蒙自蹄蓋蕨醇提物的不同萃取物的抗氧化、降血糖及抗炎活性

李紅銳,孫靜賢,蔣孟圓,王 韋,劉宏程,邵金良,普曉云,李育逵,黃相中,*

(1.云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，民族藥資源化學(xué)國(guó)家民族事務(wù)委員會(huì)-教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,云南昆明 650500;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(昆明),云南昆明 650223)

蒙自蹄蓋蕨(AthyriummengtzeenseHieron)系蹄蓋蕨科(Athyriaceae)蹄蓋蕨屬(Athyrium)植物,主要分布于云南和四川,多生長(zhǎng)于山間林下或灌木叢中[1]。藥用蹄蓋蕨屬植物具有清熱解毒、利尿消腫、驅(qū)蟲(chóng)、止血之功效,民間用其治療痢疾、消腫止痛、外傷出血、驅(qū)蛔蟲(chóng)、瘡毒癤腫及配伍治療肺癌、淋巴白血病,蹄蓋蕨的提取物可以單獨(dú)或與抗癌劑配合使用,對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及腫瘤誘導(dǎo)的血管生成和轉(zhuǎn)移作用具有良好的抑制作用[2-4]。

鑒于蹄蓋蕨屬植物具有廣泛的生物活性,吸引了部分學(xué)者對(duì)該屬植物的化學(xué)成分及藥理活性等方面開(kāi)展研究工作。劉冬梅等[5]、鐘方麗等[6]研究發(fā)現(xiàn)該屬植物的化學(xué)成分主要為多酚、單萜、酚酸及甾體類(lèi)化合物,其中多酚類(lèi)化合物含量較高,且多酚類(lèi)化合物具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂、防止動(dòng)脈硬化、降血壓、抑制細(xì)菌與癌細(xì)胞生長(zhǎng)等多種生物活性[7-8]。然而,關(guān)于蹄蓋蕨屬植物的研究大多還局限于粗提物的生物活性上,對(duì)粗提物進(jìn)行初步純化再評(píng)估生物活性的研究較少,很多藥理活性及其目標(biāo)成分尚不清楚。目前,未見(jiàn)關(guān)于蒙自蹄蓋蕨的主要活性成分及其生物活性研究的相關(guān)報(bào)道,其食用價(jià)值及藥用價(jià)值僅限于民間經(jīng)驗(yàn)。

為了明確蒙自蹄蓋蕨的食用及藥用價(jià)值,本文采用不同極性的溶劑對(duì)蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物進(jìn)行萃取,并測(cè)定各萃取物的多酚含量。同時(shí),對(duì)各萃取物進(jìn)行了抗氧化、抗炎及抑制α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定,為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)利用該植物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蒙自蹄蓋蕨 采自云南省新平縣,經(jīng)云南大學(xué)陸樹(shù)剛教授鑒定為蹄蓋蕨屬植物蒙自蹄蓋蕨(AthyriummengtzeenseHieron)的干燥全草;1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、2,2-聯(lián)氮基-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺)二氨鹽(ABTS) 梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;α-葡萄糖苷酶、脂多糖4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG) Sigma公司;阿卡波糖 百靈威科技有限公司;RAW264.7細(xì)胞系 中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所;一氧化氮檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司;Folin-Ciocalteus試劑、無(wú)水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、DMSO試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

CY-500A型高速多功能粉粹機(jī) 上海塞耐機(jī)械有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司;MS105DU電子分析天平 云南光琛科技有限公司;722可見(jiàn)分光光度計(jì) 上?，F(xiàn)科分光儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蒙自蹄蓋蕨提取物及萃取物制備 取采于6月的蒙自蹄蓋蕨在25 ℃下室內(nèi)自然風(fēng)干至恒重,將其粉碎,過(guò)40目篩備用,稱取粗粉20.0 g按料液比1∶15 (w∶v)加入95%乙醇,80 ℃水浴加熱回流提取3次,每次2 h,抽濾并收集濾液,45 ℃減壓濃縮至乙醇揮發(fā)完全即得蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物(AMH)。

采用有機(jī)溶劑萃取法對(duì)蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物進(jìn)行純化,即稱取2.0 g AMH加純凈水稀釋至提取物完全溶解,用等體積的石油醚反復(fù)萃取樣品至石油醚層無(wú)色,按同樣的方法依次用乙酸乙酯和正丁醇萃取,得石油醚萃取物(AMP)、乙酸乙酯萃取物(AME)、正丁醇萃取物(AMB)和水相(AMW)。

1.2.2 蒙自蹄蓋蕨醇提物及其各萃取物中多酚含量的測(cè)定

1.2.2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 參照國(guó)標(biāo)法GB/T 8313-2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類(lèi)含量的檢測(cè)方法》[9]中的多酚測(cè)定方法,分別配制沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液及蒙自蹄蓋蕨的各待測(cè)樣品溶液,并將其濃度均稀釋為30 μg/mL,采用紫外可見(jiàn)分光光度儀于300～900 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全掃描,結(jié)果顯示最佳波長(zhǎng)為760 nm。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取2.5 mg干燥的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品,加純凈水稀釋,配制成濃度為25 μg/mL的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液。分別取0.00、0.10、0.20、0.40、0.80、1.20、2.00 mL沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)液,按1.2.2.1中的方法,于760 nm 處分別測(cè)定其吸光度,經(jīng)線性擬合得回歸方程:A=0.0079C+0.0148,決定系數(shù)R2=0.9961,實(shí)驗(yàn)表明沒(méi)食子酸在0.00～50.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)沒(méi)食子酸濃度與吸光度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(A為吸光度,C為沒(méi)食子酸濃度)。

1.2.2.3 多酚含量的測(cè)定 按照1.2.2.1的實(shí)驗(yàn)方法配制待測(cè)樣品溶液,于760 nm處測(cè)定其吸光度,以純凈水代替待測(cè)樣品為空白對(duì)照。每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。蒙自蹄蓋蕨各待測(cè)樣品多酚含量表示為mg 沒(méi)食子酸當(dāng)量/g蒙自蹄蓋蕨粉末質(zhì)量,計(jì)算公式如下:

式中:c為待測(cè)樣品稀釋后的多酚濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合得出(mg/mL);V為蒙自蹄蓋蕨各待測(cè)樣品提取液總體積(mL);K為待測(cè)樣品提取液稀釋倍數(shù);m為蒙自蹄蓋蕨粉末的質(zhì)量(g)。

1.2.3 清除DPPH自由基的活性 參照文獻(xiàn)[10-11],用無(wú)水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液,取2.0 mL不同質(zhì)量濃度的各待測(cè)樣品溶液(濃度分別為5、10、20、40、60、80、100 μg/mL),加入2.0 mL DPPH溶液,充分搖勻,室溫下避光反應(yīng)30 min,用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于517 nm處測(cè)定吸光度,按同樣的方法,測(cè)定樣品對(duì)照組(A2)以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液、空白對(duì)照組(A0)以無(wú)水乙醇替代待測(cè)樣品的吸光值。以VC作為陽(yáng)性對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。DPPH自由基清除率計(jì)算公式為:

清除率S(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中：A1為2.0 mL待測(cè)樣品+ 2.0 mL DPPH溶液反應(yīng)后的吸光值;A2為2.0 mL待測(cè)樣品+2.0 mL無(wú)水乙醇反應(yīng)后的吸光值;A0為2.0 mL無(wú)水乙醇+2.0 mL DPPH溶液反應(yīng)后的吸光值。

1.2.4 清除ABTS自由基的活性 參照文獻(xiàn)[12-13]的方法稍作改動(dòng),取0.2 mL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)樣品溶液(濃度分別為5、10、20、40、60、80、100 μg/mL)與0.8 mL ABTS+工作液充分混勻,室溫下反應(yīng)6 min后于734 nm處測(cè)定吸光值。以同樣的方法測(cè)定空白對(duì)照組(A0)和陽(yáng)性對(duì)照的吸光值,以VC為陽(yáng)性對(duì)照,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。ABTS自由基清除率按下式計(jì)算:

清除率S(%)=(A0-AS)/A0×100

式中:A0為0.2 mL無(wú)水乙醇+0.8 mL ABTS工作液的吸光值;As為0.2 mL不同質(zhì)量濃度的待測(cè)樣品溶液+0.8 mL ABTS工作液的吸光值。

1.2.5 抑制α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[14-16]的實(shí)驗(yàn)方法稍作改動(dòng),具體操作步驟如下:通過(guò)96孔板對(duì)各待測(cè)樣品的α-葡萄糖苷酶抑制活性進(jìn)行測(cè)定,實(shí)驗(yàn)中設(shè)置空白組、空白對(duì)照組、樣品組、樣品對(duì)照組。樣品組:各管分別加入50 μL PBS、10 μL樣品和20 μLα-葡萄糖苷酶溶液,37 ℃恒溫反應(yīng)5 min 后,各管加入底物20 μL,接著在37℃下繼續(xù)恒溫反應(yīng)15 min,再加入0.2 mol/L 碳酸鈉溶液50 μL 終止反應(yīng),于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)405 nm 處測(cè)定吸光度值(A),待測(cè)樣品的濃度范圍為12.5～200.0 μg/mL,每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,總體積為150 μL。樣品對(duì)照組:以PBS緩沖液代替α-葡萄糖苷酶液和底物;空白組:以PBS緩沖液代替樣品溶液;空白對(duì)照組:以PBS緩沖液代替α-葡萄糖苷酶液和底物;以阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照,其他試劑同樣品組。具體反應(yīng)體系配比情況見(jiàn)表1。

表1 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系配比情況(μL)Table 1 Propertion of experimental components for inhibiting the α-hypoglycemic activity in vitro(μL)

樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(A樣品-A樣品對(duì)照)/(A空白-A空白對(duì)照)]×100

1.2.6 體外抗炎活性的測(cè)定

1.2.6.1 RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2條件下,用含10%小牛血清、青霉素(1×105U/L)及鏈霉素(100c)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。待RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后備用。

1.2.6.2 對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 參照戴建國(guó)等[17]、黃洋等[18]的方法,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上,并調(diào)整細(xì)胞密度為 1×105個(gè)/L,每孔體積100 μL。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后,實(shí)驗(yàn)組加入50 μL不同濃度的各萃取物(6.3、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL),陽(yáng)性對(duì)照組加入50 μL L-NMMA(濃度為20 μg/mL),每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,藥物作用4 h后,實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和LPS組均加入50 μL濃度為2 μg/mL的LPS溶液,空白組不加藥物?？瞻讓?duì)照孔為不接種細(xì)胞的空白孔。培養(yǎng)24 h后,各孔加20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄各孔上清,分別加150 μL DMSO溶液,于室溫避光振蕩15 min,以酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值。并按公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組光吸收值-空白對(duì)照組光吸收值)/(空白組光吸收值-空白對(duì)照光吸收值)×100。

1.2.6.3 對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響 參照文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法,取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞稀釋為單細(xì)胞懸液,并調(diào)整濃度為1×108個(gè)/L,將細(xì)胞懸液接種于96孔板上,每孔100 μL,于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱環(huán)境下培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組、LPS組和空白組。實(shí)驗(yàn)組:分別加入蒙自蹄蓋蕨各萃取物(終濃度分別為:6.3、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL),各濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。陽(yáng)性對(duì)照組:以L-NMMA(用藥劑量終濃度為10.0 μg/mL)代替實(shí)驗(yàn)組中的樣品。LPS組:加入50 μL含1‰DMSO的培養(yǎng)液,空白組加入100 μL含1‰DMSO的培養(yǎng)液。藥物作用后,除空白組其余各組均加入脂多糖(LPS)刺激細(xì)胞,每孔50 μL/孔(終濃度為2 μg/mL),于相同的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)24 h,分別取各組培養(yǎng)體系的上清,按照試劑盒說(shuō)明測(cè)定NO濃度。具體方法為取70 μL細(xì)胞培養(yǎng)體系上清液,加入50 μL GriessⅠ試劑,充分搖勻10 min后再加入50 μL GriessⅡ,于 540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)管即可得出細(xì)胞培養(yǎng)體系上清液NO含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物多酚的含量

蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物多酚含量的測(cè)定結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)測(cè)得蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物中多酚含量為(142.8±2.1) mg/g,而乙酸乙酯萃取物中多酚含量可高達(dá)(258.6±1.7) mg/g。此前,王曉林等[20]對(duì)同屬植物猴腿蹄蓋蕨中的多酚含量進(jìn)行研究,其研究結(jié)果表明猴腿蹄蓋蕨中的多酚提取率最高可達(dá)169.27 mg/g,相比之下,本實(shí)驗(yàn)中蒙自蹄蓋蕨的多酚提取含量低于猴腿蹄蓋蕨,但采用不同極性的有機(jī)溶劑對(duì)提取物進(jìn)行萃取分段后,蒙自蹄蓋蕨的乙酸乙酯萃取物中多酚含量則遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于猴腿蹄蓋蕨粗提物中的多酚含量。蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物中多酚含量依次為AME>AMH>AMB>AMW>AMP。蒙自蹄蓋蕨中多酚集中分布于乙酸乙酯萃取部分,小極性的多酚所占比例較少,采用不同極性的有機(jī)溶劑對(duì)乙醇提取物進(jìn)行萃取分段,可實(shí)現(xiàn)初步富集和分離蒙自蹄蓋蕨中多酚的目的。

表2 蒙自蹄蓋蕨醇提物及其各萃取物的多酚含量Table 2 Total phenols content of different fractions of A. mengtzeense

2.2 清除DPPH自由基活性的測(cè)定

蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物清除DPPH自由基活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物均對(duì)DPPH自由基顯示出不同程度的清除活性。當(dāng)濃度低于60 μg/mL時(shí),隨著待測(cè)樣品濃度增加,其對(duì)DPPH自由基的清除活性也隨之增強(qiáng),當(dāng)濃度超過(guò)60 μg/mL時(shí),對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸趨于平緩。其中,AME清除DPPH自由基的活性最強(qiáng),且與陽(yáng)性對(duì)照維生素C相當(dāng)(IC50值分別為12.3和11.6 μg/mL),AMH和AMB對(duì)DPPH自由基的清除活性次之(IC50值分別為13.7和38.2 μg/mL),相同濃度下AMW和AMP對(duì)DPPH自由基的清除作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)弱于AME。蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物對(duì)DPPH自由基清除作用的大小依次為AME>AMH>AMB>AMW>AMP,實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示蒙自蹄蓋蕨具有抗氧化活性的成分主要集中于乙酸乙酯萃取部分,通過(guò)萃取可以實(shí)現(xiàn)富集活性成分的目的。

圖1 蒙自蹄蓋蕨醇提物及其各萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.1 DPPH radical scavenging activities of the parts partitioned from the ethanol extraction from A. mengtzeense

2.3 清除ABTS自由基活性的測(cè)定

蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物對(duì)ABTS自由基均表現(xiàn)出不同程度的清除作用,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),AME清除ABTS自由基的活性最強(qiáng);當(dāng)濃度為100 μg/mL時(shí),AME對(duì)ABTS自由基的清除率可高達(dá)93.2%,其清除作用與陽(yáng)性對(duì)照維生素C相當(dāng),強(qiáng)于同濃度的AMH和AMB對(duì)自由基的清除活性(清除率分別為89.6%和89.1%),且明顯強(qiáng)于相同濃度下AMW和AMP對(duì)ABTS自由基的清除活性(清除率分別為43.5%和19.5%);蒙自蹄蓋蕨醇提物及其各萃取物對(duì)ABTS自由基清除作用的大小依次為AME>AMH>AMB>AMW>AMP,AME、AMH和AMB的IC50值分別為12.4、26.7和32.3 μg/mL,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)AMW和AMP對(duì)自由基的清除作用較弱,未能通過(guò)Origin 9.0程序擬合得出IC50值。進(jìn)一步提示蒙自蹄蓋蕨具有抗氧化活性的成分主要集中于乙酸乙酯萃取部分,通過(guò)萃取可以實(shí)現(xiàn)定向分離。

圖2 蒙自蹄蓋蕨醇提物及其各萃取物對(duì)ABTS自由基的清除率Fig.2 ABTS radical scavenging activities of the parts partitioned from the ethanol extraction from A. mengtzeense

關(guān)于蹄蓋蕨屬植物中多酚類(lèi)化合物的研究還不十分清楚,Ueno[21]和Tadataka等[22]分別從蹄蓋蕨屬植物Athyriummesosorum中分離得到降蹄蓋蕨素(Norathyriol)、芒果苷(Mangiferin)、蹄蓋蕨素(Athyriol)等多種酚類(lèi)化合物,并對(duì)其中的降蹄蓋蕨素、芒果苷、蹄蓋蕨素、異蹄蓋蕨素等天然成分進(jìn)行了抗氧化活性測(cè)試,結(jié)果發(fā)現(xiàn)降蹄蓋蕨素的抗氧化活性最強(qiáng)。劉冬梅等[5]從猴腿蹄蓋蕨的根莖中分離得到原兒茶酸甲酯和原兒茶酸兩個(gè)化合物,并采用鐵氰化鉀還原法測(cè)定這兩個(gè)化合物的還原能力,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種化合物均有較強(qiáng)的還原能力,其中原兒茶酸的還原能力強(qiáng)于原兒茶酸甲酯。孫志恒[23]采用DPPH法探究猴腿蹄蓋蕨的抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)猴腿蹄蓋蕨(鮮)提取物的抗氧化活性明顯優(yōu)于猴腿蹄蓋蕨(干)的抗氧化活性(IC50值分別為17.46和42.37 μg/mL),而本實(shí)驗(yàn)中蒙自蹄蓋蕨的乙醇提取物及其乙酸乙酯萃取物對(duì)DPPH自由基的清除活性均比同屬植物猴腿蹄蓋蕨強(qiáng),綜合DPPH法和ABTS法的抗氧化評(píng)價(jià)結(jié)果可知,蒙自蹄蓋蕨抗氧化活性顯著,有待更深入的開(kāi)發(fā)和研究。

2.4 體外抑制α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定

α-葡萄糖苷酶抑制劑能競(jìng)爭(zhēng)性抑制位于小腸的各種α-葡萄糖苷酶,從而降低淀粉分解為葡萄糖的速度,進(jìn)而減緩腸道對(duì)葡萄糖的吸收,達(dá)到降血糖的目的[15]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用,進(jìn)而評(píng)估其降血糖活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,在本實(shí)驗(yàn)選定的濃度范圍內(nèi),未檢測(cè)到AMP對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用(IC50>200 μg/mL)。AMH、AMB對(duì)α-葡萄糖苷酶活性具有一定的抑制作用,而AME[IC50=(93.4±3.7) μg/mL)]能明顯地抑制α-葡萄糖苷酶的活性,其抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相近。

表3 蒙自蹄蓋蕨醇提物及其各萃取物在體外對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 3 α-Glucosidase inhibitory activity of the parts partitioned from the ethanol extraction from A. mengtzeense

2.5 體外抗炎活性的測(cè)定

2.5.1 蒙自蹄蓋蕨各萃取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響 由表4可以看出,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中陽(yáng)性對(duì)照組(L-NMMA濃度為20 μg/mL)、LPS組(2 μg/mL)和空白組對(duì)RAW264.7細(xì)胞的活力均沒(méi)有影響。樣品組中經(jīng)濃度為6.3～50.0 μg/mL的蒙自蹄蓋蕨各萃取物處理后的RAW264.7細(xì)胞存活率與空白組相比未出現(xiàn)下降趨勢(shì),在此濃度范圍內(nèi)蒙自蹄蓋蕨各萃取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞的正常增殖沒(méi)有明顯影響,但是,當(dāng)樣品濃度為100 μg/mL時(shí),經(jīng)AMP樣品作用后的RAW264.7細(xì)胞活力受到影響,細(xì)胞存活率約為空白組的一半,而樣品AME和AMB在該濃度下對(duì)細(xì)胞增殖仍沒(méi)有明顯影響。

表4 蒙自蹄蓋蕨各萃取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞存活率Table 4 The parts partitioned from the ethanol extraction from A. mengtzeense on cell livability in RAW264.7

2.5.2 蒙自蹄蓋蕨各萃取物對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響 采用LPS刺激RAW264.7細(xì)胞系建立體外炎癥模型評(píng)價(jià)蒙自蹄蓋蕨各萃取物的抗炎活性。由表5可知，模型組LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌了大量NO,與空白對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)。LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞經(jīng)蒙自蹄蓋蕨各萃取物干預(yù)后,NO的釋放量均有不同程度的降低,且具有濃度依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),AMP(12.5～100.0 μg/mL)、AME(25.0～100.0 μg/mL)及AMB(50.0～100.0 μg/mL)均能明顯地降低細(xì)胞上清液中NO的含量(見(jiàn)表5)。其中,當(dāng)濃度為100.0 μg/mL時(shí),加入待測(cè)樣品的實(shí)驗(yàn)組中NO含量與模型組相比差異性較為顯著(p<0.01),其抑制炎癥細(xì)胞釋放NO的效果明顯;當(dāng)濃度為6.3 μg/mL時(shí),AMP、AME、AMB抑制NO釋放的作用均不明顯,各組細(xì)胞上清液NO含量與模型組相比無(wú)顯著性差異(p>0.05)。

表5 蒙自蹄蓋蕨各萃取物對(duì)LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響Table 5 The effect of the parts partitioned from the ethanol extraction from A. mengtzeense on secretion of NO in RAW264.7

綜合考慮蒙自蹄蓋蕨各萃取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖及LPS刺激RAW264.7細(xì)胞NO分泌量的影響,在不影響細(xì)胞正常增殖的情況下,即當(dāng)濃度為50.0 μg/mL時(shí),AMP抑制NO的分泌比AME和AMB都強(qiáng),初步推斷抗炎的活性成分集中于AMP部分。

3 結(jié)論

多酚是蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物中主要的化學(xué)成分,含量為(142.8±2.1) mg/g,通過(guò)進(jìn)一步萃取分離后乙酸乙酯萃取物的多酚含量最高,達(dá)(258.6±1.7) mg/g。蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物及其各萃取物均有清除DPPH和ABTS自由基的活性且有濃度依賴性,其中乙酸乙酯萃取物清除兩種自由基的能力與陽(yáng)性對(duì)照(VC)相當(dāng),但AMP和AMB的清除能力相對(duì)較弱。蒙自蹄蓋蕨醇提物及其不同萃取物中,AMH、AME和AMB均能不同程度地抑制α-葡萄糖苷酶的活性,其中AME的抑制作用最強(qiáng),其抑制作用與陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖相近,而AMP則無(wú)明顯的抑制活性(IC50>200 μg/mL)。在100.0 μg/mL濃度下,蒙自蹄蓋蕨乙醇提取物的各萃取物均有極顯著降低炎癥細(xì)胞釋放NO的能力(p<0.01),其中AMP的抑制效果最為明顯。蒙自蹄蓋蕨醇提物及其不同萃取物中,抗氧化及降血糖的活性成分多集中分布于乙酸乙酯萃取物中,而抗炎的活性成分多富集于石油醚萃取部分。