藍(lán)莓果汁貯藏中非酶褐變影響因素評(píng)價(jià)

王 鑫,魏 婧,2,馬 蕊,馬永強(qiáng),*

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076;2.濰坊市皓遠(yuǎn)食品有限公司,山東濰坊 261000)

藍(lán)莓(Blueberry)為杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)常綠灌木,其果皮呈藍(lán)色(或藍(lán)黑色)故稱藍(lán)莓[1]。藍(lán)莓果很小,但口感極佳,可直接食用,也可以加工成果汁飲料、果醬和果酒飲品等[2-3]。果汁褐變分為酶促褐變(Enzymatic browning)和非酶促褐變(Non-enzymatic browning),酶促褐變主要發(fā)生于果汁加工過程中,且反應(yīng)機(jī)制已廣泛研究,而非酶促褐變反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜,不僅在果汁加工和貯藏過程中常見,同時(shí)可促使果汁貯藏壽命減短。

多元酚氧化縮合反應(yīng)、美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)以及抗壞血酸氧化分解反應(yīng)可引起果汁非酶褐變,并對(duì)不同果汁影響大小不同[4]。目前,很多學(xué)者對(duì)各類果汁貯藏過程中非酶褐變反應(yīng)進(jìn)行了研究,Roig等[5]通過桔汁儲(chǔ)藏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),由于抗壞血酸發(fā)生氧化降解導(dǎo)致儲(chǔ)藏過程中美拉德反應(yīng)對(duì)其發(fā)生非酶褐變作用不顯著,同時(shí)氨基化合物可促進(jìn)非酶褐變發(fā)生。Marti等[6]研究表明,向果汁中過多添加抗壞血酸會(huì)致使褐變程度加重。Paravisini等[7]發(fā)現(xiàn)蘋果汁在35 ℃下儲(chǔ)存時(shí),非酶褐變主要與多元酚類化合物有關(guān)。Macdonald等[8]發(fā)現(xiàn)香蕉汁在殺菌過程中,顏色變化的主要原因是焦糖化反應(yīng)。張?zhí)淼萚9]研究發(fā)現(xiàn)在蘆薈制品加工和貯存過程中,多酚類物質(zhì)的濃度是造成非酶褐變的主要原因。國內(nèi)對(duì)藍(lán)莓的研究起步較晚,目前主要集中于藍(lán)莓的生物活性功能方面的研究,對(duì)藍(lán)莓汁非酶促褐變反應(yīng)方面尚未進(jìn)行深入研究,對(duì)預(yù)防藍(lán)莓汁非酶褐變的研究對(duì)于提高藍(lán)莓汁品質(zhì)具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)選用三氯乙酸(TCA)作為酶促褐變反應(yīng)終止劑,對(duì)藍(lán)莓汁分別在4、25 和37 ℃下進(jìn)行貯藏,以總酚、褐變指數(shù)(BI)、5-羥甲基糠醛(5-Hydroxymethylfurfural,5-HMF)含量以及抗壞血酸含量為考查指標(biāo),對(duì)藍(lán)莓汁貯藏過程中非酶因素進(jìn)行評(píng)價(jià),為抑制和降低褐變程度提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍(lán)莓(-18 ℃下貯存) 大興安嶺百盛藍(lán)莓科技開發(fā)有限公司;三氯乙酸(TCA) 天津永大化學(xué)實(shí)際有限公司;抗壞血酸 天津博迪化工股份有限公司;2,6-二氯靛酚、福林酚 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉 湖北邦盛化工有限公司;鄰苯二酚 鄭州盛凱化工產(chǎn)品有限公司;乙酸鋅 天津市巴斯夫化工有限公司;草酸 哈爾濱市新達(dá)化工廠;D001強(qiáng)酸大孔苯乙烯系陽離子交換樹脂 上海維塔化學(xué)試劑有限公司。

BS 224S型分析天平 德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;LG10-2.4A型高速離心機(jī) 北京京立離心機(jī)有限公司;R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司;V-5000可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司;ZD-2型自動(dòng)電位滴定儀 上海儀田精密儀器有限公司;UV1000單光束紫外-可見分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司;TU-1901雙光束紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司;PHS-3C型pH計(jì) 上海精密儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓果汁的制備 將藍(lán)莓果室溫下自然解凍,在榨汁機(jī)中破碎15 s,將得到的藍(lán)莓汁在4000 r/min下離心15 min,過濾,取上清液分裝于100 mL玻璃瓶中,即為藍(lán)莓果汁樣品。并存入4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 非酶促褐變反應(yīng)各體系的建立 按照表1進(jìn)行體系的建立。

表1 不同體系的成分表Table 1 Composition table of different systems

1.2.2.1 體系1的建立 為研究抗壞血酸分解反應(yīng)、美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)及多元酚氧化縮合反應(yīng)對(duì)藍(lán)莓果汁非酶促褐變的影響建立體系1,且由于體系1只抑制了酶促反應(yīng)可研究總酚含量的變化。參照田玉庭[10]的試驗(yàn)方法,取一定量的藍(lán)莓果汁樣品利用三氯乙酸來終止酶促反應(yīng),按1 mL多酚氧化酶粗酶液(兩層紗布過濾,4 ℃,10000 r/min離心30 min)加等量TCA,其中TCA濃度逐步為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%八個(gè)濃度梯度直至令其反應(yīng)終止,添加0.05 mol/L鄰苯二酚2 mL,用分光光度計(jì)在410 nm下測定樣品的OD值,每隔30 s讀數(shù),觀察吸光值變化情況。算出所對(duì)應(yīng)酶活(每分鐘增加0.001吸光值即為1單位活力)并作圖。

1.2.2.2 體系2的建立 根據(jù)1.2.2.1確定體系1中TCA濃度為12%后,用陽離子交換樹脂處理體系1的藍(lán)莓汁,去除氨基酸[11]。此體系的建立是為了研究焦糖化、抗壞血酸氧化分解及多元酚氧化縮合對(duì)非酶促褐變的影響。具體操作為:為去除氨基酸形式所存在的氮元素以去除氨基酸,進(jìn)行D001大孔苯乙烯系強(qiáng)酸陽離子交換樹脂對(duì)氨基態(tài)氮靜態(tài)交換吸附實(shí)驗(yàn),向藍(lán)莓汁中添加不同含量的D001陽離子交換樹脂(0、5%、10%、15%、20%),每30 min攪拌一次,在室溫下放置15 h,原果汁作為未處理的空白組,每隔2小時(shí)測定20 h內(nèi)原果汁和交換吸附后果汁的氨基態(tài)氮的濃度,篩選最佳陽離子交換樹脂添加量。之后向藍(lán)莓果汁中添加最適含量的D001陽離子交換樹脂,步驟同上,求出表觀交換吸附量，獲得陽離子交換樹脂交換吸附平衡時(shí)間。

式(1)

式中:Q-表觀吸附量(mg/g);C0-起始濃度(mg/mL);Ct-某時(shí)間點(diǎn)的濃度(mg/mL);V-吸附溶液的體積(mL);W-樹脂濕質(zhì)量(g)。

1.2.2.3 體系3的建立 此體系的pH=2(抗壞血酸(VC)在pH=2時(shí)氧化反應(yīng)緩慢而不明顯)。體系3的建立是為了研究焦糖化反應(yīng)和多酚氧化縮合反應(yīng)對(duì)非酶促褐變的影響[12]。具體操作為:藍(lán)莓樣液加1 mL TCA經(jīng)離心(4000 r/min 15 min)后,分別取10 g藍(lán)莓汁于試管中按不同比例分別添加亞硫酸鹽,以不添加亞硫酸鹽為對(duì)照組,90 ℃水浴5 h,測定A420值并計(jì)算其非酶褐變抑制率。其中,添加亞硫酸鈉和亞硫酸氫鈉的濃度梯度均選用為50、100、150、200、250、300 μg/g。

即利用相減法可得,體系1-體系2間所發(fā)生的是美拉德反應(yīng),而體系2-體系3之間發(fā)生的是抗壞血酸氧化分解反應(yīng)。

1.2.3 貯藏實(shí)驗(yàn) 各體系樣液分別于4、25和37 ℃條件下貯藏50 d,每5 d測定褐變指數(shù)、5-HMF、VC、總酚等相關(guān)指標(biāo)。

1.2.4 褐變指數(shù)的測定及抑制率計(jì)算 果汁的褐變度用420 nm波長處的吸光度(A420)表示。取適量待測果汁樣品,于9000 r/min離心20 min,取上清液,測定A420值,以水為空白[13]。

式(2)

式中:T為抑制率,%;A0為420 nm處未加抑制劑的藍(lán)莓汁的吸光度;Ai為420 nm處加入抑制劑的藍(lán)莓汁的吸光度[14]。

1.2.5 VC含量測定 采用電位法測定[15-16]。

1.2.6 氨基態(tài)氮的測定 采用GB/T 5009.39-2003方法測定。

1.2.7 5-羥甲基糠醛含量測定 取藍(lán)莓汁樣品5 g,用25 mL蒸餾水稀釋溶解后,移入50 mL容量瓶,加入0.5 mL澄清劑Ⅰ(15% 亞鐵氰化鉀)、搖勻;再加入0.5 mL澄清劑Ⅱ(30%乙酸鋅),搖勻,用蒸餾水定容至刻度。于9000 r/min離心10 min,吸取上層清夜各5 mL于2個(gè)10 mL比色管中。在一個(gè)比色管中加入5 mL 0.20 g/100 mL NaHSO3溶液,混勻,為參比液;另一個(gè)比色管中5 mL蒸餾水,混勻,為待測液。用石英比色皿于284 nm和336 nm波長處測定待測樣液的吸光度[17-18]。

式(3)

式中:X為藍(lán)莓汁樣品中5-HMF的含量,mg/100 g;m為樣品質(zhì)量,g;14.97為換算系數(shù)。

1.2.8 總酚含量的測定 福林-酚比色法測定[19],總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:測定沒食子酸濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL時(shí)吸光度,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.9522x+0.0585,R2=0.981。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 9.50軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,數(shù)據(jù)用Mean±SD表示。圖表采用Excel 2013和Origin 8.5完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 各體系樣品預(yù)處理?xiàng)l件篩選結(jié)果

2.1.1 體系1中三氯乙酸濃度的確定 由圖1可知,隨TCA添加濃度的上升,酶活性逐漸下降,當(dāng)TCA添加濃度為14%時(shí),酶活力為-0.0018 U/g,酶的活力只能為0或正值,負(fù)值并無意義。同時(shí)也可看出,各濃度下的三氯乙酸對(duì)酶促反應(yīng)都起到了一定的抑制作用。經(jīng)比較,最終選用添加TCA濃度為12%(處理后即為體系1樣品)。

圖1 三氯乙酸濃度對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effects of trichloroacetic acid concentration on enzyme activity

2.1.2 體系2中D001陽離子交換樹脂的篩選 由表2可得,不同含量的陽離子交換樹脂對(duì)藍(lán)莓果汁中氨基態(tài)氮含量的影響不同,體系2藍(lán)莓汁樣品中添加D001陽離子交換樹脂含量為10%、15%時(shí)對(duì)氨基態(tài)氮含量的影響差異不明顯,隨著樹脂添加量增加表觀吸附量趨于平衡,且無明顯差異。因此選擇填加D001陽離子交換樹脂含量為10%時(shí)吸附作用最適。

表2 不同含量樹脂對(duì)果汁中氨基態(tài)氮的影響Table 2 Effects of different fruit juice contents on resin amino nitrogen

向藍(lán)莓果汁中加入10%含量D001陽離子交換樹脂,隨著吸附時(shí)間的增加,氨基態(tài)氮含量逐漸降低,且吸附量逐漸增大,當(dāng)超過16 h后,氨基態(tài)氮的表觀交換吸附量趨于無顯著差異的穩(wěn)定狀態(tài)(見表3),說明吸附作用達(dá)到平衡,因此D001陽離子交換樹脂交換吸附平衡時(shí)間為16 h。

表3 10% D001陽離子交換樹脂對(duì)氨基態(tài)氮的影響Table 3 Effects of 10% D001 cation exchange resin on of amino nitrogen

2.1.3 體系3中亞硫酸鹽的篩選 如圖2所示,無論是亞硫酸鈉還是亞硫酸氫鈉對(duì)藍(lán)莓果汁褐變均有一定的抑制作用,隨著濃度的提高,抑制率也相應(yīng)增大,當(dāng)濃度≥200 μg/g時(shí),則趨于平衡狀態(tài),相對(duì)而言,亞硫酸氫鈉的抑制效果更為明顯,所以本試驗(yàn)選取濃度為200 μg/g的NaHSO3添加到藍(lán)莓汁中,即構(gòu)成體系3樣品。

圖2 亞硫酸鹽對(duì)藍(lán)莓果汁褐變的抑制Fig.2 Sulfite inhibition of blueberry juice browning

2.2 非酶褐變反應(yīng)對(duì)藍(lán)莓汁在貯藏過程中主要因素的影響

2.2.1 褐變指數(shù)的變化 在貯藏過程中,各體系藍(lán)莓汁A420值均有上升趨勢,但增加程度不同,如圖3所示,貯藏50 d時(shí),當(dāng)溫度為37 ℃時(shí),體系1的A420值分別是體系2和體系3 A420值的1.03倍和1.76倍;當(dāng)溫度為25 ℃時(shí),體系1的A420值分別是體系2和體系3 A420值的1.1倍和1.86倍;當(dāng)溫度為4 ℃時(shí),體系1的A420值分別是體系2和體系3 A420值的1.37倍和1.71倍,褐變指數(shù)均呈現(xiàn)出體系1>體系2>體系3的規(guī)律,體系1-體系2間所發(fā)生的是美拉德反應(yīng),而體系2-體系3之間發(fā)生的是抗壞血酸氧化分解反應(yīng),且從圖中體系1、2、3曲線相差幅度可看出抗壞血酸氧化分解反應(yīng)褐變程度比美拉德反應(yīng)嚴(yán)重。

圖3 褐變指數(shù)的變化Fig.3 Changes browning index注:a為4 ℃貯藏下各體系A(chǔ)420的變化;b為25 ℃貯藏下各體系A(chǔ)420的變化;c為37 ℃貯藏下各體系A(chǔ)420的變化。

2.2.2 VC含量的變化 由于抗壞血酸極易氧化分解,并可與氨基酸發(fā)生反應(yīng)生成紅色素和黃色素,因此選取藍(lán)莓汁+TCA的體系1可體現(xiàn)抗壞血酸含量的變化,圖4中可以看出抗壞血酸隨貯藏時(shí)間的延長有一定的降解,不同貯藏溫度下,其降解程度不同,前5 d內(nèi)急劇下降,隨后貯藏期間VC降解的速率相對(duì)緩慢,這一現(xiàn)象與Rolga等[20]研究的柑橘汁和萬鵬[21]研究的荔枝果汁中抗壞血酸的變化規(guī)律十分相似。

圖4 貯藏過程中藍(lán)莓汁抗壞血酸的變化(體系1)Fig.4 Changes during storage blueberry juice ascorbic acid(System 1)

2.2.3 總酚含量的變化 果汁中的多元酚不僅僅可以與蛋白質(zhì)作用形成聚合物使其含量減少,導(dǎo)致果汁混濁,還可以自身進(jìn)行氧化縮合、與果汁體系中其他物質(zhì)發(fā)生共色作用,最終導(dǎo)致果汁非酶褐變,影響果汁品質(zhì)[22-23]。如圖5可知,沒食子酸的濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,R2=0.981。將體系1藍(lán)莓果汁樣品分別置于4、25和37 ℃下貯藏,總酚含量隨時(shí)間增加而逐漸下降(圖6)。貯藏50 d后,各溫度下總酚含量分別損失了2.1%、7.2%和9.4%,變化不是很明顯,該結(jié)果表明,總酚含量的變化是引起藍(lán)莓汁非酶褐變的原因之一,但不是主要原因。

圖5 總酚的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of total phenols

圖6 貯藏過程中藍(lán)莓汁總酚含量變化(體系1)Fig.6 Changes during storage blueberry juice total phenol content(System 1)

2.2.4 5-HMF含量的變化 體系1為研究抗壞血酸分解反應(yīng)、美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)及多元酚氧化縮合反應(yīng)對(duì)藍(lán)莓果汁非酶促褐變的影響,且5-HMF是衡量果汁褐變的重要指標(biāo)之一,是美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)以及抗壞血酸氧化分解反應(yīng)的共同中間產(chǎn)物[24-25],因此選取體系1為研究對(duì)象,如圖7所示,藍(lán)莓汁貯藏50 d時(shí),37 ℃下5-HMF總含量分別為25、4 ℃貯藏下的1.2倍和1.8倍,總體而言,貯藏溫度不斷提高,5-HMF含量也隨之增加。因此可以5-HMF為重要測定指標(biāo)來評(píng)價(jià)這三種反應(yīng)分別對(duì)藍(lán)莓汁在貯藏過程中的作用大小。

圖7 貯藏過程中藍(lán)莓汁非酶褐變5-HMF總量(體系1)Fig.7 Storage blueberry juice non-enzymatic browning 5-HMF total process(System 1)

2.2.5 焦糖化反應(yīng)對(duì)藍(lán)莓汁非酶褐變的影響 果汁中甜味的主要來源是糖,糖類除了與氨基化合物發(fā)生美拉德反應(yīng)外,在加工或貯藏過程中高溫、酸性及高糖濃度條件下,極易發(fā)生焦糖化反應(yīng)。體系3在體系1的基礎(chǔ)上經(jīng)過添加200 μg/g NaHSO3來抑制美拉德反應(yīng)的產(chǎn)生,以確定焦糖化反應(yīng)對(duì)非酶褐變的影響,同時(shí)調(diào)節(jié)pH=2,使VC在整個(gè)貯藏期穩(wěn)定不易分解(圖8)。如圖9所示,藍(lán)莓汁貯藏前5 d時(shí),4,25和37 ℃這三種貯藏條件下5-HMF均有所上升,其原因是貯藏時(shí)將藍(lán)莓汁樣品裝入玻璃瓶中封蓋時(shí)空隙中殘留空氣中的氧氣與果汁中抗壞血酸有氧分解而導(dǎo)致的,耗完氧后,褐變指數(shù)不顯著,無變化,這一結(jié)果表明,焦糖化反應(yīng)幾乎對(duì)其非酶促褐變無影響,相對(duì)于其他反應(yīng)而言,可忽略不計(jì)。

圖8 貯藏過程中藍(lán)莓汁抗壞血酸(VC)的變化(體系3)Fig.8 Ascorbic acid(VC)of blueberry juice changes during storage(System 3)

圖9 貯藏過程中藍(lán)莓汁5-HMF的變化(體系3)Fig.9 5-HMF changes of blueberry juice during storage(System 3)

2.2.6 抗壞血酸氧化分解對(duì)藍(lán)莓汁非酶褐變的影響 利用相減法體系2-體系3即體現(xiàn)抗壞血酸氧化分解反應(yīng)是藍(lán)莓汁非酶促褐變的影響,由2.2.5結(jié)論可知,焦糖化反應(yīng)對(duì)藍(lán)莓汁非酶褐變的影響可忽略不計(jì),即體系2所得數(shù)據(jù)結(jié)果主要是由抗壞血酸氧化分解反應(yīng)所導(dǎo)致。如圖10所示,所測得的5-HMF含量為抗壞血酸氧化分解與焦糖化反應(yīng)所產(chǎn)生5-HMF之和,根據(jù)2.2.5分析結(jié)果表明,可視體系2所測5-HMF為抗壞血酸氧化分解而得。低溫情況下,5-HMF生成量甚少,即VC分解緩慢,無明顯特征。隨貯藏溫度上升,5-HMF生成量逐漸增加,25 ℃和37 ℃下貯藏前5 d,5-HMF生成速率極快,隨后5～45 d,逐漸增長,當(dāng)貯藏50 d時(shí),4、25和37 ℃條件下產(chǎn)生的5-HMF含量分別為0.075、0.165、0.19 mg/100 mg。由此可得,抗壞血酸氧化分解對(duì)非酶褐變反應(yīng)有一定程度的影響。

圖10 貯藏過程中藍(lán)莓汁5-HMF的變化(體系2)Fig.10 5-HMF changes of blueberry juice druing storage(System 2)

2.2.7 美拉德反應(yīng)對(duì)藍(lán)莓汁非酶褐變的影響 以5-HMF這一理化指標(biāo)為基準(zhǔn),利用相減法(體系1-體系2)所得到的5-HMF含量,即由美拉德反應(yīng)所生成。從圖11可以觀察到各個(gè)溫度下,體系2產(chǎn)生的5-HMF含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于體系1-2的值,經(jīng)數(shù)據(jù)分析可得,各貯藏溫度下抗壞血酸氧化分解反應(yīng)產(chǎn)生5-HMF的含量分別是美拉德反應(yīng)產(chǎn)生5-HMF含量的3、5.5、5.4倍。結(jié)果表明,美拉德反應(yīng)在藍(lán)莓汁貯藏過程中的作用僅占一小部分,相對(duì)而言,影響藍(lán)莓汁非酶褐變程度大小為:抗壞血酸氧化分解反應(yīng)>美拉德反應(yīng)>焦糖化反應(yīng)。

圖11 模擬體系在貯藏50d后產(chǎn)生的5-HMF含量比較Fig.11 Compare of 5-HMF contents in simulation system after 50 d storage

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)構(gòu)建三個(gè)不同藍(lán)莓汁體系,分別置于4、25和37 ℃條件下貯藏50 d,隨時(shí)間和溫度的變化,藍(lán)莓汁呈現(xiàn)出不同程度非酶褐變,其中總酚含量在整個(gè)貯藏過程中變化不大,因此總酚對(duì)于藍(lán)莓汁非酶褐變的影響較小。利用相減法分析得出各反應(yīng)分別產(chǎn)生5-HMF大小排列為抗壞血酸氧化分解反應(yīng)>美拉德反應(yīng)>焦糖化反應(yīng),可見抗壞血酸對(duì)其影響最大,從而揭示藍(lán)莓汁在貯藏過程中非酶褐變機(jī)制對(duì)褐變指數(shù)、總酚、抗壞血酸和5-羥甲基糠醛各指標(biāo)影響大小,對(duì)后續(xù)的非酶褐變機(jī)理深入研究有著重要的意義。