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    轉(zhuǎn)幾丁質(zhì)酶基因甜瓜植株的獲得及生物學(xué)鑒定

    2019-09-12 06:10:10楊晉明杜建中
    關(guān)鍵詞:幾丁質(zhì)白粉病甜瓜

    楊晉明,王 銘,杜建中

    (山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,山西太原 030031)

    甜瓜(Cucumis melo L.)在我國(guó)有著悠久的栽培歷史,因香甜可口和降暑的作用而受到人們的喜愛,尤其是高度進(jìn)化的網(wǎng)紋甜瓜更是以高檔水果的身份進(jìn)入現(xiàn)代消費(fèi)社會(huì),作為四季常鮮的水果,受到各界人士的青睞,售價(jià)居高不下,產(chǎn)品暢銷國(guó)內(nèi)外。我國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)利用大棚秋季栽培網(wǎng)紋甜瓜,具有較高的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。然而在生產(chǎn)上,甜瓜的栽培管理會(huì)受到各種病害的嚴(yán)重制約,如枯萎病、白粉病、蔓枯病等真菌性病害,正常年份可造成甜瓜10%~15%的產(chǎn)量損失,發(fā)病嚴(yán)重時(shí)損失可高達(dá)30%[1]。常規(guī)育種技術(shù)雖然使新培育的甜瓜品種抗性有所提高,但由于受到資源限制,仍無法滿足生產(chǎn)上的需求。生物技術(shù)的誕生為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)開辟了一條嶄新的育種途徑,科學(xué)家采用基因工程技術(shù)將一些能夠提升植物抗病性的基因?qū)胫仓?,獲得了一些抗病性植株。

    轉(zhuǎn)基因技術(shù)應(yīng)用在甜瓜性狀改良和育種上,起步于上世紀(jì)末。國(guó)外,1990年美國(guó)Michigan 州立大學(xué)的Fang 和Grumet[2]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將抗卡那霉素基因(NPTⅡ)導(dǎo)入甜瓜,開啟了轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制和培育甜瓜新品種的新紀(jì)元;1993年,Yoshikawa等[3]將黃瓜花葉病毒外殼蛋白基因(CMV-CP)導(dǎo)入甜瓜;1997年,F(xiàn)uchs等[4]將得到的抗小西葫蘆黃花葉病毒、抗黃瓜花葉病毒和抗西瓜花葉病毒2號(hào)的甜瓜品系,在大田做生物學(xué)鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因個(gè)體的病毒侵染率在8%~33%,而對(duì)照的病毒感染率高達(dá)99%;與非轉(zhuǎn)化體相比,轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)量提高了62%左右,甜瓜的商品率增加60%。國(guó)內(nèi),甜瓜轉(zhuǎn)基因研究開始稍晚一些,1994年,孫嚴(yán)等[5]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將CMV外殼蛋白cDNA基因?qū)胩鸸?,獲得了抗CMV的甜瓜植株;2001年,鐘俐等[6]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雪花蓮凝集素(GNA)基因?qū)胩鸸掀贩N皇后和伽師瓜,飼蚜試驗(yàn)結(jié)果證明,轉(zhuǎn)化植株獲得了棉蚜抗性;2006年,黃永紅[7]用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將甜瓜ACC氧化酶導(dǎo)入甜瓜品種‘gt-1’,使得轉(zhuǎn)化植株果實(shí)的耐貯藏性提高;2014年,郝金鳳等[8]以河套甜瓜原種為試驗(yàn)材料,以甜瓜腋芽生長(zhǎng)點(diǎn)作為外植體,根據(jù)農(nóng)桿菌菌液濃度和處理時(shí)間的不同配置,建立和優(yōu)化了甜瓜生長(zhǎng)點(diǎn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的轉(zhuǎn)化體系,獲得了陽性植株。

    關(guān)于幾丁質(zhì)酶基因?qū)胩鸸系难芯?,目前?guó)內(nèi)外,僅見2003年葛屹松[9]等人的報(bào)道,該課題組將抗真菌蛋白幾丁質(zhì)酶基因和β-1,3-葡聚糖酶基因?qū)牖屎?、紅蜜脆等甜瓜品種,經(jīng)分子檢測(cè)證明獲得了轉(zhuǎn)化植株,目的基因在轉(zhuǎn)化植株中得到了表達(dá)。

    甜瓜導(dǎo)入幾丁質(zhì)酶基因可以預(yù)防某些甜瓜的真菌病原菌的危害,其作用機(jī)制:轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)酶基因的植株所表達(dá)的幾丁質(zhì)酶能夠降解真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì),從而使真菌裂解和無法正常繁殖,達(dá)到防治真菌侵害和危害的目的。

    鑒于此前有關(guān)幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化甜瓜的文獻(xiàn)較少,而且這些文獻(xiàn)也僅僅是報(bào)道得到轉(zhuǎn)化植株,對(duì)轉(zhuǎn)化幾丁質(zhì)酶基因的植株的真菌病抗性仍缺少進(jìn)一步的研究,因此針對(duì)幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化甜瓜的研究是很有必要的。

    本文擬以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水稻幾丁質(zhì)酶基因?qū)胩鸸掀贩N,在獲得轉(zhuǎn)化植株的基礎(chǔ)上,探討幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化個(gè)體(株系)對(duì)真菌病——白粉病的抗性變化。

    1 材料和方法

    1.1 植物材料和質(zhì)粒

    以本課題組保存的甜瓜品種雪脆蜜2號(hào)作為轉(zhuǎn)化對(duì)象,進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化植株對(duì)白粉病的抗性變化。

    轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒為pGI 11一RC-1(圖1)由本中心基因工程研究室友情提供。其攜帶有水稻幾丁質(zhì)酶基因和潮霉素抗性基因,農(nóng)桿菌菌株為L(zhǎng)BA4404。

    圖1 質(zhì)粒pGL II-RC-1結(jié)構(gòu)圖

    1.2 轉(zhuǎn)化方法

    1.2.1 農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)

    挑取含有質(zhì)粒pGI 11一RC-1的農(nóng)桿菌單菌落,接種于YEP液體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)48h。取出菌液用YEP液體培養(yǎng)基稀釋至OD600值為0.2~0.4,4℃冰箱臨時(shí)保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 外植體制備、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)化

    種子消毒、外植體制備、再生體系的建立及外植體轉(zhuǎn)化方法參見葛屹松[9]文獻(xiàn)。

    1.3 分子檢測(cè)

    1.3.1 取樣和DNA提取

    所有再生植株全部取樣,即摘取其幼嫩葉片500mg左右,采用CTAB法[10]提取植物DNA,同時(shí)按堿裂解法[11]提取質(zhì)粒DNA。

    1.3.2 PCR檢測(cè)

    以非轉(zhuǎn)化植株的樣品為陰性對(duì)照,質(zhì)粒DNA為陽性對(duì)照。樣品的PCR擴(kuò)增引物、擴(kuò)增體系配制和擴(kuò)增條件參見杜建中[12]文獻(xiàn)。

    1.3.3 Southern blot雜交分析

    取PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性的植株的DNA進(jìn)行Southern blot檢測(cè),所用試劑盒是Roche公司生產(chǎn)的DIG DNA Labling and Detection Kit。對(duì)PCR檢測(cè)結(jié)果為陽性的植株DNA全部進(jìn)行Southern blot雜交分析。待檢樣品DNA、陰性對(duì)照DNA、質(zhì)粒DNA均用Hind Ⅲ 酶切,酶切反應(yīng)體系總體積25μL,其中10×buffer 2.5μL,DNA溶液10μL,限制性內(nèi)切酶5μL,加水7.5μL。反應(yīng)管5000 r/min離心15 s,然后37℃水浴中酶切過夜。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離4h。隨后的DNA處理方法參見《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[13]。雜交用探針按試劑盒說明書制備,用CSPD(Roche)熒光染色雜交條帶,并 X-光片自顯影曝光。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。

    1.4 轉(zhuǎn)化植株抗病性的生物學(xué)鑒定

    1.4.1 采集病原菌、制備分生孢子懸浮液

    從田間采集感病的甜瓜葉片,冷凍保存。參見鄧麗君等[14]方法制備病原菌分生孢子懸浮液備用。

    1.4.2 田間接種病原菌

    移栽轉(zhuǎn)基因甜瓜植株和非轉(zhuǎn)化植株至溫室,每個(gè)處理各9株,3次重復(fù)。5葉期采用鄧麗君等[14]的孢子懸浮液噴霧接種法進(jìn)行田間接種,接種一周后開始田間調(diào)查記錄,3周時(shí)調(diào)查發(fā)病情況。病情指數(shù)(DI)計(jì)算公式如下,參見鄧麗君等[14]文獻(xiàn)。

    分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照《中國(guó)蔬菜病蟲預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)》的方法[15]?;铙w植株接種病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)和白粉病抗感分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參見鄧麗君等[14]文獻(xiàn)。

    2 結(jié)果分析

    2.1 再生轉(zhuǎn)化苗的獲得

    通過培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化,共獲得再生轉(zhuǎn)化苗213株,其中有11株根系不發(fā)達(dá),苗勢(shì)較弱,淘汰。其余202株全部取樣進(jìn)行PCR檢測(cè)。

    2.2 分子檢測(cè)結(jié)果

    2.2.1 PCR檢測(cè)

    202個(gè)待測(cè)樣品中,經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測(cè),發(fā)現(xiàn)有17株材料的樣品中有目的基因的存在,認(rèn)定為疑似轉(zhuǎn)化植株。圖2為部分材料的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。由圖中可以看出,陰性對(duì)照無特異擴(kuò)增條帶出現(xiàn),證明擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件是正確的,1~8號(hào)轉(zhuǎn)基因植株的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)與陽性對(duì)照大小一致的特異擴(kuò)增條帶(376bp),證實(shí)這些轉(zhuǎn)基因植株的DNA中包含有目的基因幾丁質(zhì)酶基因的序列。

    圖2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

    2.2.2 Southern blot雜交分析

    17株認(rèn)定的疑似轉(zhuǎn)化植株,經(jīng)Southern blot雜交分析,發(fā)現(xiàn)11個(gè)植株的DNA中,雜交出與陽性對(duì)照DNA同樣大小的特異雜交條帶,證明轉(zhuǎn)基因植株中目的基因業(yè)已整合到甜瓜的基因組上,確為轉(zhuǎn)基因植株。11個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的雜交分析中,有1株出現(xiàn)3條雜交條帶,另一株出現(xiàn)2條雜交條帶,剩余9株均只出現(xiàn)一條雜交帶,選取這9株進(jìn)行快繁,以便有足夠的移栽苗進(jìn)行田間播種進(jìn)一步做抗病生物學(xué)鑒定。圖3為這9個(gè)轉(zhuǎn)基因植株DNA的Southern blou雜交結(jié)果,可以看出,除了陰性對(duì)照沒有任何雜交條帶外,陽性對(duì)照和9個(gè)轉(zhuǎn)基因植株均顯現(xiàn)出特異的雜交條帶。

    圖3 轉(zhuǎn)基因材料的Southern blot雜交結(jié)果

    2.3 抗病生物學(xué)鑒定

    9個(gè)轉(zhuǎn)化植株(或后代)接種病原菌后,通過調(diào)查、計(jì)算和分析,其抗病性鑒定結(jié)果見表1。

    由表1可以看出,陰性對(duì)照發(fā)病率100%,證明白粉病菌的田間接種成功。轉(zhuǎn)基因材料,除T9外,其余8個(gè)轉(zhuǎn)化植株的植株均達(dá)到抗病標(biāo)準(zhǔn),其中T3達(dá)到高抗病水平,其它為中抗或抗病。但各植株的白粉病抗性之間仍存在差異,這可能與目的基因在各個(gè)體中的表達(dá)與否或表達(dá)水平有關(guān),有關(guān)這個(gè)問題以及目的基因在轉(zhuǎn)化植株中的遺傳、表達(dá)規(guī)律和抗性仍需進(jìn)一步研究。

    表1 轉(zhuǎn)基因甜瓜植株田間接種白粉病菌的抗病鑒定結(jié)果

    本研究證明,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化甜瓜的轉(zhuǎn)化率在4%~5%之間,通過轉(zhuǎn)化可獲得轉(zhuǎn)水稻幾丁質(zhì)酶基因的甜瓜植株,幾丁質(zhì)酶基因的導(dǎo)入賦予這些轉(zhuǎn)基因植株白粉病抗性,一般可提高2~4個(gè)抗性級(jí)別。因此通過篩選能夠培育出高抗白粉病的轉(zhuǎn)基因甜瓜品種。

    3 討論

    感染白粉病的甜瓜生長(zhǎng)緩慢,使得甜瓜無法完成由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的過度,從而影響甜瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)[16]。常規(guī)的白粉病藥物防治既費(fèi)工、費(fèi)錢,又或多或少在果實(shí)上產(chǎn)生藥物殘留,不利于食用者的身體健康。采用常規(guī)育種與轉(zhuǎn)基因技術(shù)、分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)有機(jī)結(jié)合的方法,可以創(chuàng)制和培育出高抗白粉病的甜瓜品種。鞠立君[17]將甜瓜CmLOX09基因?qū)敕?,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因番茄植株抗白粉病能力增強(qiáng),并推測(cè)CmLOX09通過AOS途徑產(chǎn)生的JA相應(yīng)白粉病的侵染。王磊[18]將葡萄泛素連接酶基因VERH2導(dǎo)入歐洲葡萄無核白和擬南芥中,轉(zhuǎn)基因葡萄和擬南芥對(duì)白粉病的抗性均有所提高。王亞軍[19]報(bào)道,小麥導(dǎo)入TaRGA抗病基因,增強(qiáng)了小麥的白粉病抗性。這些報(bào)道均證明導(dǎo)入植物體某種抗病基因,可以提高該轉(zhuǎn)基因植株白粉病的抗性。

    幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)產(chǎn)物通過降解真菌細(xì)胞壁的組成物質(zhì)幾丁質(zhì)而賦予轉(zhuǎn)基因植株對(duì)真菌病的抗性。幾丁質(zhì)酶基因轉(zhuǎn)化研究在玉米[12]、小麥[20]、葡萄[21]、黑麥草[22]等植物上都獲得成功,外源基因的表達(dá)使得轉(zhuǎn)化植株提高了對(duì)白粉病的抗性,這些均與本研究的結(jié)論相近,說明幾丁質(zhì)酶基因的導(dǎo)入可以提高植物對(duì)白粉病的抗性。此外就轉(zhuǎn)基因食品的安全性問題,1999年,Yutaka[23]報(bào)道,導(dǎo)入CMV基因片段的轉(zhuǎn)基因甜瓜,與非轉(zhuǎn)化甜瓜比較,果實(shí)的形態(tài),花粉的結(jié)構(gòu)、壽命、萌發(fā)與傳播大致相同,對(duì)田間雜草、土壤微生物群落等的影響也基本一致,證明轉(zhuǎn)基因甜瓜對(duì)種植環(huán)境無危害;應(yīng)奇才等[24]設(shè)計(jì)了轉(zhuǎn)WMV-2CP基因的甜瓜喂飼小鼠的試驗(yàn),急性毒性、亞急性毒性和致突變?cè)囼?yàn)證明轉(zhuǎn)基因甜瓜不含有急性毒性物質(zhì);微核試驗(yàn)和精子畸變?cè)囼?yàn)的結(jié)果也證實(shí)沒有發(fā)生基因突變;喂飼轉(zhuǎn)基因甜瓜的小鼠的各項(xiàng)生理特征與對(duì)照組并無明顯差異。這些均表明轉(zhuǎn)基因甜瓜的食用和環(huán)境釋放是安全的。

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