清熱化痰通腑方灌腸對腦梗死合并細菌性肺炎模型大鼠腦、肺、腸組織神經肽的影響

趙亮娟， 鄭雪嘉， 呂軍影， 李凱， 劉霞

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣西南寧 530021）

腦卒中是人類健康的一大殺手，其死亡率和致殘率居高不下[1]。卒中相關性肺炎（strokeassociated pneumonia，SAP）是其常見的一種嚴重并發(fā)癥[2]，為腦卒中急性期或后遺癥期并發(fā)的肺間質及肺實質（包括肺泡壁）感染性炎癥[3]。炎癥反應是腦卒中最重要的病理機制。研究[4，5]發(fā)現(xiàn)，血管活性腸肽（vasoactine intestinal peptide，VIP）和P物質（substance P，SP）是2種作用機制相反的神經遞質性物質。在機體正常情況下，VIP能夠擴張腦、肺血管，松弛支氣管平滑肌，參與炎癥細胞功能的調節(jié)，抑制促炎細胞產生炎癥因子。SP與腦水腫的形成密切相關，可產生多種炎癥因子如白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α），促進局部和全身的炎癥反應。

中醫(yī)藥療法對卒中患者伴有的多種并發(fā)癥可發(fā)揮辨證論治優(yōu)勢，減輕病原體對機體的損害，能更好地改善臨床癥狀，提高臨床療效。清熱化痰通腑方是我科全國名老中醫(yī)藥專家黃李平教授通過總結其多年臨床經驗和學術思想而形成的經驗方，從“腦腸相通”、“腦肺相通”、“肺腸相通”三者論治SAP[6]。本課題組前期臨床研究[7]表明，應用清熱化痰通腑方直腸滴注治療腦病并發(fā)肺部感染患者，可有效減輕炎癥反應，增強抗菌效應，但其作用機制仍有待進一步闡明。

因此，本研究旨在通過觀察清熱化痰通腑方灌腸對腦梗死合并細菌性肺炎大鼠神經功能和腦、肺、腸組織神經肽VIP、SP的影響，從神經肽分泌角度探討該方治療腦梗死合并細菌性肺炎的可能效應機制，以期為臨床應用提供依據(jù)?，F(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康SPF級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠，體質量（220± 20）g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物質量合格證號：SCXK桂2014-0002。所有大鼠均統(tǒng)一飼養(yǎng)于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級實驗動物室，自由飲水和進食，購入后經5 d飼養(yǎng)，待大鼠熟悉實驗環(huán)境后進行造模，造模前12 h禁食不禁水。

1.2藥品與試劑清熱化痰通腑方組成：大黃30 g（后下）、牛膝30 g、瓜蔞仁30 g、枳實20 g、黃芩20 g、石菖蒲20 g、膽南星20 g、芒硝15 g（沖）。藥物總量185 g。以上中藥材飲片均購自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院中藥房。蘇木素——伊紅（HE）染色劑，4%多聚甲醛固定液（均購自北京索萊寶科技有限公司，批號依次為：G1120、P1116）；銅綠假單胞菌標準菌株（10104）由廣西醫(yī)科大學微生物教研室提供（購自中國藥品生物制品檢定所）；PBS緩沖液（購自北京博奧森生物技術有限公司，批號：C01-01001）；大鼠VIP酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（批號：CSB-E08355r）、SP ELISA試劑盒（批號：CSB-E08358r）（均購自武漢華美生物工程有限公司）。

1.3儀器酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；組織切片機（德國Leica公司）；顯微鏡（德國Carl Zeiss公司）；37℃恒溫箱（英國New Brunswick公司）；醫(yī)用-80℃低溫箱（三洋電機株式會社公司）；直徑0.28 mm魚線（北京生化科技有限公司）；無菌注射器（北侖河上海醫(yī)療技術有限公司）；抗凝管（江西精致科技有限公司）；持針器、眼科剪等手術器械（上海醫(yī)療器械有限公司）。

1.4動物分組及給藥將30只SPF級雄性SD大鼠按照隨機數(shù)字表分為空白對照組，模型組，中藥低、中、高劑量組，每組6只。參照標準動物的體表面積等效劑量折算系數(shù)法計算給藥劑量[8]，成人（60 kg）與大鼠（200 g）的換算系數(shù)為6.17，清熱化痰通腑方成人生藥劑量是185 g/d，換算成大鼠的用藥劑量為3.826 g/d≈3.8 g/d，設置大鼠用藥低、中、高劑量分別為1.9、3.8、7.6 g/d。灌腸給藥時，將濃縮藥液按上述低、中、高劑量用無菌生理鹽水配制成等容積藥液8.0 mL后給藥。模型建立24 h后，中藥低、中、高劑量組分別給予1.9、3.8、7.6 g/d清熱化痰通腑方藥液灌腸，模型組給予等量生理鹽水灌腸，1次/d，連續(xù)7 d，空白對照組不予處理。

灌腸給藥方法：參照文獻[9]，用大鼠固定器將大鼠固定，保持頭低位，常規(guī)消毒大鼠肛周，用直徑2 mm、長約15 cm的小兒硅膠灌腸管，一端連接注射器，另一端涂上石蠟油潤滑，由大鼠肛門輕緩插入腸道約6 cm處，緩慢勻速注入藥液，注完藥液后再向管內推入約0.4 mL空氣，然后將大鼠保持頭低位約3 min，同時輕按肛門使之利于藥液灌入同時避免藥液外溢。

1.5腦梗死合并細菌性肺炎大鼠模型的復制參照本課題組前期文獻[10]復制腦梗死合并細菌性肺炎大鼠模型。建模24 h后，符合以下條件的大鼠判斷為建模成功：①出現(xiàn)精神萎靡、進食量減少、飲水增多，毛發(fā)聳立、光澤度差、背部微弓、體質量降低、耳緣靜脈突起加粗、鼻唇分泌液增多；②呼吸急促，肺部聽診可聞及啰音。

1.6大鼠神經功能缺損評分大鼠灌腸給藥7 d后，采用Longa評分法[11]進行神經功能缺損評分：0分，無神經功能缺損癥狀；1分，有輕度神經功能缺損表現(xiàn)，不能完全伸展左側前爪；2分，有中度局灶性神經功能缺損表現(xiàn)，向左側轉圈；3分，有重度局灶性神經功能缺損表現(xiàn)，向左側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識水平下降。評分1～3分計為造模有效，剔除0分及4分大鼠，剔除后在后續(xù)實驗中隨機補充入組，保證每組大鼠的數(shù)目不變。

1.7標本采集與處理灌腸給藥7 d后禁食12 h，水合氯醛腹腔麻醉，腹主動脈取血，非抗凝采血管內靜置2 h，于4℃、2 000 r/min離心15 min，收集上清液，分裝，-80℃保存，用于ELISA法檢測。取肺、直腸組織，一部分置于4%多聚甲醛固定液固定，制備石蠟切片，用于HE染色，一部分裝凍存管保存于-80℃，用于ELISA檢測。取腦組織，加入1 mL 1×PBS溶液，制成組織勻漿，-20℃過夜，反復凍融2次后，4℃、2 000 r/min離心15 min取上清液，分裝-80℃保存，用于ELISA檢測（肺、直腸組織同此處理方法）。以上檢測均嚴格按照相應試劑盒說明書進行。

1.8觀察指標

1.8.1 一般狀況 造模后隔日測量大鼠體質量、體溫，觀察大鼠的被毛、活動狀態(tài)、鼻周分泌物、排便量等一般情況的變化。

1.8.2 HE染色 將制備的肺、直腸組織石蠟切片，依次進行脫蠟，先后加入蘇木素、伊紅染液染色，最后脫水、封片，置于光學顯微鏡下行病理學觀察。

1.8.3 ELISA法檢測血清及腦、肺、腸組織VIP、SP含量 使用Curve Expert 1.3曲線軟件，以標準品的濃度為縱坐標，以標準品的吸光度（OD）值為橫坐標，制作標準曲線。分別測定血清及各組織VIP、SP的OD值，根據(jù)標準曲線計算出VIP、SP含量。

1.9統(tǒng)計方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以均數(shù)±標準差(-x±s)表示，多組比較采用方差分析，組間比較用SNK法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1一般狀況空白對照組大鼠狀態(tài)良好，飲食量穩(wěn)定，被毛光滑，呼吸平穩(wěn)均勻，排便正常，未見明顯異常表現(xiàn)；模型組大鼠造模后出現(xiàn)行動遲緩、飲食量減少、被毛雜亂干枯、弓背、大便量少、質地干硬等現(xiàn)象，還可見鼻周大量分泌物并伴隨打噴嚏、呼吸喘促加重等癥狀；中藥低劑量組大鼠行動遲緩，飲食減少，鼻周見較多分泌物并伴隨打噴嚏，大便量較模型組有所增加但仍有些許干硬；中藥中劑量組大鼠倦怠，飲食稍有增加，鼻周少量分泌物，大便量較低劑量組增加，且軟硬適中；中藥高劑量組大鼠狀態(tài)明顯改善，鼻周分泌物不明顯，大便量較多。

2.2各組大鼠造模后不同時間體質量、體溫比較表1、表2結果顯示：空白對照組大鼠體質量持續(xù)穩(wěn)定增長，體溫基本不變。造模7 d后，模型組大鼠體質量較空白對照組顯著減少（P＜0.01）、體溫顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥低、中、高劑量組大鼠體質量均增加、體溫均降低（P＜0.05或P＜0.01），其中，中藥高劑量組大鼠體質量、體溫與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞ 0.05）。

表1 各組大鼠造模后不同時間體質量比較Table 1 Comparison of the body mass of rats in various groups at different time after modeling（-x±s，m/g）

表2 各組大鼠造模后不同時間體溫比較Table 2 Comparison of the body temperature of rats in various groups at different time after modeling （-x±s，T/℃）

2.3各組大鼠神經功能缺損評分比較表3結果顯示：空白對照組大鼠無神經功能缺損。模型組大鼠神經功能缺損評分明顯高于空白對照組大鼠（P＜0.01）。中藥低、中、高劑量組神經功能缺損評分均低于模型組，呈劑量依賴性，其中，中藥高劑量組大鼠神經功能缺損評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.4各組大鼠肺、腸組織病理學改變

2.4.1 肺組織病理學改變 圖1結果顯示：空白對照組大鼠肺組織結構完整，未見明顯炎性細胞浸潤。模型組大鼠肺泡水腫、充血明顯，肺泡間質增寬，伴有大量炎性細胞浸潤。中藥低、中劑量組大鼠可見肺泡水腫、充血，肺泡間質均增寬，但所浸潤炎性細胞較模型組有所減少；中藥高劑量組大鼠肺泡水腫、充血現(xiàn)象明顯緩解，肺泡間質未見增寬，伴少量散在炎性細胞浸潤。

表3 各組大鼠神經功能缺損評分比較Table 3 Comparison of the neurological deficit scores of rats in various groups (-x±s)

2.4.2 腸組織病理學改變 圖2結果顯示：空白對照組大鼠腸組織結構完整，黏膜無明顯缺損，未見充血、水腫、糜爛等病理改變，黏膜固有層無明顯炎性細胞浸潤。模型組大鼠腸組織有明顯壞死灶，腸壁少數(shù)壞死黏膜組織脫落后形成潰瘍點，大量炎性細胞浸潤黏膜下層。中藥低劑量組和中劑量組大鼠腸組織壞死灶較模型組有所減少，腸壁壞死與潰瘍點有所緩解，但仍有大量炎性細胞浸潤；高劑量組大鼠腸組織壞死及潰瘍較模型組明顯減輕，固有層腺體排列整齊、破壞減少，黏膜層及黏膜下層炎性細胞浸潤較少。

2.5 各組大鼠血清及腦、肺、腸組織中VIP、SP含量情況

2.5.1 各組大鼠血清及腦、肺、腸組織中VIP含量比較 表4結果顯示：與空白對照組比較，模型組大鼠血清及腦、肺、腸組織中VIP含量均降低（P＜0.01）；與模型組比較，各中藥劑量組VIP含量均升高，且呈劑量依賴性。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化（HE染色，×200）Figure 1 Comparison of the pathological features of lung tissues of rats in various groups（HE staining，×200）

圖2 各組大鼠腸組織病理變化（HE染色，×200）Figure 2 Comparison of the pathological features of intestine tissues of rats in various groups（HE staining，×200）

表4 各組大鼠血清及腦、肺、腸組織VIP含量比較Table 4 Comparison of the VIP content in serum，and brain，lung，intestine tissues of rats in various groups[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

表5 各組大鼠血清及腦、肺、腸組織SP含量比較Table 5 Comparison of the SP content in serum，and brain，lung，intestine tissues of rats in various groups[-x±s，ρ/（pg·mL-1）]

2.5.2 各組大鼠血清及腦、肺、腸組織中SP含量比較 表5結果顯示：與空白對照組比較，模型組大鼠血清及腦、肺組織SP含量明顯升高（P＜0.01），腸組織SP含量則顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組血清及腦、肺組織SP含量均降低（P＜0.05或P＜0.01），腸組織SP含量顯著升高（P＜0.01），且呈劑量依賴性，其中，中藥中、高劑量組腸組織SP含量高于空白對照組（P＜0.05或P＜0.01）。

3 討論

腦卒中是嚴重危害人類健康的全球性公害，其起病急驟，變化迅速，轉歸預后常發(fā)生在瞬間，目前已成為我國第一大致殘及第二大死亡原因，而肺炎是導致患者死亡的主要原因。本研究發(fā)現(xiàn)清熱化痰通腑方能夠改善腦梗死合并細菌性肺炎大鼠的一般狀態(tài)、體質量、體溫，促進大鼠排便，減輕肺、腸組織病理學損傷，促進腦神經功能恢復，從而達到腦、肺、腸三者同治的作用。

神經肽（neuropeptide）是體內傳遞信息的生物活性多肽，不僅對神經元起作用，而且對非神經組織或器官也有作用，VIP和SP均歸屬其中。李煥峰等[12]認為VIP因子是存在于中樞神經系統(tǒng)和腸道系統(tǒng)的一種神經遞質，可通過促進缺血區(qū)域周圍血管的再生達到減輕腦缺血損傷的作用；而在消化系統(tǒng)中，VIP既能調節(jié)腸道動力又可調節(jié)腸液分泌，與便秘關系密切。研究[13]表明，在腦梗死大鼠的側腦室注射VIP后，MCAO大鼠腦梗死體積減小，血管新生數(shù)增加，血管內皮生長因子蛋白表達增加，說明VIP能促進神經生長，增加血管內皮生長因子，對腦缺血后的神經再生和神經功能恢復有較好的作用。Wald A[14]通過實驗證實經給人體靜脈注射VIP后，可導致腸液分泌增加，出現(xiàn)嚴重的腹瀉，說明VIP能夠刺激腸道分泌電解質和水液增加。SP則與中樞神經系統(tǒng)的炎癥反應有重要關系，并在便秘和腸炎中發(fā)揮重要作用[15，16]。大鼠缺血性腦卒中后使用SP受體拮抗劑可以抑制SP的分泌，減少大鼠腦水腫，改善血腦屏障通透性和神經功能[17]。本實驗結果顯示，模型組大鼠血清及腦、肺、腸組織VIP含量均較空白對照組明顯下降，血清，腦、肺組織SP水平顯著升高，而腸組織中SP水平明顯降低，并且出現(xiàn)神經功能缺損、行動遲緩、便秘等癥狀。出現(xiàn)此結果的原因可能是模型大鼠腦神經元分泌VIP能力下降，加重繼發(fā)性腦損害，同時，血管周邊神經元損傷使SP增加，引起炎癥介質IL-6的釋放，導致腦組織水腫形成，進一步加重神經功能損害和腦組織炎癥擴大。

那么，卒中后合并肺部細菌侵襲，肺組織VIP下降、SP水平升高，可使肺血管擴張，血管通透性增加，引起炎性滲出，繼而激活肥大細胞、巨噬細胞等釋放IL-6等炎性細胞因子，發(fā)生組織水腫，加重炎癥損害。而在肺部細菌性感染后，肺源性內毒素通過血液循環(huán)、微生態(tài)、淋巴循環(huán)、神經——內分泌等影響相應神經肽水平的變化，又加重了腦和腸組織的免疫炎癥損害。腦組織損傷引起腦——腸軸紊亂，腸道VIP和SP水平降低，導致腸道蠕動功能減弱、腸液分泌減少，大鼠出現(xiàn)便秘。腸道功能紊亂引起腸源性內毒素增多，其通過循環(huán)系統(tǒng)和腦——腸軸反饋調節(jié)腦、肺等組織出現(xiàn)相應腦腸肽的變化，進而再次加重局部組織炎癥和損害。以上分析提示，腦梗死合并細菌性肺炎大鼠腦、肺、腸三者同病，神經內分泌重要物質基礎VIP、SP失調可激活大鼠局部及全身的炎癥反應，而炎癥和炎癥介導的組織損傷又進一步加劇了原發(fā)疾病的功能損害。

卒中相關性肺炎屬中醫(yī)學“肺熱”、“喘證”等范疇。中風后患者出現(xiàn)咳嗽、咳痰、發(fā)熱等癥狀，醫(yī)家多以痰熱郁肺或邪熱壅肺論治[18]。本研究中的清熱化痰通腑方是黃李平教授通過病證結合總結出來的“腦肺同治、腦腸同治、肺腸相通”學術思想的結晶。因肺與大腸相表里，黃李平教授認為腦卒中合并肺部感染的患者需通利大腸，使腸腑氣機通暢，達到通腑治肺、通腑治腦，腦、肺、腸三者同治的效果。方中以通腑之要藥大黃為君藥，瀉下攻積、清熱解毒、活血逐瘀，臣藥芒硝瀉下軟堅、清熱除濕，枳實破氣消積、化痰除痞，三者相輔相成，可達瀉熱通腑之效。佐以黃芩清熱燥濕、涼血解毒，瓜蔞仁清熱滌痰、寬胸散結、潤燥滑腸，膽南星清熱化痰，石菖蒲芳香化濕、開竅豁痰。牛膝活血通經、引火（血）下行為使藥。現(xiàn)代研究表明，大黃、芒硝、枳實均有調節(jié)胃腸功能、抗炎、抗病原微生物等藥理作用，大黃與芒硝配伍能夠抑制IL-6、IL-1、TNF-α等促炎因子的釋放，提高抑炎因子IL-10含量，從而調節(jié)促炎和抗炎因子的平衡，保護胃腸道黏膜[19，20]。黃芩具有抗菌作用[21]。膽南星有祛痰和抗驚厥、鎮(zhèn)靜的藥理作用[22]。而瓜蔞中的有效成分對多種細菌有很強抑制作用[23]，可促進骨髓中T淋巴細胞前體轉化為成熟的T淋巴細胞，提高細胞免疫，減輕炎癥，減少分泌物，有很好的祛痰作用[24]。石菖蒲揮發(fā)油具有化痰平喘的作用[25]。本研究應用清熱化痰通腑方對模型大鼠進行干預后，結果發(fā)現(xiàn)：中藥各劑量組大鼠一般狀況均明顯改善，神經功能缺損評分下降，高劑量治療組大鼠恢復最好，接近空白對照組水平。HE染色結果顯示，中藥各劑量組肺、腸組織病理性改變和炎性細胞浸潤情況均較模型組明顯改善，尤以高劑量組最佳。說明清熱化痰通腑灌腸可有效治療腦梗死合并細菌性肺炎大鼠。

另外，ELISA結果顯示，中藥各劑量組大鼠血清，腦、肺組織中VIP升高，SP含量降低，腸組織VIP、SP升高，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。說明清熱化痰通腑方腸道給藥通過上調腸組織VIP、SP水平，促進腸蠕動和腸液分泌，達到通腑的作用；清熱化痰通腑方可能經腦——腸軸上調腦組織VIP水平、下調SP含量，促進腦血管再生，減輕腦水腫，恢復腦神經功能，起到通腑治腦的作用，同時，清熱化痰通腑方可能通過上調血清和肺組織中VIP含量、下調SP水平，從而抑制巨噬細胞和肥大細胞分泌促炎因子IL-6等減輕肺部炎癥，起到通腑治肺的作用。

綜上所述，清熱化痰通腑方灌腸給藥治療腦梗死合并細菌性肺炎大鼠，能夠減輕腦、肺、腸各組織及全身炎癥反應，減輕腦水腫，促進神經功能恢復，尤以高劑量組效佳，其機制可能是通過調節(jié)體內神經肽VIP、SP的含量而發(fā)揮作用。