中國荷斯坦牛HH4遺傳缺陷單倍型分子篩查

李艷華，呂小青，劉林，麻柱

（北京奶牛中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶牛遺傳育種與繁殖重點實驗室/奶牛遺傳育種與繁殖北京市重點實驗室，北京 100192）

在奶牛育種中，由于基因組選擇等現(xiàn)代分子育種技術的應用，在極大地提高選擇準確性的同時，也提高了選擇強度。由于人工授精（AI）等繁殖生物技術的應用，使部分優(yōu)秀種公牛得到廣泛使用，增加了群體的近交系數(shù)，降低了群體有效含量，隱性基因純合的概率加大，使缺陷基因在奶牛群體中不斷涌現(xiàn)。隨著基因組學研究的不斷深入和高通量測序技術的迅猛發(fā)展，對奶牛隱性遺傳缺陷的挖據(jù)、鑒定與剔除速度不斷加快。

近年來，在荷斯坦牛群中不斷發(fā)現(xiàn)了許多有害單倍型或致死突變，其中大多數(shù)影響奶牛繁殖效率或增加胚胎死亡率，是新近在牛群中出現(xiàn)的隱性遺傳缺陷的新形式。當這些有害單倍型隱性純合時，就會表現(xiàn)出不同類型的臨床癥狀，如胚胎早期死亡等，是奶牛群繁殖健康的隱性殺手，嚴重影響著奶牛養(yǎng)殖者的經(jīng)濟效益[1～3]。

Fritz等[2]利用法國基因組選擇數(shù)據(jù)庫中47 878頭荷斯坦牛、16 833頭蒙貝利亞牛和11 466頭諾曼底牛的Illumina 50k 芯片分型數(shù)據(jù)，鑒定到34個在成活的個體中有明顯缺陷的純合子常見單倍型（頻率大于1%），每種單倍型均可能攜帶有害突變。數(shù)據(jù)分析表明，34個單倍型中有9個對繁殖性狀有顯著影響，其中包括6個新鑒定的單倍型：HH4、HH5、HH6、MH1、MH2和NH5。按照這種單倍型的命名慣例，第一個字母表示品種，第二個字母H表示單倍型，然后是順序號。VanRaden等[4]于2011年首次報道了3種單倍型：HH1、HH2和HH3，F(xiàn)ritz等[2]又命名了14個新荷斯坦牛單倍型HH4～HH17。

單倍型4（Holstein Haplotype 4，HH4）的致病機理是1號染色體上的GART（Glycinamide Ribonucleotide Transformylase，甘氨酰核糖核苷酸轉化酶）基因g.1277227A＞C突變，導致編碼區(qū)的天冬酰胺突變?yōu)樘K氨酸（p.N290T），突變后致使GART基因功能喪失，阻礙了生物體中的嘌呤合成，最終導致胚胎在妊娠早期死亡[2]。本研究旨在對HH4單倍型在我國荷斯坦牛群中攜帶情況進行摸底篩查，以掌握HH4單倍型在奶牛群中分布情況，為奶牛群的選種選配提供依據(jù)，為今后我國奶牛育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料來自北京地區(qū)332頭種公牛凍精樣品及分布在24個奶牛場的1 151頭荷斯坦母牛血液樣品，采用高鹽法從牛凍精中提取基因組DNA[5]，采用試劑盒從血液中提取基因組DNA，然后使用微量核酸測定儀檢測DNA質量，要求光密度比值OD260/OD280在1.8～2.1之間、OD260/OD230大于2.0、濃度均在100ng/μL以上為合格。

1.2 基因分型檢測

本研究選取MALDI-TOF-MS（基質輔助激光解析串聯(lián)飛行時間質譜）檢測技術對HH4單倍型進行基因分型。

1.2.1 引物設計及PCR擴增

根據(jù)GenBank上牛AC_000158.1 (1265743..1292033)序列，利用AssayDesigner 3.1軟件設計特異性PCR引物。F/R:ACGTTGGATGTGAAGGTGTCCTCTATGCTG/ACGTTGGATGTTACTCACTTGGCACTCTGG；單堿基延伸引物：TCACCGAAACGGCAA。擴增引物的終濃度為100μM，延伸引物的終濃度為500μM。

PCR反應體系為：ddH2O1.8μL，10×PCR Buffer 0.5μL，MgCl2（25mM）0.4μL，dNTP Mix（25mM）0.1μL，Primer Mix（0.5μM）1μL，HotStar Taq（5U/μL）0.2μL，混合試劑按每孔4μL加到384個孔板中，模板加入體積為1μL，保證總的反應體積為5μL。

擴增PCR反應程序為：94℃ 15min；94℃ 20s，56℃ 30s，72℃ 1min，45個循環(huán)；72℃ 3min；4℃保存。PCR反應完成后進行電泳，吸取2μL上樣緩沖液，1μL PCR產(chǎn)物，設定電壓為110V，電流為75mA，40min后觀察結果，如結果良好可繼續(xù)SAP反應。

1.2.2 SAP反應

在PCR產(chǎn)物中加入2μL堿性磷酸化酶（SAP，Sequenom）消化液：ddH2O1.53μL、緩沖液0.17μL、SAP 0.474U，以除去未用盡的dNTP，保證下一步單堿基延伸的正確性。此反應程序為：37℃40min，85℃ 5min，4℃保存。

1.2.3 單堿基延伸反應及檢測

單堿基延伸反應體系：ddH2O 0.619μL，iPLEX Buffer Plus 0.20μL，iPLEX Termination mix 0.20μL，iPLEX Extend Primer Mix 0.94μL，iPLEX Enzyme 0.041μL。反應條件：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s，40個循環(huán)；80℃ 5s，5個循環(huán)；72℃ 3min；4℃保存。在終止反應物中加入陽離子交換樹脂脫鹽導入Assay中，樣本輸入、建板、點樣，然后進行Mass Assay分析，質控并收集最終數(shù)據(jù)。

2 結果

利用飛行時間質譜技術對北京地區(qū)332頭荷斯坦公牛和1 051頭荷斯坦母牛進行了HH4單倍型分型檢測，結果顯示，所有樣本均為AA基因型正常個體，未檢測到攜帶者個體。分型散點圖如圖1所示。

圖1 GART基因分型散點圖

由圖1可見，通過Sequenom MassArray平臺對GART基因進行分型檢測，在群體中僅檢測到一種基因型——AA型，在90°密集分布，且無檢測個體偏離正常的分布區(qū)域外，說明檢測結果準確、可靠。

3 討論

HH4是新近在荷斯坦牛群中發(fā)現(xiàn)的一種隱性致死單倍型，當HH4單倍型隱性純合時，可導致奶牛胚胎早期致死，影響奶牛繁殖效率。2013年，F(xiàn)ritz等[2]報道了HH4遺傳缺陷單倍型在法國荷斯坦牛群體中的頻率為3.6%。如果攜帶者公牛與疑似攜帶者母牛交配，那么青年母牛妊娠率降低5.80%，經(jīng)產(chǎn)母牛妊娠率降低1.74%，嚴重影響奶牛繁殖性能，可給奶牛養(yǎng)殖者帶來巨大經(jīng)濟損失。而HH4單倍型在美國牛群中基因頻率較低，僅為0.37%[6]，說明該遺傳缺陷單倍型在不同國家分布差異較大，其影響也是不同的。

本研究對北京地區(qū)332頭荷斯坦種公牛和1 151頭荷斯坦母牛進行了HH4篩查，未檢測到HH4攜帶者個體，說明北京地區(qū)的荷斯坦牛群基本不受HH4單倍型影響或影響很小，在奶牛場選種選配的時候可以不予考慮。勞蘭蘭等[7]研究表明，通過對國內466頭荷斯坦種公牛進行篩查，發(fā)現(xiàn)6頭攜帶者，均可以追溯到共同祖先法國名牛Besne Buck（注冊號：HOFRAM4486041658），提示我國荷斯坦牛群體中HH4缺陷單倍型是在遺傳物質的引進過程中帶入的。據(jù)該研究報道，國內種公牛HH4攜帶率僅為1.2%左右[7]，進一步印證了該缺陷單倍型在我國荷斯坦牛群中頻率較低，這可能是由于我國近年來主要從北美及澳大利亞等國引進種牛遺傳物質，而從歐洲引入遺傳物質較少。

雖然HH4單倍型在我國荷斯坦牛群中攜帶率較低，對奶牛養(yǎng)殖影響不大，但其他新發(fā)現(xiàn)的單倍體如HH1、HH3、HH5～HH7等在我國牛群中的攜帶情況尚不清楚，建議繼續(xù)開展相關研究，以摸清這些新遺傳缺陷單倍型在我國荷斯坦牛群中的分布情況，進一步指導奶牛群的選種選配及改良計劃。

4 結論

本研究利用飛行時間質譜技術對北京地區(qū)全部荷斯坦公牛（332頭）及部分良種母牛（1151頭）的HH4單倍型攜帶情況進行了篩查，結果表明，在所檢測的奶牛群體中，未檢測到HH4缺陷單倍型存在，其攜帶率為0。結果表明，北京地區(qū)的荷斯坦牛群不受HH4單倍型影響或影響很小，在進行選種、選配的時候可以不予考慮。但是在進口種牛遺傳物質時，應關注HH4攜帶情況，避免將該缺陷單倍型引入到我國荷斯坦牛群中，給我國奶牛養(yǎng)殖帶來潛在危害。