植物乳桿菌微膠囊包載效果、物化性質(zhì)及其胃腸道性能

姚澤晨,張根義

(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無錫 214122)

植物乳桿菌屬乳酸菌,是一種厭氧或兼性厭氧的益生菌[1],適宜生長(zhǎng)溫度為30～35 ℃。目前研究證實(shí)植物乳桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群異常、預(yù)防腸道感染、增強(qiáng)免疫功能、調(diào)節(jié)消化道蠕動(dòng)等益生功能[2]。研究表明益生菌到達(dá)腸道的數(shù)量須在107cfu/mL以上才能夠發(fā)揮其對(duì)腸道的益生作用。但植物乳桿菌對(duì)胃液的酸性環(huán)境敏感,在經(jīng)胃腸液消化后[3-4],到達(dá)腸道的數(shù)量將顯著減少[5-6],活性驟失,并且由于條件的限制使得一些保護(hù)菌體的方式不能應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)[7]。

采用新的技術(shù)以及方法對(duì)益生菌進(jìn)行保護(hù)正在引起人們的關(guān)注,將益生菌膠囊化是保護(hù)其活性和數(shù)量較為有效的方式[7-8]。微膠囊材料可隔絕外界光、熱以及氧氣,可防止其對(duì)菌體產(chǎn)生不利影響[9-10],且與活性物質(zhì)有較好的生物相容性,并且其材料對(duì)pH以及電解質(zhì)濃度變化不敏感,穩(wěn)定性好,且易儲(chǔ)存[11]。

目前,較為常見的微膠囊包載材料為海藻酸鈉,因其形成的微膠囊表面孔徑較大,不能完全防止酸液進(jìn)入,而且在較低的pH條件下,海藻酸鈉分子會(huì)降解,導(dǎo)致微膠囊穩(wěn)定性變差,因此單獨(dú)包載益生菌時(shí),無法較好地抵抗胃腸液的破壞。復(fù)合包載材料制備微膠囊作為一種新型復(fù)合包載技術(shù),包載效果有待研究,相關(guān)報(bào)道較少。由于阿拉伯木聚糖具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性,在漆酶作用下其體系內(nèi)部會(huì)發(fā)生共價(jià)交聯(lián),形成具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠[12]。因此本文擬定以海藻酸鈉與阿拉伯木聚糖為復(fù)合材料包載植物乳桿菌,通過檢測(cè)其包埋效率、包埋產(chǎn)率、耐酸性、腸溶性以及儲(chǔ)藏特性,對(duì)其保護(hù)性能進(jìn)行評(píng)價(jià),以期制備一種新型高效的微膠囊材料,為復(fù)合包載技術(shù)的應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌N1 實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;阿拉伯木聚糖 食品質(zhì)量與安全中心實(shí)驗(yàn)室;漆酶(38429) 中國上海Sigma-Aldrich;胰酶、海藻酸鈉、胃蛋白酶、其他試劑均為AR試劑級(jí) 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;MRS營養(yǎng)肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基、磷酸緩沖液(PBS)、模擬胃液、模擬腸液[2]自行配制。

WX-75211-30數(shù)顯型齒輪泵 美國Cole-Parmer公司;H01-1A恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦科學(xué)儀器儀表制造有限公司;AR2130電子精密天平、MB120水分含量測(cè)定儀 奧豪斯國際貿(mào)易(上海)有限公司;MX-F渦旋振蕩器 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司;RJ-LD-50G低速離心機(jī) 無錫市瑞江分析儀器有限公司;SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司;MLS-3750壓力蒸汽滅菌鍋 日本Sanyo;ULTRA-TURRAX T8均質(zhì)機(jī) 德國IKA公司;ULT1786超低溫冰箱 美國Asheville North Carolina;SU1510掃描電子顯微鏡 荷蘭FEI公司;S3500激光粒度分析儀 美國Microtrac公司;IS10傅里葉變化紅外光譜儀 美國Nicolet公司;UV-1280紫外可見分光光度計(jì) 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;PYX-DHS 500-BS隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;THZ-82A水浴恒溫振蕩器 新瑞儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物乳桿菌N1的活化培養(yǎng) 取保存于-80 ℃冰箱的植物乳桿菌N1,于超凈工作臺(tái)中操作,在MRS瓊脂培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),37 ℃,48 h,挑取單個(gè)菌落接種到MRS營養(yǎng)肉湯中,并在37 ℃下培養(yǎng)24 h,然后進(jìn)行傳代培養(yǎng)2～3次,使其完全活化[13]。

1.2.2 植物乳桿菌N1生長(zhǎng)曲線的繪制 將活化完全的植物乳桿菌N1按5%的比例接種到滅菌的MRS營養(yǎng)肉湯中,并在37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h,每2 h測(cè)定菌懸液OD600,繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.3 濃縮菌懸液的制備 將活化完全的植物乳桿菌N1以3%的比例接種到200 mL滅菌的MRS營養(yǎng)肉湯中,37 ℃靜置培養(yǎng)16 h(對(duì)數(shù)期),然后將此培養(yǎng)液于4 ℃,4000 r/min,低速離心15 min收集菌泥,并用無菌水洗滌兩次,然后懸浮于10 mL 0.9%的無菌生理鹽水中,其菌體數(shù)量在1010～1011cfu/mL左右,后期可進(jìn)行平板培養(yǎng)對(duì)其精確計(jì)數(shù),4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆肹9]。

1.2.4 活菌平板計(jì)數(shù) 于超凈工作臺(tái)中,準(zhǔn)確吸取1 mL菌懸液樣品,用0.9%滅菌生理鹽水梯度稀釋(10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8),然后吸取適當(dāng)稀釋梯度的稀釋液1 mL,置于無菌培養(yǎng)皿中,并傾注溫度在40～45 ℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基13～15 mL,搖動(dòng)平板,靜置固化,后將固化的平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)(48±2) h,觀察菌體的生長(zhǎng)情況,并計(jì)數(shù)。

菌體數(shù)量計(jì)算:活菌數(shù)(cfu/mL)=涂布平板菌落數(shù)平均值×稀釋倍數(shù)

式(1)

1.2.5 植物乳桿菌微膠囊化的制備工藝 將海藻酸鈉(2%)溶液與阿拉伯木聚糖(3%)溶液分別滅菌,冷卻至室溫,將二者等體積混合[14]。然后將1.2.3制備的濃縮菌懸液5 mL加入到海藻酸鈉-阿拉伯木聚糖的混合溶液中,并加入漆酶[15](1.67 nkat/mg阿拉伯木聚糖),混合均勻后,通過數(shù)字齒輪驅(qū)動(dòng)泵(12～15 r/min)將上述混合溶液流入到0.1 mol/L無菌CaCl2溶液中,靜置30 min,使得海藻酸鈉與Ca2+之間的交聯(lián)反應(yīng)充分進(jìn)行[16],最終形成海藻酸鈣-阿拉伯木聚糖凝膠球體。然后,無菌水洗滌微膠囊表面殘余溶液,滅菌紗布過濾收集微膠囊,靜置30 min,以排除多余的水分,將制備的微膠囊真空冷凍干燥,得到微膠囊粉末顆粒[9]。

1.3 植物乳桿菌微膠囊包載效果表征

1.3.1 微膠囊包埋產(chǎn)率、包埋效率及有效載量計(jì)算方法

微膠囊包埋產(chǎn)率(%)=(微膠囊中活菌個(gè)數(shù)/最初加入活菌個(gè)數(shù))×100

式(2)

微膠囊包埋效率(%)=(1-微膠囊表面活菌個(gè)數(shù)/微膠囊中活菌個(gè)數(shù))×100

式(3)

微膠囊有效載量(%)=(微膠囊中活菌數(shù)目/微膠囊質(zhì)量)×100

式(4)

1.3.2 微膠囊中活菌數(shù)目的計(jì)算 取0.1 g微膠囊至20 mL的無菌PBS緩沖液(pH7.4)中,攪拌1 h后,用均質(zhì)機(jī)分散20 s,使微膠囊包載的菌體能夠完全釋放后梯度稀釋,采用傾注平板法進(jìn)行活菌精確計(jì)數(shù)[17]。

1.3.3 微膠囊表層活菌個(gè)數(shù)的測(cè)定 取0.1 g微膠囊至20 mL 0.9%無菌生理鹽水中,攪拌1 h后,使微膠囊表層以及可以泄露的菌體從表面溶出,過濾并收集濾液后梯度稀釋,并采用傾注平板法進(jìn)行活菌精確計(jì)數(shù)。

1.4 植物乳桿菌微膠囊物化性質(zhì)的表征

1.4.1 植物乳桿菌微膠囊粒徑分布的測(cè)定 取一定數(shù)量的微膠囊粉末顆粒,使用激光粒度分析儀對(duì)樣品的粒徑分布進(jìn)行測(cè)量,將微膠囊粉末顆粒置于樣品槽中,經(jīng)過對(duì)粉末顆粒群衍射,計(jì)算機(jī)處理得到粉末顆粒相應(yīng)粒徑分布結(jié)果。

1.4.2 植物乳桿菌微膠囊含水量的測(cè)定 稱取1 g植物乳桿菌微膠囊,放入水分含量測(cè)定儀中,啟動(dòng)儀器,測(cè)定時(shí)間為5 min,平行三次測(cè)定。

1.4.3 植物乳桿菌微膠囊密度的測(cè)定 稱取一定質(zhì)量的植物乳桿菌微膠囊粉末顆粒,放置于10 mL的量筒中,反復(fù)多次晃動(dòng),靜置后測(cè)量粉末顆粒的體積,根據(jù)計(jì)算公式,單位體積微膠囊顆粒的質(zhì)量為微膠囊的密度[18]。計(jì)算公式如下:

P=W/B

式(5)

式中：P表示堆密度(g/cm3)；W表示樣品質(zhì)量(g)；V表示樣品體積(mL)。

1.4.4 植物乳桿菌微膠囊流動(dòng)性的測(cè)定 通過休止角法測(cè)定植物乳桿菌微膠囊粉末顆粒的流動(dòng)性,具體方法如下:固定干燥的玻璃漏斗于鐵架臺(tái)上,其正下方水平處放置一表面皿,后向漏斗中加入微膠囊粉末顆粒,經(jīng)漏斗流出,在表面皿上形成自然錐體,再按計(jì)算公式計(jì)算休止角[3],計(jì)算公式如下:

A=arctan(2H/D)

式(6)

式中：A表示微膠囊休止角(°)；H表示錐體高度(cm)；D表示錐體直徑(cm)。

1.4.5 植物乳桿菌微膠囊形態(tài)觀察 使用掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy,SEM)觀察微膠囊的表面結(jié)構(gòu)。樣品制備方法如下:在樣品臺(tái)上附一雙面膠,將植物乳桿菌微膠囊粉末顆粒放于上面,并去除過多粉末,后樣品上噴金供SEM觀察,加速電壓為10 kV。

1.4.6 植物乳桿菌微膠囊及其壁材的紅外譜圖分析 取10 mg樣品顆粒,1 g溴化鉀,即為1∶100的比例,然后將二者放入研缽中進(jìn)行充分研磨,取少量研磨好的粉末,用壓片機(jī)壓制(1 min)成透明的圓片狀,在400～4000波數(shù)內(nèi)進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描[19]。

1.5 植物乳桿菌微膠囊胃腸道模擬實(shí)驗(yàn)

1.5.1 植物乳桿菌微膠囊胃液溶解性的測(cè)定 稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,將其置于盛有40 mL,pH1.5模擬胃液的錐形瓶中,(37±1) ℃、130 r/min恒溫水浴振蕩器分別處理0、1、2、3 h后,使用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為600 nm處測(cè)定其透光率,根據(jù)透光率差異分析模擬胃液中微囊的裂解情況[20]。

1.5.2 植物乳桿菌微膠囊腸液溶解性的測(cè)定 稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,將其置于盛有40 mL,pH7.4模擬腸液的錐形瓶中,(37±1) ℃、130 r/min恒溫水浴振蕩器分別處理0、0.5、1.0、1.5、2.0 h后,使用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為600 nm處測(cè)定其透光率,根據(jù)透光率差異分析模擬腸液中微囊的裂解情況。

1.5.3 植物乳桿菌微膠囊的耐酸性 實(shí)驗(yàn)組:稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,分別放入7個(gè)無菌離心管中,依次在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時(shí),加入pH為1.5的人工胃液4.9 mL,然后將離心管放置于37 ℃的恒溫水浴振蕩器中振蕩,并在3 h時(shí),將離心管一同取出,4000 r/min低速離心5 min收集微膠囊,然后將4.9 mL pH7.4的無菌PBS緩沖液加入離心管中,并在37 ℃下振蕩30 min,均質(zhì)機(jī)分散20 s,完全破碎微膠囊使菌體釋放,然后用0.9%無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,選取適宜的稀釋度,使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)[21]。

對(duì)照組:吸取1.2.3離心收集的濃縮菌懸液1 mL,加入pH1.5的模擬胃液9 mL,置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩培養(yǎng),依次在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時(shí)取樣,然后用0.9%滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,選取合適的稀釋度,使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)菌體數(shù)目。

1.5.4 植物乳桿菌微膠囊的釋放實(shí)驗(yàn) 稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,置于無菌離心管中,加入30 mL pH7.4的模擬腸液,置于37 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩培養(yǎng),依次在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h時(shí)取樣,用0.9%滅菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋,選取適宜的稀釋度,使用傾注平板法進(jìn)行精確計(jì)數(shù)。

1.5.5 植物乳桿菌微膠囊連續(xù)胃腸道模擬實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)組:稱取0.1 g植物乳桿菌微膠囊,分別放入滅菌的離心管中,向管中加入pH為1.5的人工胃液4.9 mL,將離心管置于37 ℃的恒溫水浴振蕩器中,130 r/min振蕩培養(yǎng),2 h后將上述離心管取出,吸取混合液0.1 mL,用0.9%無菌生理鹽水梯度稀釋,傾注平板法精確計(jì)數(shù)。將上述離心管4000 r/min低速離心5 min,收集沉淀物,并加入30 mL的pH7.4模擬腸液,37 ℃,130 r/min振蕩器中振蕩培養(yǎng),2 h時(shí)取出離心管,吸取混合液,用0.9%無菌生理鹽水梯度稀釋,使用傾注平板法精確計(jì)數(shù)。

對(duì)照組:取1.2.3制備的濃縮菌懸液0.1 mL,在相同處理?xiàng)l件下作對(duì)照試驗(yàn),平行進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)。

1.5.6 植物乳桿菌微膠囊的儲(chǔ)藏性實(shí)驗(yàn) 將植物乳桿菌微膠囊分別放置于28、4以及-20 ℃的恒溫條件下儲(chǔ)藏7周。每周均使用模擬腸液將上述三種條件下的微膠囊溶解并進(jìn)行梯度稀釋,運(yùn)用傾注平板法測(cè)定三種溫度條件下,植物乳桿菌微膠囊中菌體的存活數(shù)量,用以評(píng)價(jià)其儲(chǔ)藏特性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用X(三組數(shù)據(jù)平均值)±S.D.(標(biāo)準(zhǔn)偏差)表示,采用SPSS 17.0(美國SPSS公司)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行一元方差分析(One-way ANOVA),采用Duncan法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),在顯著性水平α=0.05下進(jìn)行分析。文中圖表中a、b、c等不同字母表示α=0.05水平下各實(shí)驗(yàn)點(diǎn)具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌N1的生長(zhǎng)曲線

植物乳桿菌生長(zhǎng)曲線如圖1所示,植物乳桿菌在6 h時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)期,16 h正式開始進(jìn)入穩(wěn)定期,進(jìn)入穩(wěn)定期的菌體細(xì)胞數(shù)量充足且活性較高,適宜收集用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 植物乳桿菌在MRS中的生長(zhǎng)曲線(37℃)Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum in MRS(37 ℃)

2.2 植物乳桿菌微膠囊的包載效果

根據(jù)1.3方法及計(jì)算公式可得,微膠囊包埋產(chǎn)率為73.60%±0.01%,微膠囊包埋效率為81.27%±0.17%,微膠囊有效載量為(3.68±0.4)×1011cfu/g,產(chǎn)品呈淡黃色。

2.3 植物乳桿菌微膠囊物化性質(zhì)

2.3.1 植物乳桿菌微膠囊的粒徑分布 使用激光粒度分析儀對(duì)未包載植物乳桿菌的微膠囊以及包載植物乳桿菌的微膠囊進(jìn)行粒度分析,結(jié)果如圖2所示。

圖2 空白及載菌微膠囊粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution images of microcapsules without and with Lactobacillus plantarum

空白微膠囊粒徑分布為:800～600 μm占1.92%;599～500 μm占9.5%;499～400 μm占77.09%;399～300 μm占10.8%;299～200 μm占0.69%。載菌微膠囊粒徑分布為:800～600 μm占0.76%;599～500 μm占5.99%;499～400 μm占66.54%;399～300 μm占23.20%;299～200 μm占3.51%。同空白微膠囊相比,載菌微膠囊的粒徑普遍有所增大,推測(cè)是由于壁殼材料添加菌體細(xì)胞,使得微膠囊粒徑有所增加。

2.3.2 植物乳桿菌微膠囊的水分含量、密度以及流動(dòng)性 如表1，植物乳桿菌微膠囊的水分含量為8.82%±0.01%,對(duì)于干燥的微生物制品來說,水分含量的多少是維持菌體數(shù)量以及活性的重要因素。Oliveira等[22]采用復(fù)凝聚法以酪蛋白和果膠為壁材材料用以包埋B.lactis和L.acidophilus,運(yùn)用噴霧干燥的方法制備微膠囊,其水分含量分別為10.98%和9.58%。本實(shí)驗(yàn)所制備的植物乳桿菌微膠囊水分含量較現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的數(shù)據(jù)低,這樣將更有利于植物乳桿菌微膠囊的貯藏。在微膠囊的理化性質(zhì)表征中,微膠囊密度對(duì)于微膠囊粉末的均勻分布具有重要影響,因此用堆密度法表征微膠囊粉末顆粒的密度,植物乳桿菌微膠囊密度為(0.25±0.01) g/cm3。植物乳桿菌微膠囊的休止角為(35.25±4.35) °,表明微膠囊的粘度小,流動(dòng)性好,研究表明,休止角在30～45°范圍內(nèi)的微膠囊粉末具有較好的流動(dòng)性。

表1 植物乳桿菌微膠囊的水分含量、密度以及流動(dòng)性Table 1 The moisture content,density and fluidity of Lactobacillus plantarum microcapsules

2.3.3 植物乳桿菌微膠囊的顯微形態(tài) 由于制作微膠囊的芯材,壁材以及制備方法的不同,因而微膠囊的粒徑分布范圍為幾微米到幾千微米之間[23],且各種方法制備出的微膠囊在外觀形態(tài),內(nèi)部結(jié)構(gòu)上均有較大差異。

從圖3和圖4中可以看出,空白微膠囊與載菌微膠囊結(jié)構(gòu)緊密,表面沒有裂縫以及過多的褶皺,囊壁結(jié)構(gòu)保持完整,二者由于真空冷凍干燥而脫水,整體出現(xiàn)干癟狀態(tài),當(dāng)微膠囊吸水,仍可復(fù)原球形形狀,并且與空白微膠囊相比,載菌微膠囊表面布滿植物乳桿菌菌體,證明菌體數(shù)量充足,此微膠囊起到較好的載體作用。

圖3 空白微膠囊SEM圖像Fig.3 SEM images of microcapsules without Lactobacillus plantarum注：a:×500;b:×1000;圖4同。

圖4 載菌微膠囊SEM圖像Fig.4 SEM images of microcapsules with Lactobacillus plantarum

2.3.4 植物乳桿菌微膠囊及壁材的紅外譜圖 圖5是海藻酸鈣、阿拉伯木聚糖凝膠、海藻酸鈣-阿拉伯木聚糖凝膠(三者均不含菌)的紅外光譜(FT-IR)圖像,從圖5中可以看出,相比于譜圖a和b,譜圖c并未在官能團(tuán)區(qū)增加明顯的吸收帶,表明在海藻酸鈣-阿拉伯木聚糖凝膠之間并未形成新的化學(xué)鍵,因此沒有產(chǎn)生新的吸收帶,可以推測(cè)阿拉伯木聚糖凝膠與海藻酸鈣間是物理性纏繞。

圖5 壁材的FT-IR光譜Fig.5 FT-IR spectrums of wall materials注:a:海藻酸鈣;b:阿拉伯木聚糖凝膠;c:海藻酸鈣-阿拉伯木聚糖凝膠。

2.4 植物乳桿菌微膠囊的胃腸道模擬實(shí)驗(yàn)

2.4.1 植物乳桿菌微膠囊的胃液溶解性 植物乳桿菌經(jīng)口進(jìn)入人體后,首先需要抵御胃液的酸性環(huán)境,由于進(jìn)食量、進(jìn)食時(shí)間,食物組成以及進(jìn)食者個(gè)體之間具有差異,使得人體胃液pH在1.5～5.0范圍內(nèi)波動(dòng)。從圖6可以看出,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),雖然2～3 h的透光率與溶液初始透光率具有顯著性差異(p<0.05),但微膠囊在模擬胃液中處理3 h,僅有少量渾濁出現(xiàn),透光率從100%下降至96%,透光率的降低可能是由于微膠囊部分包埋不完全以及微膠囊表層部分植物乳桿菌泄露引起。絕大部分微膠囊保持正常形態(tài)而不崩解破碎,證明該微膠囊能夠給與其包埋的植物乳桿菌較好的保護(hù)環(huán)境,使其免受外部酸性環(huán)境的侵蝕,因此其中包載的植物乳桿菌有較高的存活率,絕大多數(shù)植物乳桿菌能夠通過胃液的酸性環(huán)境,順利進(jìn)入腸道環(huán)境。

圖6 微膠囊胃液溶解性實(shí)驗(yàn)Fig.6 Microcapsule gastric fluid solubility test

2.4.2 植物乳桿菌微膠囊的腸液溶解性 腸溶性是指物質(zhì)在胃液的酸性環(huán)境中2 h不溶解,在腸液中1 h內(nèi)溶解,較為理想的腸溶性產(chǎn)品在十二指腸就會(huì)開始出現(xiàn)裂解的情況。本次實(shí)驗(yàn)選擇pH為7.4的模擬腸液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。從圖7可以看出,隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng),0.5～2.0 h的透光率與溶液最初的(0 h)透光率具有顯著性差異(p<0.05),透光率從52.7%下降至2.66%,并且透光率在1 h后基本保持不變。將微膠囊在腸液中處理2 h后,腸液中基本無固體顆粒存在,微膠囊裂解完全,其中微膠囊表層以及內(nèi)部包埋的植物乳桿菌得到充分釋放,微膠囊在腸液中有足夠的時(shí)間充分釋放其中包載的植物乳桿菌,具有較好的腸溶性。

圖7 微膠囊的腸液溶解性實(shí)驗(yàn)Fig.7 Microcapsule intestinal fluid solubility test

2.4.3 微膠囊的耐酸性 按1.5.3進(jìn)行植物乳桿菌微膠囊的耐酸性評(píng)價(jià),結(jié)果如圖8所示,菌懸液的植物乳桿菌數(shù)量在pH1.5的胃液環(huán)境下3 h下降了6.4lg(cfu/mL)。而微膠囊包埋的植物乳桿菌數(shù)量在pH1.5的胃液環(huán)境下3 h僅僅下降了1.2lg(cfu/mL),3 h時(shí)植物乳桿菌數(shù)量仍有2.06×108cfu/mL,上述結(jié)果表明,與植物乳桿菌菌懸液相比,植物乳桿菌微膠囊能夠不受胃液的影響,有助于其包載的植物乳桿菌順利進(jìn)入腸道。

圖8 植物乳桿菌微膠囊在模擬胃液(pH1.5)中的存活情況Fig.8 Survival of Lactobacillus plantarum microcapsules in simulated gastric fluid(pH1.5)

2.4.4 微膠囊的釋放實(shí)驗(yàn) 植物乳桿菌作為一種益生菌只有順利進(jìn)入腸道,且擁有足夠的數(shù)量,才能夠影響腸道菌群,發(fā)揮其益生作用,因而需要考慮植物乳桿菌微膠囊在模擬腸液中的釋放情況。按1.5.4的方法評(píng)價(jià)植物乳桿菌微膠囊的釋放特性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9所示。阿拉伯木聚糖與海藻酸鈉為壁材的植物乳桿菌微膠囊在模擬腸液中消化時(shí),1 h左右基本能夠?qū)崿F(xiàn)完全釋放其包載的植物乳桿菌,并且在之后的1～3 h,釋放的植物乳桿菌數(shù)量變化幅度較小,說明植物乳桿菌微膠囊可以實(shí)現(xiàn)在腸道中的充分釋放。

圖9 植物乳桿菌微膠囊在模擬腸液中(pH7.4)的釋放Fig.9 Release of Lactobacillus plantarum microcapsules in simulated intestinal fluid(pH7.4)

2.4.5 植物乳桿菌微膠囊連續(xù)胃腸道耐受實(shí)驗(yàn) 由圖10可知,在連續(xù)胃腸道模擬實(shí)驗(yàn)中,植物乳桿菌菌懸液經(jīng)過人體消化液的處理后,菌體濃度下降5.6lg(cfu/mL),與原始菌體數(shù)目相比具有顯著性差異(p<0.05),其中胃液的酸性環(huán)境對(duì)菌體細(xì)胞破壞性最大。在相同的處理?xiàng)l件下,微膠囊化的植物乳桿菌在整個(gè)胃腸道模擬實(shí)驗(yàn)中,菌體濃度僅下降0.5lg(cfu/mL),在經(jīng)過胃液時(shí)菌體濃度略微下降,主要是存在于微膠囊表層以及不完全包埋的植物乳桿菌泄露導(dǎo)致菌體數(shù)量有所下降。由此可見,采用微膠囊包載植物乳桿菌,可顯著提升菌體的存活數(shù)量,使其絕大部分能順利到達(dá)腸道,從而能夠發(fā)揮益生功效,促進(jìn)腸道健康。

圖10 菌懸液以及植物乳桿菌微膠囊對(duì)模擬胃腸道的耐受性Fig.10 Tolerance of bacterial suspension and Lactobacillus plantarum microcapsules to the simulated gastrointestinal tract

2.4.6 植物乳桿菌微膠囊的儲(chǔ)藏性實(shí)驗(yàn) 為了評(píng)價(jià)植物乳桿菌微膠囊的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性即貨架穩(wěn)定性,我們選取4、28以及-20 ℃的儲(chǔ)存條件連續(xù)存放7周,用以研究微膠囊化植物乳桿菌的存活情況,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示。隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng),微膠囊中菌體存活數(shù)量在不斷下降,其中在28 ℃的條件下,微膠囊中的活菌數(shù)在7周內(nèi),下降了5.2lg(cfu/mL),而在4以及-20 ℃條件下,相同時(shí)間內(nèi)活菌數(shù)分別下降了1.7lg和1.2lg(cfu/mL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明微膠囊包埋的植物乳桿菌具有較長(zhǎng)的儲(chǔ)藏時(shí)間且呈現(xiàn)出儲(chǔ)藏效果:-20 ℃>4 ℃>28 ℃的趨勢(shì),由此也證明植物乳桿菌需要在較低的儲(chǔ)藏溫度下進(jìn)行保藏,以保證其有足夠的活菌數(shù)量和活力。

圖11 植物乳桿菌微膠囊在4、28和-20℃的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Fig.11 Storage stability of Lactobacillus plantarum microcapsules at 4,28 and -20 ℃

3 結(jié)論

本研究表明,以海藻酸鈉和阿拉伯木聚糖為壁材復(fù)合包載植物乳桿菌制備微膠囊,該微膠囊具有較低的胃液溶解性和較高的腸液溶解性,能夠保護(hù)其包載的菌體免受胃液侵蝕,順利到達(dá)腸道,并且能夠在腸液中充分釋放。阿拉伯木聚糖具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性,從而避免單獨(dú)使用海藻酸鈉包埋造成的微膠囊易降解破壞引起的突釋問題。SEM圖像表明,空白及載菌微膠囊結(jié)構(gòu)緊密,表面沒有裂縫,囊壁結(jié)構(gòu)保持完整,復(fù)合包載改善了單一包載存在的微膠囊表面孔徑過大的問題。儲(chǔ)藏性實(shí)驗(yàn)表明,-20 ℃為最佳的儲(chǔ)存條件。本研究對(duì)于采用復(fù)合材料包載益生菌制備微膠囊,從而增強(qiáng)益生菌的存活率和耐受性,具有一定的參考價(jià)值和實(shí)踐意義。