GNM C78實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)對摻假肉制品中多種動物源性成分的同時檢測

胡連霞,孫曉霞,陳啟躍,周 巍,丁紅田,劉立兵,付 琦,王建昌,*

(1.石家莊海關(guān),河北石家莊 050051;2.河北省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院,河北石家莊 050051;3.北京金諾美生物技術(shù)有限公司,北京 100176;4.河北省食品檢驗(yàn)研究院,河北石家莊 050071;5.河北省動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河北石家莊 050081)

肉及肉制品是否摻假已成為食品安全檢測和監(jiān)管機(jī)構(gòu)亟待解決的問題,依靠感官與經(jīng)驗(yàn)的肉類形態(tài)學(xué)傳統(tǒng)鑒別手段已遠(yuǎn)不能滿足目前肉及肉制品摻假控制與監(jiān)管的需要[1]。近年來,隨著現(xiàn)代儀器分析[2]和分子生物學(xué)方法的不斷發(fā)展,已逐步形成了以蛋白質(zhì)檢測和以核酸檢測為基礎(chǔ)的肉制品摻假鑒別方法體系[3-6]。以核酸為基礎(chǔ)的檢測方法主要通過區(qū)別動物種屬間遺傳信息的差異作為物種鑒別的檢測靶點(diǎn),該方法具有特異性高、方法便捷、不受組織類別限制等諸多優(yōu)勢,已逐漸在食品中肉類成分鑒別中占主導(dǎo)地位[7-10]。

以檢測DNA為基礎(chǔ)的動物源性成分檢測方法主要有常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、多重PCR、DNA條形碼、熒光定量PCR、微滴數(shù)字PCR方法等。而目前實(shí)時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對多種動物源性成分的快速檢測[11-14],并且在日常檢測中得到越來越多的應(yīng)用,金萍等[15]建立的雙重?zé)晒釶CR方法同時檢測DNA混樣中豬、雞源性成分,適用于動物源性產(chǎn)品中豬、雞源性成分的鑒別檢測。侯東軍等[16]建立的三重?zé)晒釶CR能夠定性不定量的同時檢出食品中鴨、牛、豬成分。曾少靈等[17]建立的多重實(shí)時熒光PCR方法能同時鑒別牛、山羊和綿羊源性3種成分,與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比靈敏10 倍,除了適用于飼料,還適用于肉品、奶制品、生皮和動物油脂等動物產(chǎn)品的牛、羊源性成分檢測。雖然熒光PCR方法具有高效、系統(tǒng)、簡便等特點(diǎn),但多重?zé)晒釶CR對引物探針設(shè)計要求高,一個反應(yīng)體系中過多的引物之間容易互相干擾,會導(dǎo)致擴(kuò)增效率低,檢測不準(zhǔn)確[18],而且現(xiàn)有熒光PCR檢測系統(tǒng)一次僅能進(jìn)行一個條件相同的反應(yīng),無法滿足肉及肉制品摻假中多種動物源性成分反應(yīng)體系的不同反應(yīng)條件的同時檢測。

GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)(GNM C7-8)[19-20]采用液態(tài)薄膜金屬涂覆陶瓷加熱方式,具有高導(dǎo)熱性,能夠快速升降溫,一般在40 min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)。GNM C7-8具有獨(dú)立的8模塊設(shè)計,每一模塊設(shè)置獨(dú)立的溫控及光學(xué)檢測系統(tǒng),使得不同模塊之間可以同時或不同時運(yùn)行不同的擴(kuò)增程序,而且每個模塊的數(shù)據(jù)可以單獨(dú)或同時分析處理。8模塊設(shè)計的GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)的每個模塊具有高靈敏度的4通道檢測系統(tǒng),分別為FAM、HEX、TxR和Cy5 4個通道的熒光激發(fā)和吸收波長,自動掃描,無需設(shè)定某一通道。進(jìn)行多靶基因的同時檢測時,無需考慮反應(yīng)的先后順序、不同體系的反應(yīng)條件等,均可實(shí)現(xiàn)對樣品多靶基因的同時實(shí)時監(jiān)測和獨(dú)立分析。

GNM C7-8模塊間可同時或不同時運(yùn)行針對不同靶基因的擴(kuò)增條件,檢測人員可以同時完成多個不同檢測項(xiàng)目的測試,而互不干擾。到目前為止GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)主要應(yīng)用于食源性致病菌的DNA檢測研究,李靜等[21]通過GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)建立了實(shí)時熒光單引物等溫擴(kuò)增檢測阪崎克羅諾桿菌的方法。李瑞等[22]運(yùn)用GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)對大腸桿菌O157進(jìn)行了實(shí)時熒光單引物等溫擴(kuò)增(SPIA)技術(shù)方法研究。王金鳳等[19]成功建立了8種食源性致病菌的GNM C7-8實(shí)時熒光定量PCR同時檢測方法。本研究應(yīng)用GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)對四種人工模擬摻假肉制品中多種動物源性成分進(jìn)行同時檢測并與ABI7500實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)檢測的循環(huán)數(shù)和檢測所需時間進(jìn)行比較,以期得到同時檢測所短時間的摻假檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛、驢、駝鳥、羊、豬、馬、鴨、雞、狐貍9種動物鮮肉 某市場;A1120 DNA Purification Kit試劑盒 Promega公司。

GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng) 北京金諾美生物技術(shù)有限公司;ABI 7500實(shí)時熒光PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;Nanodrop 2000 C分光光度計 賽默飛世爾科技;SQ2119N西貝樂料理機(jī) 上海帥佳電子科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人工模擬摻假肉制品的制備 以日常生活中最常見的四種肉類:牛肉、驢肉、鴕鳥肉和羊肉作為基礎(chǔ),進(jìn)行人工模擬摻假,制備摻假肉制品。具體制作如下:

將牛、驢、駝鳥、羊、豬、馬、鴨、雞、狐貍9種動物鮮肉,分別絞打成沫,于干燥箱中烘干成粉,分別收集于50 mL無菌干燥離心管中,4 ℃冷藏保存,備用。

根據(jù)國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中檢測動物源性成分的檢出限[11-14],使摻假肉粉成分均在檢出范圍之內(nèi),分組如下:

第1組:1.5 mL離心管中49 mg牛肉粉中添加豬肉粉0.5 mg,鴨肉粉0.5 mg,得到摻假牛肉制品共50 mg。

第2組:1.5 mL離心管中49 mg驢肉粉中添加馬肉粉0.5 mg,豬肉粉0.5 mg,得到摻假驢肉制品共50 mg。

第3組:1.5 mL離心管中49 mg鴕鳥肉粉中添加鴨肉粉0.5 mg,雞肉粉0.5 mg,得到摻假鴕鳥肉制品共50 mg。

近段時間以來，受小麥?zhǔn)袌錾鲜辛繙p少的影響，加之市場小麥價格持續(xù)走強(qiáng)，部分地區(qū)制粉企業(yè)已逐步開始采購拍賣糧以滿足生產(chǎn)需求，國家臨儲小麥拍賣成交漸趨好轉(zhuǎn)。

第4組:1.5 mL離心管中48.5 mg羊肉粉中添加鴨肉粉0.5 mg,狐貍?cè)夥?.5 mg,豬肉粉0.5 mg,得到摻假養(yǎng)肉制品共50 mg。

1.2.2 基因組DNA的提取 將4組摻假肉制品按照DNA Purification Kit試劑盒說明書提取DNA,測定DNA濃度,并稀釋使所提取的DNA濃度為50～100 ng/μL,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物、探針的設(shè)計與合成 牛、驢、豬、馬、狐貍5種動物源性成分所用引物和探針采用國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[11-14],駝鳥、羊、雞、鴨4種動物源性成分所用引物和探針自行設(shè)計(具體序列詳見表1),均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 引物和探針序列Table 1 Primer and probe sequences

1.2.4 實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件 9種動物源性成分實(shí)時熒光PCR擴(kuò)增體系均為25 μL[11-14],其中Premix Ex TaqTM12.5 μL,牛、驢、駝鳥、羊、豬、馬、鴨、雞源性成分上下游引物(10 μmol/L)各1 μL,狐貍源性成分上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL,牛、羊、驢、豬、馬源性成分探針(10 μmol/L)1 μL,駝鳥、鴨、雞、狐貍源性成分探針(10 μmol/L)0.5 μL,模板DNA 50～100 ng,用滅菌ddH2O補(bǔ)足25 μL體系。9種動物源性成分實(shí)時熒光PCR的反應(yīng)條件[11-14]如表2所示。

表2 9種動物源性成分的實(shí)時熒光PCR反應(yīng)條件Table 2 Real-time PCR reaction conditions for nine kinds of animal-derived ingredients

1.2.5 人工模擬摻假牛肉中動物源性成分的檢測 將提取的人工模擬摻假牛肉DNA 70.9 ng/μL,取1 μL分別加入到牛源性、豬源性和鴨源性成分的反應(yīng)體系中,并分別置于3個GNM C7-8模塊中,按照表2,設(shè)置每個模塊的反應(yīng)條件,同時開始運(yùn)行牛、豬和鴨源性成分?jǐn)U增程序,分析每個模塊中動物源性成分的檢測情況。

同時以相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件于ABI 7500上,分別進(jìn)行牛、豬和鴨源性成分的檢測,其檢測結(jié)果與同GNM C7-8系統(tǒng)上的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

同時以相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件于ABI 7500上,分別進(jìn)行驢、馬和豬源性成分的檢測,其檢測結(jié)果同GNM C7-8系統(tǒng)上的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.7 人工模擬摻假鴕鳥肉中動物源性成分的檢測 將提取的人工模擬摻假鴕鳥肉DNA 93.2 ng/μL,取1 μL分別加入到鴕鳥源性、鴨源性和雞源性的反應(yīng)體系中,并分別置于3個GNM C7-8模塊中,按照表2,設(shè)置每個模塊的反應(yīng)條件,同時開始運(yùn)行鴕鳥、鴨和雞源性成分的擴(kuò)增程序,分析每個模塊中動物源性成分的檢測情況。

同時以相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件于ABI 7500上,分別進(jìn)行鴕鳥、鴨和雞源性成分的檢測,其檢測結(jié)果與GNM C7-8的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.8 人工模擬摻假羊肉中動物源性成分的檢測 將提取的人工模擬摻假羊肉DNA 97.6 ng/μL,取1 μL分別加入到羊源性、鴨源性、狐貍源性和豬源性的反應(yīng)體系中,并分別置于4個GNM C7-8模塊中,按照表2,設(shè)置每個模塊的擴(kuò)增程序,同時開始運(yùn)行羊、鴨、狐貍和豬源性成分的擴(kuò)增程序,分析每個模塊中動物源性成分的檢測情況。

同時以相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件于ABI 7500上,分別進(jìn)行羊、鴨、狐貍和豬源性成分的檢測,其檢測結(jié)果同GNM C7-8的檢測結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3 數(shù)據(jù)處理

如有FAM熒光檢出,且GNM C7-8系統(tǒng)的循環(huán)數(shù)≤35.0,則判定樣品含有相應(yīng)的動物源性成分,并且循環(huán)數(shù)越小,擴(kuò)增起峰時間越短,說明系統(tǒng)靈敏度越高。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工模擬摻假牛肉中動物源性成分的檢測

牛、豬、鴨3種動物源性成分在GNM C7-8系統(tǒng)中檢測,結(jié)果良好,其擴(kuò)增曲線如圖1A所示。靶基因在GNM C7-8中均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,牛、豬、鴨源性成分?jǐn)U增起峰的循環(huán)數(shù)分別為26、31、32。ABI 7500系統(tǒng)中(圖1B～圖1D),牛、豬、鴨源性成分?jǐn)U增起峰的循環(huán)數(shù)分別為27、31、30。兩種系統(tǒng)的的檢測結(jié)果一致,GNM C7-8系統(tǒng)能夠同時實(shí)現(xiàn)對牛、豬和鴨源性成分的獨(dú)立檢測,各反應(yīng)模塊之間互不干擾,同時獲得陽性結(jié)果所需要時間明顯少于ABI 7500。

圖1 人工模擬摻假牛肉中牛、豬、鴨源性成分檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of bovine,porcine and duck-derived ingredients from artificial adulterated bovine meat注:1:牛源性成分?jǐn)U增曲線;2:豬源性成分?jǐn)U增曲線;3:鴨源性成分?jǐn)U增曲線;A:GNM C7-8系統(tǒng)檢測摻假牛肉、 豬肉、鴨肉中動物源性成分的圖譜;B～D:分別為ABI 7500系統(tǒng)檢測摻假牛肉、豬肉、鴨肉中動物源性成分的圖譜。

2.2 人工模擬摻假驢肉中動物源性成分的檢測

驢、馬、豬3種動物源性成分在GNM C7-8系統(tǒng)中檢測結(jié)果良好,其擴(kuò)增曲線如圖2A所示。靶基因在GNM C7-8中均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,驢、馬、豬源性成分?jǐn)U增起峰的循環(huán)數(shù)分別為15、29、32。ABI 7500系統(tǒng)中(圖2B～圖2D),驢、馬、豬源性成分?jǐn)U增起峰的循環(huán)數(shù)分別為19、27、32。兩種系統(tǒng)的檢測結(jié)果基本一致,GNM C7-8系統(tǒng)能夠同時實(shí)現(xiàn)對驢、馬和豬源性成分的獨(dú)立檢測,各反應(yīng)模塊之間互不干擾,同時獲得陽性結(jié)果所需要時間明顯少于ABI 7500。

圖2 人工模擬摻假驢肉中驢、馬、豬源性成分檢測曲線Fig.2 Detection results of donkey,horse and porcine-derived ingredients from artificial adulterated donkey meat注:1:驢源性成分?jǐn)U增曲線;2:馬源性成分?jǐn)U增曲線;3:豬源性成分?jǐn)U增曲線;A：GNM C7-8系統(tǒng)檢測摻假驢肉、 馬肉、豬肉中動物源性成分的圖譜;B～D：分別為ABI 7500系統(tǒng)檢測摻假驢肉、馬肉、豬肉中動物源性成分的圖譜。

2.3 人工模擬摻假鴕鳥肉中動物源性成分的檢測

鴕鳥、鴨和雞3種動物源性成分在GNM C7-8系統(tǒng)中檢測結(jié)果良好,其擴(kuò)增曲線如圖3A所示。靶基因在GNM C7-8中均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,鴕鳥、鴨、雞源性成分?jǐn)U增起峰的循環(huán)數(shù)分別為25、30、32。ABI 7500系統(tǒng)中(圖3B～圖3D),鴕鳥、鴨、雞源性成分?jǐn)U增起峰的循環(huán)數(shù)分別為27、31、31。兩種系統(tǒng)的檢測結(jié)果基本一致,GNM C7-8系統(tǒng)能夠同時實(shí)現(xiàn)對鴕鳥、鴨和雞源性成分的獨(dú)立檢測,各反應(yīng)模塊之間互不干擾,同時獲得陽性結(jié)果所需要時間明顯少于ABI 7500。

圖3 人工模擬摻假鴕鳥肉中鴕鳥、鴨、雞源性成分檢測曲線Fig.3 Detection results of ostrich,duck and chicken-derived ingredients from artificial adulterated ostrich meat注:1:鴕鳥源性成分?jǐn)U增曲線;2:鴨源性成分?jǐn)U增曲線;3:雞源性成分?jǐn)U增曲線;A:GNM C7-8系統(tǒng)檢測摻假鴕鳥肉、 鴨肉、雞肉中動物源性成分的圖譜;B～D：分別為ABI 7500系統(tǒng)檢測摻假鴕鳥肉、鴨肉、雞肉中動物源性成分的圖譜。

2.4 人工模擬摻假羊肉中動物源性成分的檢測結(jié)果

羊、鴨、狐貍和豬4種動物源性成分在GNM C7-8系統(tǒng)中檢測結(jié)果良好,其擴(kuò)增曲線如圖4A所示。靶基因在GNM C7-8中均出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線,羊、鴨、狐貍、豬源性成分?jǐn)U增起峰的循環(huán)數(shù)分別為24、30、25、29。ABI 7500系統(tǒng)中(圖4B～圖4E),羊、鴨、狐貍、豬源性成分?jǐn)U增起峰的循環(huán)數(shù)分別為25、31、25、31。兩種系統(tǒng)檢測結(jié)果一致,GNM C7-8系統(tǒng)能夠同時實(shí)現(xiàn)對羊、鴨、狐貍和豬源性成分的獨(dú)立檢測,各反應(yīng)模塊之間互不干擾,同時獲得陽性結(jié)果所需要時間明顯少于ABI 7500。

圖4 人工模擬摻假羊肉中羊、鴨、狐貍、豬源性成分檢測結(jié)果Fig.4 Detection result of ovine,duck,fox and porcine-derived ingredients from artificial adulterated ovine meat注:1:羊源性成分?jǐn)U增曲線;2:鴨源性成分?jǐn)U增曲線;3:狐貍源性成分?jǐn)U增曲線;4:豬源性成分?jǐn)U增曲線;A:GNM C7-8系統(tǒng)檢測摻假羊肉、鴨肉、狐貍?cè)?、豬肉中動物源性成分的圖譜;B～E:分別為ABI 7500系統(tǒng)檢測摻假羊肉、鴨肉狐貍?cè)?、豬肉動物源性成分的圖譜。

3 結(jié)論與討論

本研究基于GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了對牛肉、驢肉、鴕鳥肉和羊肉等4組人工模擬摻假肉制品中多種動物源性成分的同時檢測。在GNM C7-8系統(tǒng)中,4組摻假肉制品中不同動物源性成分在獨(dú)立的反應(yīng)模塊中,能夠得到同時檢測,均顯示擴(kuò)增良好,與ABI7500實(shí)時熒光PCR檢測結(jié)果一致,而且所需時間明顯少于ABI7500。

為實(shí)現(xiàn)對肉制品中多種動物源性成分的同時檢測,已經(jīng)建立了系列基于基因芯片技術(shù)[23-24]和多重實(shí)時熒光PCR的方法[25-26]。雖然這些方法能夠?qū)崿F(xiàn)對多種動物源性成分的高通量檢測,但基因芯片技術(shù)檢測成本比較高,不易于基層普及,而多重實(shí)時熒光PCR方法對引物探針的設(shè)計要求較高,基因擴(kuò)增易出現(xiàn)重合,出現(xiàn)某一或者幾個基因擴(kuò)增效率低,導(dǎo)致定量檢測不準(zhǔn)確,甚至出現(xiàn)定性也無法判定的情況。GNM C7-8系統(tǒng)的最大優(yōu)勢是基于模塊化設(shè)計,每個模塊可單獨(dú)進(jìn)行一個或多個靶基因的擴(kuò)增反應(yīng),且互不干擾。本研究中,GNM C7-8可以實(shí)現(xiàn)多種不同動物源性成分的同時檢測,而且只需要針對單一動物源性成分進(jìn)行檢測條件的優(yōu)化設(shè)計,不僅能降低引物設(shè)計難度,降低合成成本,也能獲得最佳的檢測靈敏度和特異性。

GNM C7-8實(shí)時熒光PCR系統(tǒng)能夠滿足重大公共安全衛(wèi)生事件、突發(fā)食品安全事件和口岸快速通關(guān)等領(lǐng)域的多靶基因快速檢測需要,實(shí)現(xiàn)快速響應(yīng)檢測,為保障食品安全提供有力的設(shè)備支撐。