米根霉對(duì)脫脂米糠酚類物質(zhì)釋放的影響

張慧娟,曹欣然,柳天戈,王 靜

(北京工商大學(xué),北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,中國(guó)-加拿大食品營(yíng)養(yǎng)與健康聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室(北京),北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)

米糠是稻谷加工后產(chǎn)生的一種副產(chǎn)品,是大米的皮層(外果皮、中果皮、種皮及糊粉層)、胚芽、碎米和淀粉的混合物,占谷粒重量的5%～8%[1]。米糠的營(yíng)養(yǎng)成分隨品種、精碾條件等因素的不同而有較大差異,與精白米相比,它含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、膳食纖維和礦物質(zhì),還含有不飽和脂肪酸、生育酚、生育三烯酚、谷維素、植酸等多種天然生物活性物質(zhì),這些活性成分具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、降膽固醇、殺菌、增強(qiáng)免疫力等功能,對(duì)人體的健康起著非常重要的作用[2],聯(lián)合國(guó)工業(yè)發(fā)展組織稱米糠為一種未充分利用的原料。

全世界米糠年產(chǎn)量約為7億噸,我國(guó)米糠年產(chǎn)量超過1400萬噸[3],居世界之首,是一種量大面廣的可再生資源。而美國(guó)和日本是對(duì)米糠資源開發(fā)最早,技術(shù)最發(fā)達(dá)的國(guó)家。目前美國(guó)利普曼公司已經(jīng)開發(fā)出米糠穩(wěn)定化技術(shù)及相關(guān)產(chǎn)品,其公司生產(chǎn)的米糠營(yíng)養(yǎng)素價(jià)格是原料米糠的20倍。由于國(guó)內(nèi)稻谷加工企業(yè)比較分散,新鮮米糠穩(wěn)定性差,易變質(zhì),米糠中粗纖維、油脂含量高,口感粗糙,適口性差,因此我國(guó)對(duì)米糠的利用程度較低,90%左右的米糠得不到充分利用[4]。

為提高米糠的營(yíng)養(yǎng)特性,拓寬米糠的功能特性,豐富米糠的風(fēng)味,可以通過發(fā)酵的方法對(duì)米糠進(jìn)行改性。據(jù)報(bào)道,利用米根酶[5]固態(tài)發(fā)酵米糠,在發(fā)酵過程中酚類化合物含量增加,發(fā)酵后的米糠酚類提取物對(duì)過氧化物酶和自由基的氧化性有抑制的作用。Kupski等[6]研究發(fā)現(xiàn),利用米根霉固態(tài)發(fā)酵米糠,可以提高米糠的抗氧化性,增加米糠蛋白質(zhì)含量。與固態(tài)發(fā)酵相比,半固態(tài)發(fā)酵的不溶性固體基質(zhì)中含有可被利用的碳水化合物,氮源和礦物質(zhì),并且具較高水分活度[7],可以避免固態(tài)發(fā)酵所帶來的微生物種類選擇少,發(fā)酵效率較低,周期長(zhǎng)等缺點(diǎn);與液態(tài)發(fā)酵相比,半固態(tài)發(fā)酵含水量較低,可以縮短樣品干燥時(shí)間,節(jié)約能源。

本文以米根霉作為半固態(tài)發(fā)酵的菌種,在0～48 h,30 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵,對(duì)米糠的營(yíng)養(yǎng)特性以及理化性質(zhì)進(jìn)行探究,比較不同發(fā)酵時(shí)間下米糠的多酚及黃酮含量變化,持水性、持油性的變化,為米糠的合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米糠 新鄉(xiāng)原陽(yáng)大米有限公司;米酒發(fā)酵劑(米根霉) 安琪酵母股份有限公司;沒食子酸 美國(guó)Sigma公司;橄欖醇 北京華威銳科化工有限公司;蘆丁 上海源葉生物科技有限公司;正己烷、乙酸乙酯、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉、固藍(lán)、三氯化鋁、亞硝酸鈉、丙酮、無水乙醇,甲醇 分析純,國(guó)藥集團(tuán);福林酚 北京半夏生物科技有限公司;DPPH、Trolox 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

FW-100高速萬能粉碎機(jī) 北京中興偉業(yè)儀器有限公司;SX-700全自動(dòng)高壓滅菌鍋 北京昭天偉業(yè)科技有限公司;SPX-250B-Z普通生化培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)廠;Free Zone R真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)LABCONCO公司;JA5003電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;CR22N高速離心機(jī) 日立;SHZ-82A恒溫振蕩器 常州國(guó)華電器有限公司;Synergy H1MDG多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 BUCHI;C-MAG HS-7磁力攪拌機(jī) IKA集團(tuán)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料預(yù)處理 將新鮮的米糠用粉碎機(jī)磨細(xì),過60目篩,得到粒徑不超過0.3 mm的米糠粉粒。以v∶w=3∶1(體積與質(zhì)量比)的比例加入正己烷,在25 ℃脫脂30 min[8],25 ℃室溫風(fēng)干后得到脫脂米糠,裝于密封袋,-20 ℃貯藏備用。

1.2.2 米糠發(fā)酵 取100 g脫脂米糠,加入1∶1 (w∶v)的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆?121 ℃滅菌20 min;冷卻到30 ℃后加入0.4 g米根霉,并加入50 mL無菌水再次攪拌均勻。置于溫度30 ℃,濕度50%的恒溫恒濕發(fā)酵箱中培養(yǎng)48 h。共設(shè)置6組,以未滅菌的脫脂米糠作為對(duì)照,每隔12 h取出一組,100 ℃滅菌10 min,在-80 ℃冷凍干燥24 h后,用高速萬能粉碎機(jī)粉碎60 s,置于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。每組做三個(gè)平行。

1.2.3 游離酚酸的提取 按照Min等[9]的方法加以修改。取0.5 g發(fā)酵后米糠用10 mL丙酮∶水∶醋酸溶液(70∶29.5∶0.5,v∶v∶v)室溫下磁力攪拌2 h,5000 r/min離心10 min,復(fù)提1次。收集上清液,50 ℃旋蒸,殘留物用甲醇重新定容到10 mL。在-20 ℃儲(chǔ)存待用。

1.2.4 結(jié)合酚酸的提取 按照Min等[9]的方法加以修改。提取完游離多酚后,殘?jiān)? mol/L的NaOH(1∶20,w∶v)室溫下磁力攪拌,消化2 h,之后用6 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至1。用50 mL乙酸乙酯提取5次,5000 r/min離心10 min后收集上清液,50 ℃旋蒸至提取液干燥,殘留物用甲醇重新定容到10 mL。在-20 ℃儲(chǔ)存待用。

1.2.5 多酚含量的測(cè)定 按照Z(yǔ)hao等[10]的方法加以修改。分別取100 μL結(jié)合酚酸和游離酚酸提取液,各加入100 μL蒸餾水至離心管中,加入1 mL福林酚試劑和0.8 mL 7.5%碳酸鈉溶液混合均勻。混合物在避光條件下孵育1 h,測(cè)量765 nm處的吸光度。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1.6853x-0.0023R2=0.9968。),樣品中的多酚含量表示為沒食子酸當(dāng)量(GAE),單位為mg GAE/100 g DW(dry weight of fraction)。總酚含量為游離多酚含量和結(jié)合多酚含量之和。所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.6 黃酮含量的測(cè)定 按照Ti等[11]的方法加以修改。分別取100 μL結(jié)合酚酸和游離酚酸提取液與1.5 mL的蒸餾水混合,加入90 μL 5%亞硝酸鈉溶液反應(yīng)6 min。然后加入180 μL的10%三氯化鋁溶液,震蕩均勻后孵育5 min。再加入0.6 mL 1 mol/L的NaOH溶液和330 μL的蒸餾水,震蕩均勻后在510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.6053x+0.0536R2=0.9978),樣品中的黃酮含量表示為蘆丁當(dāng)量,單位為mg rutin/100 g DW?？傸S酮含量為游離黃酮含量和結(jié)合黃酮含量之和。所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.7 烷基間苯二酚(ARs)含量的測(cè)定 按照Rebolleda等[12]的方法加以修改。1 g脫脂米糠與10 mL乙酸乙酯混合,在室溫下用磁力攪拌器攪拌2 h。5000 r/min離心10 min,50 ℃旋蒸干溶劑。用1 mL的甲醇導(dǎo)出殘留物。取10 μL的萃取液,加入90 μL的無水甲醇,10 μL 5%碳酸鉀溶液,100 μL的固藍(lán)(0.05%的固藍(lán)),避光加蓋振板10 min,在25 ℃,480 nm下測(cè)定吸光度。以橄欖醇濃度為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)橄欖醇標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.0038x+0.1007R2=0.9934),樣品中的ARs含量表示為橄欖醇當(dāng)量,單位為mg olivetol/100 g DW。所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.8 DPPH自由基清除能力測(cè)定 按照Cheng等[13]的方法加以修改。將結(jié)合酚酸和游離酚酸提取液稀釋100倍,用甲醇配制0.2 mmol/L的DPPH和Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗(yàn)在白色96-微孔板上進(jìn)行。具體操作如下:樣品組取100 μL的DPPH溶液與100 μL的樣品溶液混合均勻,對(duì)照組取100 μL的DPPH溶液與100 μL的甲醇混合均勻,空白組取200 μL甲醇,在黑暗下孵育30 min,在517 nm處測(cè)量吸光值。以trolox濃度為橫坐標(biāo),以吸光值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.8029x+10.113,R2=0.9999),樣品中的DPPH自由基清除能力表示為trolox當(dāng)量,單位為mg TE/100 g DW。DPPH自由基清除率之和(總抗氧化性)為游離酚酸抗氧化性和結(jié)合酚酸抗氧化性之和。所有樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.9 功能性質(zhì)測(cè)定

1.2.9.1 持水性測(cè)定 參照Raghavendra等[14]的方法稍作修改測(cè)定持水力(water holding capacity,WHC)。稱量離心管重量,稱取約1 g樣品,加入30 mL水,60 ℃水浴磁力攪拌1 h后立即冷水浴,使溫度降至常溫。室溫下,離心轉(zhuǎn)速5000 r/min,離心30 min后立刻棄掉上清液,稱重離心管。

式中:WHC:試樣持水力大小,g/g;M0:離心管初始質(zhì)量,g;M1:樣品質(zhì)量,g;M2:離心沉淀與離心管總質(zhì)量,g。

1.2.9.2 持油性測(cè)定 參照Raghavendra等[14]的方法稍作修改測(cè)定持油力(oil holding capacity,OHC)。稱重離心管重量,記錄,稱取約1 g樣品,加入20 mL大豆油,在37 ℃水浴1 h。離心轉(zhuǎn)速5000 r/min,離心30 min后立刻棄掉上清液,稱重離心管。

式中OHC:試樣持油力大小,g/g;W0:離心管初始質(zhì)量,g;W1:樣品質(zhì)量,g;W2:離心沉淀與離心管總質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel 2010和SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析,采用單因素方差分析法檢驗(yàn),顯著性水平為p<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂米糠游離多酚、結(jié)合多酚、總酚含量測(cè)定結(jié)果

由圖1可以看出,游離多酚和總酚含量隨發(fā)酵時(shí)間增加呈現(xiàn)提高的趨勢(shì),結(jié)合多酚的含量變化并不規(guī)律,當(dāng)米糠發(fā)酵12 h時(shí),結(jié)合多酚的含量降低,在0～12 h內(nèi),米根霉處于生長(zhǎng)階段,會(huì)消耗米糠中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行自身的繁殖。結(jié)合多酚含量在12～24 h呈現(xiàn)輕微上升的趨勢(shì),在24～48 h呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。通過米根霉發(fā)酵,脫脂米糠中的結(jié)合多酚含量由未處理組的286.13 mg/100 g提高到發(fā)酵48 h組的412.43 mg/100 g,提高44.1%。通過發(fā)酵產(chǎn)生的酶可以作用于木質(zhì)素,將結(jié)合態(tài)多酚釋放為游離狀態(tài),發(fā)酵48 h的米糠游離多酚由未處理時(shí)的316.56 mg/100 g增加到478.35 mg/100 g,增加了51.11%。在發(fā)酵過程中,由于脫脂米糠的游離態(tài)多酚含量提高,總酚含量緩慢上升,在36 h處游離多酚和結(jié)合多酚含量總和達(dá)到最大,總酚含量增加到917.83 mg/100 g,與未處理組相比,總酚含量增加了47.3%。Ribeiro等[14]與本文有相似的研究,未脫脂米糠和脫脂米糠兩種原料在米根霉CCT 7560作為發(fā)酵劑的固態(tài)發(fā)酵條件下,總酚含量呈現(xiàn)相同的上升趨勢(shì)。Kupski等[6]在使用米根霉CCT 7560固態(tài)發(fā)酵米糠時(shí),在0～36 h總酚含量逐漸上升,36～48 h總酚含量略有下降,與本研究結(jié)果相似。因此,米根霉發(fā)酵處理脫脂米糠與未處理的脫脂米糠相比,可以提高米糠的游離、結(jié)合、總多酚含量,且在發(fā)酵36 h后總酚含量達(dá)到最大值。

圖1 米糠游離多酚、結(jié)合多酚、總酚含量Fig.1 Free,bound and total phenolic composition of rice bran注:同一指標(biāo)小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖4同。

2.2 米糠游離黃酮、結(jié)合黃酮,總黃酮含量

圖2為不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)米糠中的游離黃酮,結(jié)合黃酮及總黃酮含量的影響。通過發(fā)酵,結(jié)合態(tài)黃酮含量隨發(fā)酵時(shí)間增長(zhǎng)呈現(xiàn)降低的趨勢(shì),游離態(tài)的黃酮和總黃酮含量隨發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。脫脂米糠經(jīng)過米根霉發(fā)酵48 h后,游離黃酮由未處理組的442.43 mg/100 g,提高到673.89 mg/100 g,比未處理組提高了45.7%;結(jié)合黃酮由未處理組的229.12 mg/100 g提高到356.28 mg/100 g,發(fā)酵48 h組結(jié)合黃酮含量提高了55.5%;發(fā)酵48 h組總黃酮含量由未處理組的691.56 mg/100 g升高到1030.17 mg/100 g,總黃酮含量增加了48.96%。據(jù)Liu等[15]的報(bào)道,利用乳酸菌發(fā)酵可以使游離和結(jié)合黃酮含量均增加。除此之外,據(jù)王小平等[16]的研究,用米根霉進(jìn)行生物改性后的麩皮添加到面包中,比普通白面面包多酚和黃酮含量高出1.76、1.61倍。因此可以看出,微生物不僅可以提高麩皮中的黃酮含量,對(duì)于米糠同樣可以起到提高黃酮含量的作用,米根霉發(fā)酵處理可以有效釋放脫脂米糠中的酚酸,顯著提高米糠中的黃酮含量(p<0.05),提高米糠的利用價(jià)值。

圖2 米糠游離黃酮、結(jié)合黃酮、總黃酮含量Fig.2 Free,bound and total flavonoid of rice bran

2.3 米糠發(fā)酵過程中ARs的含量

近年來,ARs被作為全谷物食品的生物標(biāo)記物[17]。ARs作為全谷物中的營(yíng)養(yǎng)因子,具有抗菌[18]、降低膽固醇吸收[19]、減輕全麥制品的苦味,保留風(fēng)味[20]等作用。Katina等[21]研究發(fā)現(xiàn),在發(fā)酵黑麥麩時(shí),ARs的含量有一定程度的升高。經(jīng)過高壓滅菌的米糠在其發(fā)酵過程中,ARs含量隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),由圖3可以看出,從0 h開始ARs的含量逐漸增加,與圖1所示的總酚含量的趨勢(shì)相似;在發(fā)酵0 h的樣品中,ARs的含量是14.31 mg/100 g,發(fā)酵48 h的含量增長(zhǎng)到17.58 mg/100 g,含量顯著提高(p<0.05)。

圖3 脫脂米糠ARs含量Fig.3 ARs contents of defatted rice bran

2.4 DPPH自由基清除能力分析

近年來,全谷物食品中的酚類活性物質(zhì)及其抗氧化性受到廣泛研究。由表1可知,不同發(fā)酵時(shí)間的米糠酚酸提取物抗氧化性與多酚含量變化趨勢(shì)相似。脫脂米糠發(fā)酵36 h時(shí),游離態(tài)酚酸提取物的自由基清除能力最強(qiáng),達(dá)到3.04 mg TE/100 g DW,與游離態(tài)多酚含量在發(fā)酵36 h達(dá)到最大相一致。脫脂米糠發(fā)酵48 h時(shí),米糠結(jié)合態(tài)酚酸提取物的自由基清除能力最強(qiáng),達(dá)到21.69 mg TE/100 g DW。發(fā)酵48 h脫脂米糠總酚提取物DPPH自由基清除能力最強(qiáng),達(dá)到23.76 mg TE/100 g DW,與Kupski等[6]研究結(jié)果類似。

表1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)米糠酚酸提取物的DPPH自由基清除能力的影響(mg TE/100 g DW)Table 1 Effect of different fermentation time on DPPH free radical scavenging ability of phenolic acid extract in rice bran(mg TE/100 g DW)

2.5 功能性質(zhì)分析

持水性通常是指以大分子構(gòu)成的機(jī)體結(jié)構(gòu)通過物理方式截留水從而阻止水滲出的能力。微生物在發(fā)酵過程中,淀粉等糖類物質(zhì)被菌體分解利用,轉(zhuǎn)化為有機(jī)酸,如蘋果酸、阿魏酸、乳酸等[22]。由圖4可知,米糠持水性逐漸下降,當(dāng)脫脂米糠發(fā)酵48 h時(shí),持水性比發(fā)酵0 h時(shí)降低18.3%,原因可能是由于米糠中可溶性物質(zhì)的析出導(dǎo)致的。而由圖4可知米糠的持油性隨發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸上升,當(dāng)脫脂米糠發(fā)酵48 h時(shí),其持油性比發(fā)酵0 h組提高46.6%,其原因可能是隨著發(fā)酵進(jìn)行,米糠中的淀粉和蛋白質(zhì)等物質(zhì)被米根霉分解消化,纖維素和木質(zhì)素被水解,可溶性膳食纖維增加,米糠的空間結(jié)構(gòu)變得松散,比表面積增大,暴露了一些親油基團(tuán),與油脂的接觸面積增大,因此持油能力提高[23]。由Ahmad等[24]的研究可知,在用真菌(靈芝、茶樹菇、杏鮑菇、金針菇及香菇)發(fā)酵米糠時(shí),米糠的持水性和持油性在不同菌種發(fā)酵后發(fā)生改變,其中金針菇菌種發(fā)酵的米糠持水性減弱,持油性增強(qiáng),與本研究結(jié)果相似。

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間米糠的持水性、持油性Fig.4 Water holding capacity and oil holding capacity of rice bran under different fermentation time

3 結(jié)論

不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)米糠的多酚和黃酮含量及其體外抗氧化能力影響較大。脫脂米糠在發(fā)酵36 h時(shí),總酚含量達(dá)到最大值,為917.83 mg/100 g,與未處理組相比總酚含量增加47.3%?？傸S酮的含量在發(fā)酵48 h達(dá)到最大值,為1030.17 mg/100 g,與未處理組相比總黃酮含量增加48.96%。抗氧化能力在發(fā)酵48 h DPPH自由基清除能力最高。而米糠中的功能性成分ARs含量有輕微的提高。持油和持水能力發(fā)生改變,在0～48 h持水能力隨發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸降低,持油能力隨發(fā)酵時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)。研究結(jié)果表明,利用米根霉發(fā)酵的米糠可以開發(fā)營(yíng)養(yǎng)更豐富的功能性產(chǎn)品。發(fā)酵過程中相關(guān)酚酸變化需進(jìn)一步研究,以便闡明發(fā)酵造成相關(guān)變化原因。