基于拉曼光譜快速檢測(cè)山西老陳醋醋泥中總黃酮方法的建立

李葉麗,溫丹華,李 鑫,黃登宇

(1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太原 030006;2.山西大學(xué)食品藥品快檢技術(shù)中心,山西太原 030006;3.山西省食品藥品監(jiān)督管理局,山西太原 030031)

老陳醋,作為山西省地標(biāo)產(chǎn)品之一,歷史悠久,其色澤深褐、醋香濃郁、酯香醇厚、過(guò)夏不腐、入冬不凍。研究表明食醋具有抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖、血脂、降血壓、抗氧化等多種生理功能[1]，品牌價(jià)值不言而喻,然而摻假、勾兌現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,因此,對(duì)其進(jìn)行品牌保護(hù),加強(qiáng)一線快速檢測(cè),提高檢測(cè)的速度與準(zhǔn)確率具有極其重要的意義[2-3]。

總黃酮作為山西老陳醋新增重要質(zhì)量評(píng)價(jià)和特征指標(biāo)之一,可以用來(lái)鑒假、識(shí)偽[4]。目前,對(duì)于總黃酮檢測(cè),多采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法[5-8],但是該方法滴定試劑多,需要熟練的操作人員,不利于基層人員一線使用。因此建立快速檢測(cè)技術(shù)尤為必要。拉曼光譜快速檢測(cè)技術(shù)作為一種快速檢測(cè)技術(shù),是光照射在被測(cè)分子上發(fā)生非彈性散射,與被測(cè)分子之間發(fā)生能量交換,光子除運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生變化之外,其頻率也發(fā)生變化,這種頻率的變化只與分子的振動(dòng)與轉(zhuǎn)動(dòng)頻率有關(guān)。正是利用這種特性,實(shí)現(xiàn)對(duì)物質(zhì)的定性定量檢測(cè)[9-10]。該技術(shù)具有樣品無(wú)需前處理、操作簡(jiǎn)便、時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)樣品快速、無(wú)損傷、定性定量檢測(cè)分析,最大的優(yōu)點(diǎn)是水的拉曼散射很微弱,所以拉曼光譜檢測(cè)技術(shù)是研究含水體系的理想工具[11],現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于食品分析檢測(cè)中[12-14]。

本試驗(yàn)嘗試使用便攜式拉曼檢測(cè)儀對(duì)山西老陳醋醋泥中總黃酮進(jìn)行定量檢測(cè),以黃酮類物質(zhì)在其拉曼特征峰處強(qiáng)度為指標(biāo),優(yōu)化積分時(shí)間、激光功率、積分次數(shù),以期建立老陳醋中總黃酮的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫(kù),同時(shí)拓展拉曼光譜儀的適用范圍,為實(shí)現(xiàn)山西老陳醋一線質(zhì)量安全監(jiān)管提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山西老陳醋醋泥 山西寧化府醋廠提供;蘆丁(HPLC≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;NaNO2天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;Al(NO3)3天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司;NaOH 天津市大陸化學(xué)試劑廠;CH3CH2OH 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑廠;硼砂(純度≥99.5%) 天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠;Ca(OH)2(純度≥95.0%) 中國(guó)醫(yī)藥公司北京采購(gòu)供應(yīng)站;ACN(前處理試劑)、納米增強(qiáng)檢測(cè)試劑(OTR103、OTR202) 蘇州歐普?qǐng)D斯光學(xué)納米科技有限公司;化學(xué)試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

BSA224S電子天平(d=0.01 g) 德國(guó)Sartorius公司;SC-3610低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;UPT-I-10T超純水器 四川優(yōu)普超純科技有限公司;PB-10 pH計(jì) 德國(guó)Sartorius公司;KQ-300DE超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;UV-1600紫外/可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司;RamTracer-200-QCM便攜式拉曼光譜儀 蘇州歐普?qǐng)D斯光學(xué)納米科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗提取及純化醋泥中總黃酮 準(zhǔn)確稱取山西老陳醋醋泥2.0 g,3000 r/min離心10 min,棄上清液,取沉淀。加入60%乙醇30 mL,保鮮膜封口,50 ℃、60 W超聲50 min,3000 r/min離心20 min,棄沉淀,上清液即老陳醋醋泥中總黃酮粗提液[15-17]。

加入3倍體積飽和Ca(OH)2溶液及少量3%硼砂溶液調(diào)整提取液pH至8～9,將其處理液離心并取其上清液,實(shí)現(xiàn)對(duì)總黃酮粗提液的純化[18-19]。

1.2.2 總黃酮拉曼光譜快速檢測(cè)方法的建立 常溫下取1.2.1純化后溶液20 μL,依次加入500 μL OTR202,100 μL OTR103,振蕩混勻,在積分時(shí)間20 s,積分次數(shù)10,激光功率300 mW條件下上機(jī)檢測(cè),用air-PLS方法去熒光背景處理[20],Origin 7.5進(jìn)一步平滑處理,平滑系數(shù)為20。

1.2.3 選取總黃酮拉曼特征峰 配制蘆丁儲(chǔ)備液(2.0 mg/mL),將蘆丁儲(chǔ)備液、樣品溶液及蘆丁與樣品混合溶液(體積比為1∶1),按1.2.2步驟進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 建立拉曼光譜快速檢測(cè)法標(biāo)準(zhǔn)曲線 將蘆丁儲(chǔ)備液分別稀釋到0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,按1.2.2步驟進(jìn)行操作,以特征峰位置峰強(qiáng)度為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出線性方程。

1.2.5 拉曼快速檢測(cè)條件優(yōu)化 通過(guò)單因素試驗(yàn)確定最佳積分時(shí)間、激光功率和積分次數(shù)。

1.2.5.1 優(yōu)化積分時(shí)間 取20 μL樣品溶液6份,固定積分次數(shù)10次,激光功率300 mW,分別設(shè)置積分時(shí)間為5、10、15、20、25、30 s,重復(fù)三次?？疾觳煌e分時(shí)間下總黃酮拉曼特征峰強(qiáng)度。

1.2.5.2 優(yōu)化激光功率 取20 μL樣品溶液7份,積分時(shí)間用1.2.5.1中選定條件,固定積分次數(shù)10次,分別設(shè)置激光功率為50、100、150、200、250、300、350 mW,重復(fù)三次?？疾觳煌す夤β氏驴傸S酮拉曼特征峰強(qiáng)度。

1.2.5.3 優(yōu)化積分次數(shù) 取20 μL樣品溶液5份,積分時(shí)間用1.2.5.1中選定條件,激光功率用1.2.5.2中選定條件,分別設(shè)置積分次數(shù)為5、10、15、20次,重復(fù)三次?？疾觳煌e分次數(shù)下總黃酮拉曼特征峰強(qiáng)度。

1.2.6 拉曼光譜快速檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià) 對(duì)拉曼光譜快速檢測(cè)方法精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率進(jìn)行測(cè)定。取總黃酮提取液1份,連續(xù)測(cè)定5次,評(píng)價(jià)方法精密度;取總黃酮提取液5份,分別測(cè)定,評(píng)價(jià)方法重現(xiàn)性。取總黃酮提取液1份,測(cè)定5次,每次間隔30 min,評(píng)價(jià)方法穩(wěn)定性。取已知濃度的總黃酮提取液5份,分別加0.025、0.05、0.1、0.2、0.3 mg/mL的蘆丁標(biāo)品,進(jìn)行檢測(cè),評(píng)價(jià)方法加標(biāo)回收率。所有試驗(yàn)均在優(yōu)化拉曼條件下,按1.2.2步驟進(jìn)行操作。所有試驗(yàn)均重復(fù)三次,取平均值,依據(jù)特征峰處拉曼強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果計(jì)算RSD值進(jìn)行方法評(píng)價(jià)。

1.2.7 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法測(cè)定總黃酮

1.2.7.1 測(cè)定方法 吸取總黃酮提取液2.00 mL(兩份),分別加入1.00 mL NaNO2溶液(50 g/L),混勻,靜置6 min;分為試驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組中加入1.00 mL Al(NO3)3溶液(100 g/L)并振蕩混勻,對(duì)照組中不添加,靜置6 min;分別加入4.00 mL NaOH 溶液(200 g/L),振蕩混勻,靜置15 min。以對(duì)照組調(diào)節(jié)零點(diǎn),在波長(zhǎng)510 nm 處,測(cè)定試驗(yàn)組吸光度[4]。

1.2.7.2 建立NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線 準(zhǔn)確吸取0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)使用液(相當(dāng)于0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80 mg無(wú)水蘆丁),補(bǔ)dH2O至10 mL。按1.2.7步驟進(jìn)行操作,以吸光度為縱坐標(biāo),蘆丁質(zhì)量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得出回歸方程。

1.2.7.3 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法方法學(xué)評(píng)價(jià) 對(duì)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)1.2.6拉曼光譜快速檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià)試驗(yàn)進(jìn)行操作,所有試驗(yàn)均重復(fù)三次,取平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)主要采用Microsoft Office Excel和Origin 7.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拉曼光譜快速檢測(cè)方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 拉曼特征峰確定 731 cm-1處為山西老陳醋醋泥中黃酮類物質(zhì)拉曼特征峰[21-23]。由圖1可見,醋泥試樣中黃酮類物質(zhì)拉曼峰相對(duì)于蘆丁峰位置發(fā)生了偏移,其原因可能是醋泥中所含物質(zhì)為蘆丁衍生物,且混合物中各物質(zhì)之間存在相互影響,導(dǎo)致拉曼特征峰位置發(fā)生一定程度偏移。

圖1 拉曼特征峰的選取Fig.1 Selection of Raman characteristic peaks

2.1.2 拉曼光譜快速檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)1.2.4步驟進(jìn)行操作,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=76.73575x+32.93431,R2=0.86903,結(jié)果表明,在特征峰位置處,蘆丁濃度與拉曼峰強(qiáng)度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3 最佳檢測(cè)條件確定

2.1.3.1 積分時(shí)間確定 由圖2可見,當(dāng)積分時(shí)間為25 s時(shí),其拉曼特征峰處拉曼強(qiáng)度最大。其原因可能是當(dāng)積分時(shí)間小于25 s時(shí),隨激光照射時(shí)間的延長(zhǎng),所產(chǎn)生的拉曼效應(yīng)愈明顯,當(dāng)激光照射時(shí)間達(dá)到一定閾值點(diǎn)后,所產(chǎn)生的熱效應(yīng)對(duì)老陳醋醋泥中黃酮類物質(zhì)有一定程度破壞,使得拉曼效應(yīng)降低。因此,選擇25 s為最佳積分時(shí)間。

圖2 積分時(shí)間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of integration time

2.1.3.2 激光功率確定 由圖3可見,隨激光功率不斷增大,在特征峰處拉曼強(qiáng)度也持續(xù)上升。當(dāng)激光功率為350 mW時(shí),特征峰強(qiáng)度達(dá)到最大,峰最明顯。其原因可能是黃酮類物質(zhì)拉曼信號(hào)很弱,需要足夠強(qiáng)的激光功率照射才能得出良好的圖像。因此,選擇350 mW為最佳激光功率。

圖3 激光功率的優(yōu)化Fig.3 Optimization of laser power

2.1.3.3 積分次數(shù)確定 由圖4可見,不同積分次數(shù)在特征峰位置處所產(chǎn)生的拉曼特征峰基本重疊,可見積分次數(shù)對(duì)拉曼圖像影響較小,因此選擇積分次數(shù)最少,即5次為宜。

圖4 積分次數(shù)的優(yōu)化Fig.4 Optimization of integration times

2.1.4 拉曼光譜快速檢測(cè)方法評(píng)價(jià) 根據(jù)1.2.6拉曼光譜快速檢測(cè)方法學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn),對(duì)同一樣品連續(xù)測(cè)定五次,測(cè)得特征峰峰強(qiáng)分別為361.99、333.92、276.81、379.59、336.62,計(jì)算得出RSD值為7.82%,說(shuō)明準(zhǔn)確度較高;測(cè)定5組相同樣品,測(cè)得特征峰峰強(qiáng)分別為310.77、318.24、352.72、302.11、326.12,計(jì)算得出RSD值為4.33%,說(shuō)明重復(fù)性較好;對(duì)一個(gè)樣品測(cè)定5次,每次間隔30 min,測(cè)得特征峰峰強(qiáng)分別為336.93、354.22、316.21、341.19、332.61,計(jì)算得出RSD值為4.11%,說(shuō)明穩(wěn)定性較高;對(duì)已知濃度的總黃酮溶液加標(biāo),其測(cè)定結(jié)果如表1所示。

表1 拉曼光譜快速檢測(cè)方法的加標(biāo)回收率Table 1 The recovery rate of the method of Raman fast detection

2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 根據(jù)1.2.7.1步驟建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.4287x+0.0034,其中y為吸光度,x為蘆丁的質(zhì)量,R2=0.9973,表明二者線性關(guān)系良好。

2.2.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法評(píng)價(jià) 根據(jù)1.2.7.2 NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果計(jì)算得出,該方法的精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性的RSD值分別為0.55%,2.98%,5.31%,平均回收率為97.99%,表明該方法精密度很高,重現(xiàn)性、穩(wěn)定性都較好,加標(biāo)回收率也較高,方法可行。

2.3 方法比較

拉曼光譜快速檢測(cè)方法與比色法結(jié)果比較如表2所示。與比色法相比較而言,拉曼光譜快速檢測(cè)方法精密度及重現(xiàn)性均較差,但穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率相對(duì)更高。從整體來(lái)看,新建立的拉曼光譜快速檢測(cè)方法滿足了一線檢測(cè)的要求,可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

表2 拉曼光譜快速檢測(cè)方法與比色法比較Table 2 Comparison between the method of Raman fast detection and colorimetry

3 結(jié)論與展望

本試驗(yàn)建立了山西老陳醋醋泥中總黃酮拉曼光譜快速檢測(cè)方法,確定總黃酮拉曼特征峰在731 cm-1處。通過(guò)拉曼條件優(yōu)化試驗(yàn),確定積分時(shí)間為25 s,激光功率為350 mW,積分次數(shù)為5次,此條件下進(jìn)行測(cè)定,其拉曼特征峰最為明顯。通過(guò)拉曼方法評(píng)價(jià)試驗(yàn),結(jié)果顯示其精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性的RSD值分別為7.82%、4.33%、4.11%,平均加標(biāo)回收率為98.75%。雖然與NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系比色法相比,其精密度及重現(xiàn)性較差,可靠性較低,但同時(shí)也表明該方法穩(wěn)定性及加標(biāo)回收率較好?？傮w而言,新建立的拉曼光譜快速檢測(cè)方法達(dá)到了快速檢測(cè)要求,可以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

本試驗(yàn)旨在通過(guò)建立山西老陳醋醋泥中總黃酮拉曼光譜快速檢測(cè)方法,拓展拉曼檢測(cè)儀的適用范圍,為實(shí)現(xiàn)山西老陳醋拉曼光譜快速檢測(cè)提供方法依據(jù),為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)山西老陳醋現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。由于老陳醋醋泥中存在大量熒光物質(zhì)對(duì)便攜式拉曼檢測(cè)儀干擾極大,如醇溶性蛋白等。所以,進(jìn)一步試驗(yàn)中不僅需要在后期運(yùn)用數(shù)學(xué)方法消除熒光背景,而且前期也要盡可能減少熒光干擾?？梢試L試使用如大波長(zhǎng)激光頭或傅里葉變換拉曼等方法來(lái)消除熒光對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。不斷完善譜庫(kù),增強(qiáng)方法研究,提高拉曼快速檢測(cè)技術(shù)的檢出性能,便于更多新物質(zhì)檢測(cè),這也是后續(xù)試驗(yàn)將要進(jìn)一步研究的工作[24]。