)。MAPK信號(hào)通路是細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、JNK、p38等3條主要通路的集合點(diǎn)，其形成的轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1（AP-1）可間接調(diào)控TNF-α、IL-6等多種炎性因子表達(dá)。李曉等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)ERK/MAPK通路促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，通過(guò)JNK/MAPK通路主要抑制AngⅡ、內(nèi)皮素、兒茶酚胺激活，通過(guò)p38/MAPK通路促進(jìn)白細(xì)胞聚集、活化等共同作用可控制炎性因子的表達(dá)，阻滯CHF發(fā)生。同期，趙欣等[18]在研究TLR4受體/MAPK信號(hào)通路在心源性惡病質(zhì)發(fā)生機(jī)制中的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，JNK/MAPK通路中JNK被SP600125特異性抑制劑阻斷后，抑制組的TNF-α mRNA表達(dá)量降低，說(shuō)明TNF-α與JNK/MAPK通路介導(dǎo)有關(guān)。TNF-α是評(píng)價(jià)炎癥最常用的細(xì)胞因子，在機(jī)體創(chuàng)傷機(jī)制中最早被激活，可產(chǎn)生炎性介質(zhì)，促進(jìn)IL-6因子釋放，擴(kuò)大炎性損傷范圍，加速細(xì)胞壞死[19]。TNF-α被證實(shí)是CHF惡病質(zhì)的主要炎癥因子之一[20]。吳勇進(jìn)等[21]進(jìn)行67名CHF和30名健康人的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，不同心功能等級(jí)的CHF患者左心室射血分?jǐn)?shù)不同程度下降，左心室舒張末期及收縮末期內(nèi)徑亦不同程度升高，其機(jī)制與血清中腦鈉肽（BNP）、TNF-α、MMP-9、IL-6的表達(dá)量有關(guān)。心功能越差炎癥因子水平越高，這為臨床診斷CHF的嚴(yán)重程度提供了很高的參考價(jià)值。紀(jì)煥春等[22]對(duì)60例CHF男性患者的臨床研究證實(shí)TNF-α水平與CHF程度呈正相關(guān)。胡黎文等[23]觀察真武湯聯(lián)合桂枝茯苓丸對(duì)CHF患者炎癥因子表達(dá)情況的影響，發(fā)現(xiàn)真武湯聯(lián)合桂枝茯苓丸可降低CHF患者血清超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、IL-6及TNF-α水平，且均較西醫(yī)常規(guī)組明顯下降，這可能因其可拮抗神經(jīng)——內(nèi)分泌系統(tǒng)過(guò)度激活，從而逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，改善了CHF程度?？梢哉J(rèn)為TNF-α在CHF發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要介導(dǎo)作用[24，25]。

cGMP是細(xì)胞內(nèi)第二信使物質(zhì)，可調(diào)控心血管功能、基因表達(dá)及形態(tài)學(xué)，其中以調(diào)控離子通道為主。而當(dāng)它刺激其下游靶點(diǎn)PKG后可對(duì)抗心肌細(xì)胞凋亡。PKG主要調(diào)控血管平滑肌松弛過(guò)程中多種類型細(xì)胞表達(dá)，其中血小板和內(nèi)皮細(xì)胞最為重要。前期證明，PKG磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（p-VASP）后，可使血管平滑肌舒張[26]。對(duì)于其機(jī)制，現(xiàn)有學(xué)者認(rèn)為，PKG是通過(guò)抑制心肌重塑的病理性Ca2+信號(hào)及其下游鈣調(diào)磷酸酶——活化T細(xì)胞核因子（NFAT）、鈣調(diào)素依賴蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）通路的激活作用，從而參與心臟的重構(gòu)。這與萬(wàn)淼等[27]對(duì)蛋白激酶G對(duì)左室重構(gòu)的影響展開的討論結(jié)果相似?？梢?jiàn)，cGMP-PKG信號(hào)通路主要是通過(guò)調(diào)控Ca2+濃度來(lái)調(diào)節(jié)心臟的收縮舒張功能，從而影響心室重構(gòu)，最終發(fā)展成CHF。另外，鈣信號(hào)通路異?？捎绊懶募〖?xì)胞在舒張期出現(xiàn)Ca2+從肌漿網(wǎng)內(nèi)大量漏出現(xiàn)象，一旦Ca2+失穩(wěn)出現(xiàn)，心肌收縮減弱，CHF將會(huì)加重[28]。儲(chǔ)存在CHF患者心肌細(xì)胞中的肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵（SERCA2α）磷酸化被下調(diào)后可造成Ca2+回收受阻減少[29]，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞遷移、心室重構(gòu)發(fā)生。因此，SERCA2a是目前CHF治療中被視為最有潛力的蛋白。若蘭尼堿受體2（RyR2）Ca2+釋放通道失調(diào)，易促心肌細(xì)胞去極化，誘發(fā)CHF和心律失常[30]。故需保護(hù)RyR2泵的完整，避免Ca2+滲漏，以阻礙CHF發(fā)生。本研究中，本課題組還發(fā)現(xiàn)了 ADRBK1、ATP1A1、ATP1A2、CACNA1G、CACNA1L、GUCY1B3蛋白，它們?cè)贑HF發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中應(yīng)參與的調(diào)控作用尚未被清楚詮釋。

本次研究未能對(duì)基于數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘發(fā)現(xiàn)的真武湯治療CHF的主要靶蛋白進(jìn)行實(shí)驗(yàn)認(rèn)證，此為本研究存在的不足。本研究通過(guò)運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘真武湯治療CHF的蛋白，探討真武湯治療CHF的內(nèi)在機(jī)制，增強(qiáng)了對(duì)其微觀整體的認(rèn)識(shí)，揭示了疾病更深的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，為CHF的發(fā)生、發(fā)展研究奠定了基礎(chǔ)，從未被詮釋的蛋白詮釋其作用機(jī)制無(wú)疑對(duì)后期的實(shí)驗(yàn)研究打開了新空間，開辟了新的方向。