超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定香辛料中7種真菌毒素

黃思瑜,董憲兵,周純潔,鄧宇杰,李 紅,楊小珊

(重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院,重慶 401121)

真菌毒素是一類由真菌產(chǎn)生的具有毒性的二次代謝產(chǎn)物,能夠廣泛污染農(nóng)作物及食品[1],比較常見的真菌毒素有:黃曲霉毒素(aflatoxin,AF)、赭曲霉毒素(ochratoxin,OT)、伏馬菌毒素(fumonisin,FB)等。研究表明,真菌毒素可以引起人類的急性或慢性中毒,許多真菌毒素的毒性是多器官性的。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)估計(jì)全球每年約有25%的農(nóng)作物遭受真菌及其毒素污染,全球每年因真菌毒素污染而造成的直接及間接損失將達(dá)到數(shù)百億美元[2]。

我國是香辛料的主要生產(chǎn)國和出口國之一,主要的品種有辣椒、花椒和八角等[3]。香辛料是一種很容易受到霉菌及其產(chǎn)生的真菌毒素污染的植物性農(nóng)產(chǎn)品。在香辛料加工、貯藏、運(yùn)輸和銷售過程中都容易受到霉菌的侵染,污染香辛料的霉菌在適宜的條件下可以產(chǎn)生真菌毒素,主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬菌毒素等,這些真菌毒素的存在會(huì)對消費(fèi)者健康產(chǎn)生潛在的危害[4]。香辛料中真菌毒素的檢測目前主要有高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜/質(zhì)譜法和酶聯(lián)免疫吸附測定法,但以上僅針對香辛料中單一真菌毒素的檢測。隨著各種高精尖儀器的成功應(yīng)用,快速篩查技術(shù)、高通量的檢測技術(shù),即專屬、高效、經(jīng)濟(jì)的前處理手段,多成分同時(shí)分析的檢測手段以及成功避免假陽性的技術(shù)已成為未來檢測多真菌毒素技術(shù)的發(fā)展趨勢[5-6]。王玉嬌等[7]建立了超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測干果中16種真菌毒素,楊萬穎等[8]建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定小麥粉中10種真菌毒素,葛寶坤等[9]用免疫親和柱凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中藥材中的14種真菌毒素。此外,關(guān)于植物油、糧谷飼料、桑葚等基質(zhì)中多真菌毒素的檢測也有相關(guān)研究[10-15]。但是基質(zhì)相對復(fù)雜的香辛料中多真菌毒素的高通量檢測方法還沒有相關(guān)的報(bào)道。

本文選用香辛料中常用的辣椒、花椒和八角作為研究基質(zhì),通過優(yōu)化質(zhì)譜條件,對比不同真菌毒素提取溶劑的提取效果,不同定容溶液的定容效果,建立了香辛料中7種真菌毒素同時(shí)測定的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青花椒、重慶石柱辣椒、廣西八角 重慶盤溪糧油批發(fā)市場;黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液 美國Supelco公司;赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶夜 糧食局科學(xué)研究院;伏馬菌毒素B1、B2標(biāo)準(zhǔn)溶液 Romer國際貿(mào)易(北京)有限公司;乙腈、甲醇 色譜純,德國Merck公司;磷酸二氫鉀、十二水磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉 分析純,成都市科龍化工試劑廠;甲酸 色譜純,德國CNW公司。

ACQUITYTM型超高效液相色譜、HSS T3型液相色譜柱 美國Waters公司;API4000型液質(zhì)聯(lián)用儀 美國AB SCIEX公司;Allegra X-30型高速離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特公司;Milli-Q型全自動(dòng)超純水機(jī) 美國Millipore公司;SB25-120TN型超聲波清洗儀 寧波新芝生物科技股份有限公司;FW200型粉碎機(jī) 江蘇金壇市友聯(lián)儀器研究所;Myco6in1TM多真菌毒素免疫親和凈化柱 美國Vicam公司;電子天平SQP 德國Sartorius公司;Vortex3渦旋混勻器 德國IKA儀器有限公司;MD200-2型氮吹儀 杭州奧盛儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 各取適量上述真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配成濃度分別為黃曲霉毒素B1(AFB1)50 μg/L、黃曲霉毒素B2(AFB2)100 μg/L、黃曲霉毒素G1(AFG1)100 μg/L、黃曲霉毒素G2100 μg/L(AFG2)、赭曲霉毒素A(OTA)100 μg/L、伏馬菌毒素B1(FB1)2000 μg/L、伏馬菌毒素B2(FB2)2000 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液,用于添加回收實(shí)驗(yàn)和制備標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,4 ℃條件下避光保存。

1.2.2 樣品前處理 分別把青花椒、重慶石柱辣椒、廣西八角三種樣品用粉碎機(jī)粉碎,稱取5 g(精確至0.01 g)粉碎后樣品于50 mL離心管中,加入12 mL水,渦旋振蕩15 min,再加入28 mL甲醇(甲醇∶水=7∶3,V/V),繼續(xù)渦旋振蕩15 min,8000 r/min離心10 min,玻璃纖維濾紙過濾,收集濾液于干凈的容器中,準(zhǔn)確移取5 mL濾液,在40 ℃條件下氮吹至2 mL,在濃縮液中加入5 mL PBS(pH7.4±0.1)緩沖液[16],渦旋混勻,待凈化。

將上述7 mL稀釋液緩慢通過Myco6in1TM真菌毒素免疫親和凈化柱,直至空氣進(jìn)入凈化住,將10 mL PBS(pH7.4±0.1)溶液以1滴/s的流速通過親和柱,直至空氣進(jìn)入親和柱。將2 mL甲醇加入到親和柱中,使親和柱凝膠部分完全浸泡在甲醇中,且不流出,并將親和柱底部用原帽堵住,靜置5 min。然后以兩秒1滴的流速淋洗親和柱,將淋洗液收集于玻璃試管中。再加入2 mL純水過親和柱,以兩秒1滴的流速淋洗親和柱,將淋洗液收集于同一玻璃試管中。取2 ml洗脫液在40 ℃氮吹至近干,準(zhǔn)確加入1 mL甲醇-水(50∶50,v/v)定容,混勻,0.22 μm濾膜過濾,供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。

1.2.3 色譜條件 色譜柱:HSS T3(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:0.1%甲酸水溶液(A),0.1%甲酸乙腈溶液(B),梯度洗脫:0～0.5 min,5% B;0.5～1.5 min,5%～60% B;1.5～3.5 min,60%～95% B;3.5～4 min,95%～60% B;4～5 min,60%～5% B。流速:0.4 mL/min;進(jìn)樣體積:5 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子化模式:電噴霧電離正離子模式(ESI+);質(zhì)譜掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電壓(IS):4500 V;離子源溫度(TEM):5500 ℃;氣簾氣壓力(CUR):30 psi;霧化氣壓力(GSI):40 psi;輔助氣壓力(GS2):50 psi;碰撞氣壓力(CAD):5 psi;各真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)詳見結(jié)果與分析中的表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將7種真菌毒素化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為0.5 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,以10 μL/min的流速注入質(zhì)譜中。在全掃描模式下對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)先進(jìn)行一級質(zhì)譜分析(Q1掃描),得到分子離子峰,選取相應(yīng)的母離子峰,對其子離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(Q2掃描),得到碎片離子信息,然后對得到的質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。得到每種真菌毒素合適的離子模式、母離子、子離子及相對應(yīng)的碰撞能量、去簇電壓。各個(gè)真菌毒素的母離子、子離子及對應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 真菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS/MS condltlons for mycotoxins

2.2 提取條件的優(yōu)化

乙腈和甲醇是近年來生物毒素分析中最常用的2種萃取溶劑。在優(yōu)化提取實(shí)驗(yàn)過程中,以回收率實(shí)驗(yàn)比較,選用最佳提取溶劑。參考鄭榮等[17]、孫娟等[18]的方法,選用50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、50%乙腈、70%乙腈、90%乙腈作為提取溶劑,分別考察各個(gè)提取液回收率。根據(jù)圖1可知,不同濃度和不同試劑的提取液對真菌毒素提取效率有一定影響,隨著有機(jī)試劑濃度增加,提取回收率逐漸升高,但是有機(jī)試劑濃度過高時(shí),回收率反而會(huì)降低?？赡苁钱?dāng)甲醇、乙腈濃度增加時(shí),會(huì)適當(dāng)增加真菌毒素的萃取回收率,但是隨著濃度的增大會(huì)降低多功能凈化柱的凈化中分析物在凈化柱的保留效果,反而會(huì)降低真菌毒素的回收率[18]。70%甲醇溶液和70%乙腈溶液提取效率差別不大,綜合考慮經(jīng)濟(jì)成本選用70%甲醇溶液作為提取試劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),先用水提取后再按比例加入甲醇提取的回收率高于直接用70%甲醇。本實(shí)驗(yàn)最終選用先加12 mL水提取后再加入28 mL甲醇提取。

圖1 提取液濃度對7種真菌毒素提取效果的影響Fig.1 Effect on recovery rate of 7 mycotoxins under different concentrations of extractant

2.3 定容溶液的選擇

本實(shí)驗(yàn)選用20%甲醇、50%甲醇和80%甲醇作為定容溶液。結(jié)果顯示,當(dāng)選用50%甲醇定容時(shí)目標(biāo)峰面積高于選用20%甲醇和80%甲醇定容的峰面積,有可能是當(dāng)定容溶液中水的比例過高時(shí),目標(biāo)物不溶,有機(jī)試劑比例較高時(shí),可能導(dǎo)致部分目標(biāo)物在水相比例較大時(shí)在色譜柱中析出[20]。故本實(shí)驗(yàn)最終選用50%甲醇定容上機(jī)測定。

2.4 方法的定量限

取空白樣品,按照1.2.3方法處理后添加真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)行檢測。以信噪比(S/N)為10計(jì)算得出本方法定量限(LOQ)為AFB1為0.5 μg/kg,AFB2、AFG1、AFG2為1.0 μg/kg,OTA為1.0 μg/kg,FB1、FB2為20 μg/kg。7種真菌毒素在測定方法定量限時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2。

圖2 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of mycotoxin standard solutions注:左邊為該化合物定量離子色譜圖,右邊為定性離子色譜圖。

2.5 方法的線性范圍

在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下,用甲醇-水溶液(50∶50,v/v)配制系列濃度的真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液并分別進(jìn)行測定,以峰面積(Y)對相應(yīng)真菌毒素的濃度(X)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表2),結(jié)果表明AFB1濃度在線性范圍為0.5～10 μg/kg,AFB2、AFG1、AFG2、OTA濃度在線性范圍為1～20 μg/kg,FB1和FB2濃度在線性范圍為20～400 μg/kg時(shí)與其峰面積呈良好線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)(r)在0.995以上。

表2 各種真菌毒素的線性關(guān)系Table 2 Linear relationships of 7 mycotoxins

2.6 方法的回收率和精密度

采用不含以上7種真菌毒素的辣椒、花椒、八角為空白樣品基質(zhì),進(jìn)行3個(gè)水平的添加回收實(shí)驗(yàn),3個(gè)添加量分別為1倍、2倍和10倍的各真菌毒素的測定方法定量限,每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn),分析并測定其精密度及回收率(表3),3個(gè)加標(biāo)水平下平均回收率為67.25%～113.47%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%～10.20%,符合痕量分析的要求,詳見表3。

表3 方法的加標(biāo)回收率和精密度(n=6,%)Table 3 Results of recovery and precision tests(n=6,%)

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)測定香辛料中7種真菌毒素的方法。粉碎后的樣品先用水提取后按比例加入甲醇提取(甲醇-水,70∶30,v/v),多功能免疫親和柱凈化后濃縮,50%甲醇定容,用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。結(jié)果表明:該方法前處理簡單、凈化效果好、靈敏度高和高通量檢測,適用于香辛料中7種真菌毒素殘留的分離和檢測。該方法填補(bǔ)了香辛料中多真菌毒素高通量檢測的空白,能為香辛料中真菌毒素風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供技術(shù)支持。