一株產(chǎn)膠原蛋白酶細(xì)菌的鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

李茂琳,譚 軍,王紅英,王 迪,張 宇,徐 桐,錢斯日古楞,*

(1.大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034;2.內(nèi)蒙古河套農(nóng)牧業(yè)技術(shù)研究院,內(nèi)蒙古巴彥淖爾 015000)

膠原蛋白是一種纖維蛋白,在生物結(jié)構(gòu)中起著連接作用,是許多生物體中最豐富的蛋白分子之一,具有良好的生物相容性、低免疫原性、可再生性等功能活性,在食品、保健品、生物藥品、化妝品、新能源功能材料等行業(yè)中都有著廣泛的應(yīng)用[1-3]。因其有特殊的三螺旋多肽鏈結(jié)構(gòu),分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定,因此難以提取也難以被利用[4]。利用膠原蛋白酶將膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)打開后得到的膠原短肽,更為完整的保留了其生物活性,更易于被人體吸收利用,具有很好的可消化性、抗氧化性、促進(jìn)皮膚代謝、消除體內(nèi)自由基等諸多生理活性[5-6]。

目前,已知產(chǎn)膠原蛋白酶的微生物有枯草芽孢桿菌[7]、蠟樣芽孢桿菌[8]、嗜蟲沙雷氏菌、放線菌[9-10]等,其中嗜蟲沙雷氏菌的酶活最高,為98.37 U/mL[11]。微生物源的膠原蛋白酶相比從動物、植物體中分離出的種類少,關(guān)于膠原酶產(chǎn)生菌株的開發(fā)以及所產(chǎn)膠原酶的研究也相對較少,且大多因產(chǎn)量少、酶活低、安全性低等諸多原因不適合大規(guī)模生產(chǎn)[12-13]。有研究表明,海參腸道中存在的大量蛋白酶導(dǎo)致其自溶[14],且溶解后不影響其食用安全性[15],故海參源菌株產(chǎn)出的膠原蛋白酶具有一定的高產(chǎn)性和安全性。

因此,本實驗對一株從海參腸道中分離出的已知產(chǎn)胞外膠原蛋白酶的菌株AL-13進(jìn)行鑒定及產(chǎn)酶條件優(yōu)化,以期獲得安全、便捷、高效、低成本、高產(chǎn)量的膠原酶生產(chǎn)方法,為使用膠原蛋白酶獲得膠原蛋白以及對膠原蛋白的利用和工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù),具有良好的研究前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)膠原蛋白酶菌株AL-13 本實驗室在前期工作中從海參腸道中篩選、保存并提供;牛肉膏、蛋白胨、酵母膏 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;聚乙烯醇、吐溫-20、明膠 均為化學(xué)純,天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;瓊脂、氫氧化鈉、氯化鈉、無水氯化鈣、硫酸銨、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、植酸鈣 均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;種子培養(yǎng)基:酵母膏10 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 5 g/L,pH6.5～8.5;LB培養(yǎng)基:酵母膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,pH7.0～7.4;固體LB培養(yǎng)基:酵母膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,瓊脂2%,pH7.0～7.4。

FA1204B電子分析天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HH-S6/ZK6雙列六孔數(shù)顯控溫恒溫水浴鍋 鞏義市英峪予華儀器廠;80-2型離心沉淀機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠;PHS-3B精密pH計 上海雷磁儀廠;HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司;721可見分光光度計 上海第三分析儀器廠;YXQ-50A立氏壓力高溫干熱滅菌鍋 上海博遠(yuǎn)實業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的形態(tài)特征觀察、生理生化特征分析及16S rDNA基因序列分析 將菌株AL-13涂布于固體LB培養(yǎng)基上,30 ℃條件下培養(yǎng)24 h長出單菌落,觀察其菌落形態(tài)特征。在固體培養(yǎng)基平板上挑取單菌落,用無菌水稀釋制成菌懸液,將菌懸液涂于載玻片上自然風(fēng)干,通過掃描電鏡觀察菌體形態(tài)特征;參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[16]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[17]進(jìn)行生理生化特征分析;將菌體移交至大連寶生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA基因序列分析。

1.2.2 種子液制備、酶活測定

1.2.2.1 種子液的制備 挑選保存于斜面培養(yǎng)基上的單菌落接種至固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行活化,30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,長出菌落后挑取一個飽滿單菌落接種于50 mL液體種子培養(yǎng)基中,置于30 ℃、180 r/min的搖床中搖瓶培養(yǎng)24 h,即得種子液,通過稀釋平板計數(shù)法測得此時種子液中細(xì)菌的濃度約為108cfu/mL。種子液應(yīng)于4 ℃保存,使用時間不宜超過3 d。

1.2.2.2 酶活力的測定 參考SB/T10317-1999《中華人民共和國行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活力測定法》,采用Folin-酚法,以酪蛋白為底物,酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物,對發(fā)酵上清液中的酶活進(jìn)行測定[18]。相對酶活為試驗中各因素的吸光度與其中最大吸光度的百分比。

1.2.2.3 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確配制濃度分別為0、20、40、60、100 μg/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,與Folin-酚試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)后分別測定其吸光度,以吸光度值為縱坐標(biāo),酪氨酸濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程y=0.0101x-0.004,R2=0.9991。酶活定義為在40 ℃條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的量為1個酶活力單位(U)。

1.2.3 單因素實驗確定培養(yǎng)條件 將AL-13種子液以4%的接種量接種于自然pH的LB培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng),于30 h取樣測定酶活為16.14 U/mL,此為菌株AL-13優(yōu)化前的酶活,在此基礎(chǔ)上對菌株AL-13的培養(yǎng)條件及產(chǎn)酶培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

將AL-13種子液以4%的接種量接種于自然pH的LB培養(yǎng)基中,于30 ℃、180 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng),分別于12、24、30、36、48、54、60 h取樣后測定酶活,計算相對酶活,確定最佳培養(yǎng)時間;將菌株以4%接種量接種于自然pH的LB培養(yǎng)基中,在溫度分別為20、25、30、35、40、45、50 ℃的條件下以180 r/min速度搖瓶培養(yǎng)至48 h后,確定最佳培養(yǎng)溫度;將菌株以4%的接種量分別接種于pH為4、5、6、7、8、9、10的LB培養(yǎng)基中,在25 ℃條件下培養(yǎng)48 h后,確定最佳初始pH;將菌株以2%、4%、6%、8%、10%的接種量分別接種至pH為8的LB培養(yǎng)基中,在25 ℃下培養(yǎng)48 h后,確定最佳接種量。

1.2.4 單因素實驗確定培養(yǎng)基組份

1.2.4.1 碳源及碳源濃度對產(chǎn)酶的影響 以1.2.3得到的最佳培養(yǎng)條件為基礎(chǔ),固定LB培養(yǎng)基其他成分,分別選取蛋白胨、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、可溶性淀粉作為唯一碳源,濃度均為10 g/L,搖瓶培養(yǎng)后測定酶活,計算相對酶活,確定最佳碳源;添加濃度分別為1、3、5、10、15、20 g/L的最佳碳源物質(zhì),搖瓶培養(yǎng)后測定相對酶活,確定最佳濃度。

1.2.4.2 氮源及氮源濃度對產(chǎn)酶的影響 確定葡萄糖濃度10 g/L,固定LB培養(yǎng)基其他成分不變,分別選取酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、明膠、尿素、硫酸銨為唯一氮源,添加量均為10 g/L,搖瓶培養(yǎng)后確定最佳氮源;添加濃度分別為1、3、5、10、15、20 g/L的最佳氮源物質(zhì),搖瓶培養(yǎng)后確定最佳濃度。

1.2.4.3 氯化鈉濃度對產(chǎn)酶的影響 采用最佳碳源和氮源的最佳濃度,添加氯化鈉濃度分別為0.5、1、3、5、10、15 g/L,搖瓶培養(yǎng)后確定最佳氯化鈉濃度。

1.2.4.4 金屬離子及離子濃度對產(chǎn)酶的影響 向單因素確定的最佳培養(yǎng)基中額外添加鈣離子、銅離子、鎂離子、亞鐵離子、鋅離子、錳離子,使其濃度分別達(dá)到0.05、0.10、0.15、0.20、0.40、0.60、1.00 g/L,以不額外加金屬離子的培養(yǎng)基為對照,搖瓶培養(yǎng)后確定最適金屬離子及濃度。

1.2.4.5 產(chǎn)酶促進(jìn)劑及濃度對產(chǎn)酶的影響 許多產(chǎn)酶促進(jìn)劑能夠促使蛋白酶產(chǎn)生菌的生長繁殖,對有些酶起到激活作用,提高產(chǎn)酶量[19]。在1.2.4.4已確定的培養(yǎng)基組份中分別添加聚乙烯醇、醋酸鈉、吐溫-20、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、植酸鈣,添加量均為3 g/L,以不加產(chǎn)酶促進(jìn)劑的培養(yǎng)基為對照,搖瓶培養(yǎng)后確定最佳產(chǎn)酶促進(jìn)劑;選取濃度為1、3、5、10、15 g/L的最佳產(chǎn)酶促進(jìn)劑物質(zhì),搖瓶培養(yǎng)后確定其濃度。

1.2.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基 在單因素實驗確定培養(yǎng)基組成成份的基礎(chǔ)上,以培養(yǎng)基組份中的五個因素為研究對象,采用響應(yīng)面試驗設(shè)計考察培養(yǎng)基各組分的主效應(yīng)及交互效應(yīng)對菌株積累膠原蛋白酶的影響,對培養(yǎng)基的組成進(jìn)一步優(yōu)化[20]。采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理,設(shè)計5因素3水平的響應(yīng)面試驗,以葡萄糖(A)、牛肉膏(B)、氯化鈣(C)、磷酸氫二鉀(D)、氯化鈉(E)為自變量,發(fā)酵液內(nèi)膠原蛋白酶活性Y(U/mL)為響應(yīng)值。每組實驗設(shè)三個平行,重復(fù)兩次,取各組數(shù)據(jù)的均值進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。試驗因素與水平的選取見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken

1.3 數(shù)據(jù)處理

菌株鑒定結(jié)果通過NCBI中BLAST功能進(jìn)行同源性比對分析,選取與實驗菌種同源性90%以上的菌株分析比對結(jié)果并使用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹;單因素試驗優(yōu)化培養(yǎng)條件用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,并用Origin 9.0作圖;用SPSS 21.0軟件進(jìn)行方差分析(ANOVA);用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,并對46組試驗結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的生理生化特征測定及菌種鑒定

AL-13在固體平板培養(yǎng)基上的菌落為乳白色圓形,直徑約2～5 mm,菌落不透明,表面光滑,邊緣整齊,中間微凸起,有輕微辛辣味。在掃描電鏡下放大6900倍,如圖1,菌體為橢圓形,直徑約1.3～1.8 μm。

圖1 AL-13掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of AL-13

AL-13的生理生化特征鑒定見表2。結(jié)果表明該菌為革蘭氏陰性菌,有芽孢生成,可降解明膠,生長過程中產(chǎn)酸產(chǎn)氣,具有接觸酶、氧化酶、淀粉酶等多種酶活性。

表2 AL-13生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of AL-13

將與AL-13的16S rDNA基因序列同源性90%以上的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,由圖2可知該菌與Brevibacilluslaterosporusstrain BGSC 40A10、Brevibacilluslaterosporusstrain KMM5等12株菌的親緣關(guān)系非常近,尤其與Brevibacilluslaterosporusstrain NRRL NRS-314的同源性達(dá)到了100%,結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征可將菌株AL-13鑒定芽孢桿菌屬中的側(cè)孢短芽孢桿菌。

圖2 AL-13的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of AL-13

2.2 培養(yǎng)條件單因素實驗結(jié)果

2.2.1 培養(yǎng)時間的確定 由圖3a可知,在培養(yǎng)12 h時細(xì)菌開始產(chǎn)酶,在培養(yǎng)至24 h時,酶積累量開始快速增多,到48 h相對酶活達(dá)到最高,48 h后開始下降。這可能是因為在發(fā)酵培養(yǎng)前期菌量多,使得酶積累量增多,到后期菌體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎?不再產(chǎn)酶,而原先積累的酶又有所消耗,使得相對酶活降低。因此確定最佳培養(yǎng)時間為48 h。

圖3 不同培養(yǎng)條件下所產(chǎn)膠原蛋白酶的相對酶活變化Fig.3 Changes of relative enzyme activity of collagen proteinase produced under different culture conditions

2.2.2 培養(yǎng)溫度的確定 由圖3b可知,在25 ℃的條件下培養(yǎng),相對酶活達(dá)到最高,繼續(xù)提高溫度,相對酶活開始降低,至45 ℃時幾乎失活,因此確定最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃。由于海洋環(huán)境溫度較低,此為海洋菌株,所以培養(yǎng)溫度相對較低[21]。

2.2.3 初始pH的確定 由圖3c可知,菌株在初始pH小于6、大于9的培養(yǎng)基中培養(yǎng),相對酶活隨著pH逐漸極端化在快速降低,而在pH為6～9的條件下培養(yǎng),相對酶活較高,在初始pH為8時,相對酶活達(dá)到最大值,因此確定最佳初始pH為8,這與Yang等[22]對側(cè)孢短芽孢桿菌的研究一致。

2.2.4 接種量的確定 由圖3d可知,當(dāng)接種量由2%開始增加時,相對酶活逐漸增大,這可能是因為增加初始菌體的量導(dǎo)致菌體生長加快、發(fā)酵周期縮短。當(dāng)接種量達(dá)到6%時,相對酶活達(dá)到最高,高于6%后又出現(xiàn)下降趨勢,這可能是因為過高的接種量使得底物更多的用于菌體生長,而用于產(chǎn)酶的量減少[23]。因此確定最佳接種量為6%。

2.2.5 最優(yōu)培養(yǎng)條件下酶活 得到菌株AL-13產(chǎn)膠原蛋白酶的最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)時間48 h、培養(yǎng)溫度25 ℃、初始pH8.0、接種量6%。在此培養(yǎng)條件下使用LB培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),酶活達(dá)到73.77 U/mL,比優(yōu)化前(16.14 U/mL)提高了約4.5倍。

2.3 培養(yǎng)基單因素優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 最佳碳源及碳源濃度的確定 如圖4a所示,以葡萄糖為碳源時,相對酶活達(dá)到最高,因此選擇葡萄糖作為最佳碳源;如圖4b所示,葡萄糖濃度由1 g/L增加到10 g/L時,相對酶活快速升高,當(dāng)葡萄糖濃度大于10 g/L時相對酶活開始下降,這可能是因為高濃度的葡萄糖增大了細(xì)胞的滲透壓,抑制菌體的生長[24]。因此培養(yǎng)基葡萄糖初始濃度應(yīng)控制在10 g/L。

圖4 培養(yǎng)基單因素篩選結(jié)果Fig.4 Single factors screening of culture medium

2.3.2 最佳氮源及氮源濃度的確定 如圖4c所示,以牛肉膏為氮源時,相對酶活遠(yuǎn)高于其他氮源,且牛肉膏的營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富,含氮量也高于其他氮源[25],因此選擇牛肉膏作為最佳氮源;如圖4d所示,牛肉膏濃度由1 g/L增加到10 g/L時,相對酶活持續(xù)上升,當(dāng)牛肉膏濃度大于10 g/L時相對酶活開始下降,因此培養(yǎng)基牛肉膏初始濃度應(yīng)控制在10 g/L。

2.3.3 氯化鈉濃度的確定 不同的鹽濃度對菌體產(chǎn)酶也有一定的影響,如圖4e所示,氯化鈉濃度由1 g/L增加到10 g/L時,相對酶活快速上升,當(dāng)氯化鈉濃度大于10 g/L時則開始下降,因此培養(yǎng)基氯化鈉初始濃度應(yīng)控制在10 g/L,產(chǎn)生此種現(xiàn)象的原因還需要進(jìn)一步的研究。

2.3.4 金屬離子及離子濃度的確定 如圖4f所示,鈣離子、鎂離子和錳離子對產(chǎn)酶均有促進(jìn)作用,其中鈣離子的促進(jìn)作用更為顯著。這與一定濃度的鈣離子對大多數(shù)酶都具有激活作用的現(xiàn)象一致,鈣離子結(jié)合在酶的特定位點,可以加強(qiáng)酶的穩(wěn)定性[26]。亞鐵離子隨其濃度增加,由促進(jìn)轉(zhuǎn)為抑制。銅離子和鋅離子對產(chǎn)酶有明顯抑制作用。綜上所述,金屬離子選擇鈣離子,添加濃度控制在0.2 g/L。

2.3.5 產(chǎn)酶促進(jìn)劑及濃度的確定 如圖4g所示,磷酸氫二鉀膠原蛋白酶相對酶活最高,這可能是由于磷酸鹽為微生物的生長提供了營養(yǎng)[27],因此選擇磷酸氫二鉀為最佳產(chǎn)酶促進(jìn)劑。如圖4h所示,磷酸氫二鉀濃度大于5 g/L時,酶活開始呈現(xiàn)下降趨勢,因此磷酸氫二鉀濃度應(yīng)控制在5 g/L。

2.4 培養(yǎng)基響應(yīng)面實驗結(jié)果

2.4.1 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果 Box-Behnken試驗方案及結(jié)果見表3。根據(jù)Box-Behnken結(jié)果,利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進(jìn)行擬合,得到五個自變量因素的二次多項回歸方程:Y=144.27-14.78A+19.67B+0.49C-10.97D+7.91E-22.96AB+2.85AC-9.01AD+16.41AE-7.35BC-18.41BD-20.47BE+28.88CD+1.62CE-0.87DE-23.65A2-53.65B2-23.69C2-21.04D2-19.46E2。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

由F檢驗可知,各因素對酶活的影響主次順序為:B>A>D>E>C,其中葡萄糖、牛肉膏、氯化鈣、磷酸氫二鉀均對酶活的線性影響極顯著;各因素的交互作用中AC、BC、CE、DE曲面效應(yīng)不顯著,AD顯著(p<0.05),AB、CD、BE、BD、AE達(dá)到極顯著(p<0.0001)。而在各因素的平方項中,A2、B2、C2、D2、E2均達(dá)到了極顯著(p<0.0001),表明各因素對酶活的影響較大。

2.4.3 響應(yīng)曲面及等高線分析 對交互作用曲面效應(yīng)達(dá)到極顯著和顯著水平的因素利用Design-Expert繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖,即葡萄糖和牛肉膏濃度、磷酸氫二鉀和氯化鈣濃度、氯化鈉和牛肉膏濃度、葡萄糖和氯化鈉濃度、磷酸氫二鉀和牛肉膏濃度、磷酸二氫鉀和葡萄糖濃度對膠原蛋白酶活性的影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖。如圖5所示。

圖5 交互作用極顯著因素對酶活影響的響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour map of the interaction of very significant factors on enzyme activity注:(a):葡萄糖和牛肉膏濃度對酶活性的影響;(b):葡萄糖和氯化鈉濃度對酶活性的影響;(c):氯化鈉和牛肉膏濃度對酶活性的影響;(d):磷酸氫二鉀和牛肉膏濃度對酶活性的影響;(e):磷酸氫二鉀和氯化鈣濃度對酶活性的影響;(f):葡萄糖和磷酸氫二鉀濃度對酶活的影響。

響應(yīng)曲面的坡度變化、等高線的形狀及緊密程度都反映著因子之間的交互作用,響應(yīng)曲面坡度的平緩與陡峭程度可以表明培養(yǎng)基含量變化對膠原蛋白酶活力的響應(yīng)靈敏程度。等高線的形狀可以反映交互項對響應(yīng)值影響的強(qiáng)弱,圓形表示交互作用對響應(yīng)值的影響不顯著,橢圓形表示交互作用對響應(yīng)值的影響顯著[31]。由圖5可以直觀的反映出AB、CD、BE、BD、AE、AD之間的交互作用均對側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)膠原酶的酶活有顯著影響(p<0.05或p<0.01),等高線圖均呈橢圓形,進(jìn)一步說明交互作用的顯著性。

2.4.4 最佳產(chǎn)酶條件的確定及驗證試驗 從圖5中可看出膠原酶活力響應(yīng)值存在最大值,由求得的最優(yōu)回歸方程得到酶活力達(dá)到最大值時的最優(yōu)培養(yǎng)基為:葡萄糖8.14 g/L、牛肉膏11.63 g/L、氯化鈣0.17 g/L、磷酸氫二鉀2.08 g/L、氯化鈉9.48 g/L,此時的最大酶活力為154.89 U/mL。為檢驗試驗結(jié)果的可靠性,采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行3次平行試驗。得到的酶活分別為157.13、149.28、152.76 U/mL,平均值為(153.06±3.73) U/mL,此結(jié)果與預(yù)測值接近,相對誤差為0.04%,表明該模型能夠準(zhǔn)確的預(yù)測實際值,具有一定的實用價值。

3 結(jié)論

通過菌株的形態(tài)特征、生理生化特征及菌種鑒定得出實驗菌株AL-13為側(cè)孢短芽孢桿菌。對其產(chǎn)膠原蛋白酶的條件進(jìn)行優(yōu)化,得到最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)時間48 h、培養(yǎng)溫度25 ℃、初始pH8.0、接種量6%,最適培養(yǎng)基為葡萄糖8.14 g/L、牛肉膏11.63 g/L、氯化鈣0.17 g/L、磷酸氫二鉀2.08 g/L、氯化鈉9.48 g/L。在該產(chǎn)酶條件下膠原蛋白酶活力預(yù)測值為154.89 U/mL,驗證培養(yǎng)得到膠原蛋白酶活力為(153.06±3.73) U/mL,產(chǎn)酶條件優(yōu)化后的酶活(153.06 U/mL)較優(yōu)化前(16.14 U/mL)提高了9.5倍。本實驗成功優(yōu)化了一株產(chǎn)膠原蛋白酶細(xì)菌的產(chǎn)酶條件,為微生物來源的膠原蛋白酶的研究提供了一定的理論指導(dǎo),對將膠原蛋白酶大規(guī)模的應(yīng)用于實際生產(chǎn)以獲得高質(zhì)量的膠原短肽提供了理論依據(jù),具有良好的研究前景。