持續(xù)熱應(yīng)激對荷斯坦牛和西荷雜交牛生理指標(biāo)和機體代謝的影響

王澤棟，張林，李燁青，曾涵芳，朱靖，妥生海，韓兆玉

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095）

荷斯坦牛具有產(chǎn)奶量高、耐寒卻不耐熱的特點，高溫高濕的環(huán)境極易引起其熱應(yīng)激反應(yīng)，造成健康狀況差、繁殖力低和高淘汰率等問題[1～5]，給養(yǎng)殖業(yè)帶來經(jīng)濟損失。我國南方地區(qū)為亞熱帶季風(fēng)氣候，夏季高溫高濕，極端氣溫高達39.7℃，年平均降水量高達1 106mm，極易造成奶牛熱應(yīng)激。為了減少奶牛熱應(yīng)激的發(fā)生，奶牛養(yǎng)殖業(yè)已在營養(yǎng)調(diào)控[6]、飼養(yǎng)管理等方面[7～9]投入了大量精力，但成效有限。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)奶牛的長期品種內(nèi)選育是造成奶牛熱敏感性上升、耐熱性能下降的重要原因之一，因此，通過多品種雜交選育兼顧產(chǎn)奶量和耐熱性的奶牛新品系可能是解決這一問題的重要途徑。經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，西門塔爾牛具有耐熱、耐粗飼、乳脂高、使用年限長、繁殖力強等特點，屬乳肉兼用型牛。據(jù)報道，荷斯坦牛與西門塔爾牛的雜交后代表現(xiàn)出很好的遺傳互補和雜種優(yōu)勢，特別是耐熱性、繁殖性能和乳品質(zhì)方面表現(xiàn)突出[10～12]。因此，本研究以荷斯坦牛和西荷雜交牛為研究對象，通過檢測試驗牛生理生化、抗氧化指標(biāo)和HSP70的變化，探索不同奶牛品種對長期熱應(yīng)激的生理響應(yīng)，以期為緩解南方地區(qū)奶牛熱應(yīng)激和選育耐熱性能優(yōu)良的奶牛品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

本試驗在南京衛(wèi)崗乳業(yè)西崗奶牛場進行，選擇18月齡健康的中國荷斯坦牛和西荷雜交牛各8頭作為研究對象。其中，西荷雜交牛為西門塔爾牛（父本）和荷斯坦牛（母本）的雜交一代牛。飼養(yǎng)試驗從4月初持續(xù)到8月底，跨越非熱應(yīng)激至熱應(yīng)激后期，從中選4個階段采樣測定各項指標(biāo)，分別為：非熱應(yīng)激期（4月1～3日）、熱應(yīng)激初期（6月1～3日）、熱應(yīng)激中期（7月16～18日）和熱應(yīng)激后期（8月26～28日）。試驗期間牛群統(tǒng)一舍飼散養(yǎng)，自由采食和飲水，日糧營養(yǎng)水平參照南京衛(wèi)崗乳業(yè)西崗牧場飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 測定指標(biāo)

1.2.1 牛舍溫濕指數(shù)（THI）

試驗期間分別測定牛舍的溫度和濕度，每個階段連續(xù)測定3d。在牛舍中部和四周距地面高1.5m的地方分別懸掛溫濕度表，每天8:00、14:00和20:00分別讀取牛舍的溫度（T，℃）和相對濕度（RH，%），并利用公式[13]計算THI，THI＝（1.8×T+ 32）-（0.55-0.55×RH）×（1.8×T-26）。

1.2.2 直腸溫度和呼吸頻率

在試驗期每階段的第3天，分別用獸用體溫計和秒表測定兩組牛的直腸溫度和呼吸頻率。

1.2.3 血清指標(biāo)

在試驗期每階段的第3天，對兩組牛進行尾靜脈采血（10mL）。血液樣品靜置1h后，經(jīng)3 000r/min離心15min，收集血清并置于-20℃下保存待測。

采用全自動生化分析儀和酶標(biāo)儀測定血清指標(biāo)。檢測指標(biāo)包括總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、葡萄糖（GLU）、乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、Na+、Cl-、K+、Ca2+、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、皮質(zhì)醇（COR）和熱休克蛋白-70（HSP70）。試劑盒均購自南京建成生物工程所。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2010初步整理后，用SPSS 20.0的GLM程序進行統(tǒng)計分析，多重比較采用Duncan法。結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 試驗牛舍環(huán)境溫濕指數(shù)

研究[13]認(rèn)為，當(dāng)牛舍環(huán)境THI低于72時，奶牛不會出現(xiàn)熱應(yīng)激；當(dāng)THI在72～78之間時，奶牛會出現(xiàn)輕微熱應(yīng)激；當(dāng)THI在78～88之間時，奶牛會出現(xiàn)中度熱應(yīng)激；當(dāng)THI在89～98之間時，奶牛會出現(xiàn)極嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激；當(dāng)THI大于98時，奶牛將會死亡。由表1可知，在非熱應(yīng)激期，牛舍的日平均溫度為17.33℃，相對濕度為49.67%，THI值為61.74，此環(huán)境下試驗牛不會產(chǎn)生熱應(yīng)激。在熱應(yīng)激前期，牛舍的日平均溫度為28.78℃，相對濕度為46.44%，THI值為76.19，此環(huán)境下奶牛會出現(xiàn)輕微熱應(yīng)激；熱應(yīng)激中期時，牛舍的日平均溫度達到32℃，相對濕度為47.11%，THI值為80.41，此環(huán)境下奶牛會出現(xiàn)中度熱應(yīng)激；熱應(yīng)激后期時，牛舍的日平均溫度為27.78℃，相對濕度為52.78%，THI值為75.71，此環(huán)境下奶牛會出現(xiàn)輕微熱應(yīng)激。

表1 牛舍環(huán)境的溫濕指數(shù)

2.2 熱應(yīng)激對試驗牛生理指標(biāo)的影響

表2 熱應(yīng)激對試驗牛直腸溫度和呼吸頻率的影響

由表2可知，和非熱應(yīng)激期相比，當(dāng)出現(xiàn)熱應(yīng)激時，荷斯坦牛的直腸溫度和呼吸頻率均顯著升高（P＞0.05）；西荷雜交牛的呼吸頻率顯著升高（P＞0.05），而直腸溫度變化不顯著（P＞0.05）。此外，在整個熱應(yīng)激期，西荷雜交牛的呼吸頻率均顯著低于荷斯坦牛（P＞0.05）。結(jié)果表明，持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛的直腸溫度和呼吸頻率的動態(tài)變化；而西荷雜交牛能夠更好地維持直腸溫度和呼吸頻率的穩(wěn)定。

2.3 熱應(yīng)激對試驗牛血清生化指標(biāo)的影響

表3 熱應(yīng)激對試驗牛血清生化指標(biāo)的影響

由表3可知，和非熱應(yīng)激期相比，整個熱應(yīng)激期內(nèi)荷斯坦牛和西荷雜交牛的TP、GLB、ALT和AST的含量均逐漸降低（P＜0.05）。其中，ALB的含量先降低，升高到非熱應(yīng)激期水平后又顯著降低（P＜0.05）；GLU的含量逐漸降低，熱應(yīng)激后期時又升高到熱應(yīng)激前期水平，但整個熱應(yīng)激期均低于非熱應(yīng)激期（P＜0.05）。整個熱應(yīng)激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的LDH含量均顯著增加（P＜0.05），其中熱應(yīng)激前期西荷雜交牛的LDH顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。同時，整個熱應(yīng)激期CK無顯著變化（P＜0.05），但均低于非熱應(yīng)激期（P＜0.05）。和非熱應(yīng)激期相比，整個熱應(yīng)激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的ALP含量均降低（P＜0.05），其中荷斯坦牛的ALP含量先降低后升高，而西荷雜交牛的ALP含量逐漸降低。此外，結(jié)果還顯示，熱應(yīng)激中期和后期西荷雜交牛的GLB和AST顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）；熱應(yīng)激前期和后期西荷雜交牛的ALT顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；熱應(yīng)激中期西荷雜交牛的ALP顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05），而到熱應(yīng)激后期時則顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。結(jié)果表明，持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清生化指標(biāo)的動態(tài)變化，其中GLB、ALT、AST和ALP兩品種間有顯著差異。

2.4 熱應(yīng)激對試驗牛血清離子水平的影響

由表4可知，和非熱應(yīng)激期相比，熱應(yīng)激中期和后期荷斯坦牛和西荷雜交牛血清Na+含量均顯著升高（P＜0.05）。在整個熱應(yīng)激期，荷斯坦牛和西荷雜交牛的Cl-逐漸升高，而Ca2+含量先升高后降低，但和非熱應(yīng)激期相比均無顯著差異（P＜0.05）。和非熱應(yīng)激期相比，熱應(yīng)激期荷斯坦牛血清K+含量隨時間推移先降低后升高（P＜0.05），而西荷雜交牛無顯著變化（P＜0.05）。結(jié)果表明，持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清離子的動態(tài)變化，但兩組牛間無顯著差異。

表4 熱應(yīng)激對試驗牛血清離子的影響 (mmol/L)

2.5 熱應(yīng)激對試驗牛血清抗氧化指標(biāo)影響

由表5可知，和非熱應(yīng)激期相比，處于熱應(yīng)激期時荷斯坦牛和西荷雜交牛的T-AOC和SOD均先升高后降低（P＜0.05）；MDA先降低后升高（P＜0.05）。和非熱應(yīng)激期相比，熱應(yīng)激期荷斯坦牛的GSH-PX升高后降低（P＜0.05），而西荷雜交牛無顯著差異（P＜0.05）。此外，結(jié)果還顯示，熱應(yīng)激前期西荷雜交牛的T-AOC和SOD顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；熱應(yīng)激后期西荷雜交牛的GSH-PX和SOD顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05），而西荷雜交牛的MDA顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。結(jié)果表明，持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清抗氧化指標(biāo)的動態(tài)變化，而西荷雜交牛的抗氧化能力優(yōu)于荷斯坦牛。

表5 熱應(yīng)激對試驗牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

2.6 熱應(yīng)激對試驗牛血清內(nèi)分泌激素和HSP70的影響

圖1 熱應(yīng)激對試驗牛血清COR和HSP70的影響

由圖1可知，和非熱應(yīng)激期相比，熱應(yīng)激期荷斯坦牛和西荷雜交牛的COR均顯著降低（P＜0.05），且先降低后升高；其中熱應(yīng)激前期兩組牛的COR顯著低于熱應(yīng)激后期（P＜0.05）。和非熱應(yīng)激期相比，熱應(yīng)激前期和中期時荷斯坦牛和西荷雜交牛的HSP70含量均顯著升高（P＜0.05），在熱應(yīng)激后期又降低至非熱應(yīng)激水平。此外，結(jié)果顯示，非熱應(yīng)激期、熱應(yīng)激前期和中期時西荷雜交牛的COR顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05）；熱應(yīng)激前期、中期和后期西荷雜交牛的HSP70均顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05）。結(jié)果表明，持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境會引起荷斯坦牛和西荷雜交牛血清中COR和HSP70的動態(tài)變化，而西荷雜交牛在長期熱應(yīng)激狀態(tài)下具有較好的耐熱性能。

3 討論

3.1 持續(xù)熱應(yīng)激對試驗牛生理指標(biāo)的影響

家畜通過自身機制的調(diào)節(jié)可使其直腸溫度在一定的范圍內(nèi)上下波動。當(dāng)奶牛處于熱應(yīng)激狀態(tài)時，直腸溫度會逐漸升高，奶牛的行為和生理生化指標(biāo)也將會發(fā)生相應(yīng)的變化。本研究結(jié)果表明，熱應(yīng)激中期荷斯坦牛的直腸溫度顯著高于非熱應(yīng)激期（P＜0.05）；在整個試驗期西荷雜交牛直腸溫度均無顯著變化。牛在正常情況下的呼吸頻率為20次/min，廖曉霞等[14]指出，當(dāng)奶牛處于輕度熱應(yīng)激時，呼吸頻率為50～60次/min；中度等熱應(yīng)激時呼吸頻率為80～120次/min；嚴(yán)重?zé)釕?yīng)激時，呼吸頻率可達120～160次/min。這與本試驗結(jié)果基本一致，本研究發(fā)現(xiàn)，與非熱應(yīng)激期相比，熱應(yīng)激早期荷斯坦牛呼吸頻率升高了57.26%，西荷雜交牛升高了40.17%；熱應(yīng)激中期荷斯坦牛呼吸頻率升高了99.97%，西荷雜交牛升高了92.96%；熱應(yīng)激后期荷斯坦牛呼吸頻率升高了47.25%，西荷雜交牛升高了41.09%。另一方面，本研究結(jié)果表明，西荷雜交牛的呼吸頻率顯著低于對應(yīng)時期的荷斯坦牛（P＜0.05），且增長幅度小。有報道稱呼吸頻率過快必然導(dǎo)致奶牛心臟負荷增加，導(dǎo)致血液中CO2分壓下降，從而誘使機體發(fā)生呼吸性堿中毒[15]。由此表明，西荷雜交牛較適宜在熱應(yīng)激環(huán)境下生存，其耐熱性能優(yōu)于荷斯坦牛。

3.2 持續(xù)熱應(yīng)激對試驗牛血清生化指標(biāo)的影響

ALP是一種反映成骨細胞活性、骨生成狀況和鈣磷代謝的重要指標(biāo)[16]，ALP活性降低意味著 ATP的分解減少，伴隨著血鈣和血磷含量減少。Perana等[17]研究結(jié)果表明，在熱應(yīng)激環(huán)境下ALP降低，這與本研究結(jié)果一致。CK是與細胞內(nèi)能量運轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶[18]，非熱應(yīng)激和熱應(yīng)激時期西荷雜交牛的CK比荷斯坦牛高，但差異不顯著。GLU作為重要的營養(yǎng)性單糖，是動物代謝活動快速供能最有效的營養(yǎng)素。Scharf等[19]報道，急性熱應(yīng)激時肉牛血清GLU含量會升高，而慢性熱應(yīng)激時則會降低。血清中TP、ALB含量直接反映了動物機體蛋白質(zhì)代謝的代謝狀況。蛋白質(zhì)代謝良好時，血清中TP、ALB含量較低。本研究中,奶牛在夏季因氣候變化所引起的熱應(yīng)激當(dāng)屬于慢性熱應(yīng)激, 在該熱應(yīng)激期的3個階段, 試驗牛血液中的GLU含量均呈現(xiàn)顯著下降，TP含量顯著下降，且西荷雜交牛TP含量下降程度更明顯，這說明熱應(yīng)激對奶牛GLU代謝的影響更大，而西荷雜交牛蛋白質(zhì)代謝優(yōu)于荷斯坦牛。本研究還發(fā)現(xiàn)荷斯坦牛和西荷雜交牛熱應(yīng)激狀態(tài)下血清LDH顯著升高（P＜0.05），且西荷雜交牛在熱應(yīng)激前期LDH水平顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05）。原因可能是LDH參與了無氧酵解，LDH可能導(dǎo)致機體乳酸水平增加，引起酸中毒，而酸中毒會影響呼吸，使機體出現(xiàn)呼吸功能障礙，致機體缺氧。然而在此情況下，為保證中樞神經(jīng)、心臟等重要器官的供氧，其他組織極可能在缺氧情況下采取無氧酵解方式供能。而無氧酵解運動增強時，又會使機體LDH升高，這說明西荷雜交?？顾嶂卸灸芰娪诤伤固古?，抗熱應(yīng)激能力更強。

3.3 持續(xù)熱應(yīng)激對試驗牛血清離子水平的影響

微量元素是機體必需的組成成分，對調(diào)節(jié)機體體液的pH值和維持穩(wěn)定的滲透壓具有重要的作用；另外，微量元素對應(yīng)激反應(yīng)中激素的合成和分泌、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、抗氧化以及免疫功能發(fā)揮都有重要作用[20～22]。血清中無機離子含量對牛的正常生理代謝具有重大意義。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激期間，荷斯坦牛和西荷雜交牛血清Cl-均顯著升高，其原因可能是在熱應(yīng)激早期，由于環(huán)境溫度變化，引起機體呼吸中樞興奮，使得呼吸頻率加快，血液CO2濃度下降，導(dǎo)致呼吸性堿中毒，從而使得腎分泌碳酸氫鹽的能力增強，腎小管對Cl-的吸收增加，最終導(dǎo)致血清中Cl-含量增加[23]。這與Arad等[24]研究的熱應(yīng)激對雞血清電解質(zhì)含量影響的結(jié)果基本一致，說明熱應(yīng)激影響了機體電解質(zhì)平衡。

3.4 持續(xù)熱應(yīng)激對試驗牛血清抗氧化指標(biāo)的影響

正常生理狀態(tài)下，機體自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡[25]。平衡一旦被打破，過高的自由基將會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物反應(yīng)，產(chǎn)生丙二醛(MDA)，從而造成細胞損傷。SOD是一種含有金屬元素的活性蛋白酶，能及時修復(fù)因自由基造成的損傷，是機體清除自由基的首要物質(zhì)。GSH-PX是機體內(nèi)一種重要的過氧化物分解酶，能還原有毒的過氧化物，從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。劉吉生等[26]研究證明，機體T-AOC活性越高，對自由基清除能力越強，機體發(fā)生氧化損傷的幾率就越低。本試驗研究發(fā)現(xiàn)非熱應(yīng)激期和持續(xù)熱應(yīng)激階段對西荷雜交牛和荷斯坦牛抗氧化能力的影響類似；熱應(yīng)激早期西荷雜交牛的TAO-C、SOD活性均顯著高于荷斯坦牛（P＜0.05），在熱應(yīng)激后期西荷雜交牛MDA水平顯著低于荷斯坦牛（P＜0.05），而GSH-PX和SOD水平顯著高于荷斯坦牛。由此可知，西荷雜交牛相比荷斯坦牛對自由基的清除能力及還原過氧化物的能力更強，故前者的抗氧化能力在熱應(yīng)激期高于后者。

3.5 持續(xù)熱應(yīng)激對試驗牛血清內(nèi)分泌激素和HSP70的影響

腎上腺是動物體內(nèi)對環(huán)境溫度(尤其是高溫)最為敏感的內(nèi)分泌腺。下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸(HPA)的激活并引起的糖皮質(zhì)激素(皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、皮質(zhì)素)分泌量增加，都是應(yīng)激反應(yīng)最重要的特征。COR是腎上腺皮質(zhì)合成分泌的一種類固醇激素，參與機體多種代謝過程，有利于組織的修復(fù)。本試驗結(jié)果表明，持續(xù)熱應(yīng)激導(dǎo)致荷斯坦牛和西荷雜交牛血清中COR含量顯著下降，這與宋小珍等[27]研究的熱應(yīng)激對肉牛血清內(nèi)分泌激素含量影響的結(jié)果基本一致。本試驗還發(fā)現(xiàn)非熱應(yīng)激期、熱應(yīng)激前期和熱應(yīng)激中期西荷雜交牛的COR顯著高于荷斯坦牛。Alderman等[28]報道，HSP70與環(huán)境溫濕度變化密切相關(guān)，在生物熱耐受中起著主要作用。在環(huán)境變化應(yīng)激時，產(chǎn)生的HSP70可以增強細胞對下一次有害損傷的耐受程度，維持細胞的正常生理功能代謝，提高細胞生存率。陳強等[29]報道，熱應(yīng)激狀態(tài)時，奶牛體內(nèi)HSP70基因的表達量會增加，說明HSP70基因的表達對機體耐熱力的產(chǎn)生有重要的作用。HSP70在正常細胞內(nèi)表達量較低或者不表達，但是在熱應(yīng)激或者其他應(yīng)激源的作用下，表達量迅速增加。本試驗結(jié)果顯示，熱應(yīng)激期間西荷雜交牛的HSP70顯著高于荷斯坦牛，顯示了西荷雜交牛具有的耐熱性。

4 結(jié)論

綜上所述，持續(xù)熱應(yīng)激環(huán)境對荷斯坦牛和西荷雜交牛的生理指標(biāo)和機體代謝的影響是相似的，而西荷雜交牛在長期熱應(yīng)激狀態(tài)下可表現(xiàn)出較好的耐熱性能。