平菇高絲氨酸乙?；D移酶基因的克隆及異源表達優(yōu)化

左澤紅,魏 韜,郭麗瓊,*,林俊芳,*,張中浩

(1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院生物工程系,廣東廣州 510640; 2.廣東省微生態(tài)制劑工程技術研究中心,廣東廣州 510640)

蛋氨酸,又稱甲硫氨酸,是人和動物體內(nèi)唯一的含硫必需氨基酸,在動物飼料[1-2]、食品和醫(yī)藥[3]等領域被廣泛應用。蛋氨酸原材料的獲得方法主要有化學合成法[4]、微生物發(fā)酵法[5-8]和酶法。其中,酶法合成以高絲氨酸為原料,通過高絲氨酸乙酰基轉移酶(homoserine acetyltransferase,HTA)乙?；癁镺-乙酰高絲氨酸,再經(jīng)過直接硫化或者轉硫化途徑最終生成蛋氨酸[9](見圖1)。該法操作簡單,綠色安全,是目前最具有應用前景的生產(chǎn)方式。而HTA作為該法中的第一個酶,對蛋氨酸的合成至關重要。

圖1 蛋氨酸生物合成途經(jīng)Fig.1 Methionine biosynthesis pathway注:CGS:胱硫醚c-合成酶;CBL:胱硫醚b-裂解酶; OAHS:鄰乙酰轉移酶硫氫化酶;MS:蛋氨酸合成酶。

HTA屬于α/β水解酶超家族[10],自1967年首次從真菌中發(fā)現(xiàn)HTA以來[11],已發(fā)現(xiàn)近90種來源于不同屬的HTA。目前已發(fā)現(xiàn)的HTA主要來源于枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)、鉤端螺旋體(Leptospirainterrogans)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)等[12-14],而在食用菌中尚未見報道。平菇(Pleurotusostreatus)是一種常見的灰色食用菇。根據(jù)已公布的P.ostreatusPC15基因組注釋結果,其基因組可能含有編碼HTA的基因,可作為蛋氨酸酶法合成的備選基因。

為研究不同來源HTA在蛋氨酸酶法合成中的情況,國內(nèi)外多個研究小組進行了不同角度的嘗試。1987年,Yamagata[15]研究了一株野生型和六株甲硫氨酸營養(yǎng)缺陷型釀酒酵母的HTA,其中,4株缺陷型菌株的細胞提取物中顯示出了酶活性,分別為24.7、1.52、20.3及7.22 mU/mg。劉琳[16]以pET-22b(+)為表達載體,將來源于鉤端螺旋體的hta基因在大腸桿菌BL21中表達,其酶活為0.033 U/mg。后來，Thangavelu等[17]以pDEST42為表達載體,將來源于金黃色葡萄球菌的hta基因在大腸桿菌BL21中表達,并對其酶學性質(zhì)進行了測定,高絲氨酸和乙酰輔酶A的Kcat/Km分別為3×10、4×105M-1S-1。其中,大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前應用最為廣泛的蛋白酶表達系統(tǒng)[18],具有遺傳背景清晰、生長迅速、表達高效、待選質(zhì)粒和宿主多等優(yōu)點[19]。但是,該系統(tǒng)也存在一定的缺點和局限性,如二硫鍵形成能力較弱[20]、缺乏真核細胞蛋白翻譯后的修飾系統(tǒng)[21-22]、表達的異源蛋白經(jīng)常以不溶且無催化活性的包涵體形式存在等。故而,探究重組蛋白在大腸桿菌中的有效可溶性表達具有較高的學術價值和應用前景。為減少包涵體、提高外源蛋白的可溶性表達量,一般有宏觀和微觀兩種解決方式,宏觀上,通過對誘導條件進行優(yōu)化以提高蛋白酶的可溶性表達[23];微觀上,通過尋找合適的表達載體和表達宿主來提高外源蛋白的有效可溶性表達。

針對大腸桿菌表達系統(tǒng)的優(yōu)勢及提高外源蛋白有效可溶性表達的解決辦法,本研究以臺灣白平菌絲球總RNA為模板,通過反轉錄PCR克隆獲得了hta基因,并利用網(wǎng)上在線工具分析了該基因及其蛋白質(zhì)序列,再以pET-32a(+)為表達載體,將重組質(zhì)粒pET32a-hta在大腸桿菌BL21(DE3)中成功實現(xiàn)表達,為了提高可溶性HTA蛋白在大腸桿菌的表達水平,對異丙基硫-β-半乳糖苷(IPTG)終濃度、誘導溫度和誘導時間進行了優(yōu)化,同時,也探究了不同表達載體、宿主對HTA比活力的影響,以期為進一步大規(guī)模生產(chǎn)蛋氨酸打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

平菇菌種(臺灣白平) 江蘇省高郵市科學食用菌研究所;克隆載體pMDTM18-T Takara;表達載體pET32a(+) 中山大學生命科學學院劉玉煥教授贈送;表達載體pET22b(+) 艾瑞生物技術有限公司;大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)、Rosetta(DE3)、Origami B(DE3)、Rosetta gami(DE3)plysS 上海唯地生物技術有限公司;Ex Taq酶、2×PCR Mix酶 東盛生物科技有限公司;限制性內(nèi)切酶EcoR I、Sal I、T4 DNA連接酶 賽默飛世爾科技有限公司;HP Fungal RNA Kit 飛揚生物工程有限公司;瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒 美基生物科技有限公司;TransScript one-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis superMix反轉錄試劑盒 北京全式金生物技術有限公司;Bradford Protein Assay Kit Takara;Super-Pref PAGE Gel(12%,15well)蛋白膠 廣州紐新生物科技有限公司。

5804R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;ZS-RSD3臺式恒溫振蕩器 上海旻泉儀器有限公司;SKJH-1109超凈工作臺 上海蘇坤有限公司;ETC811基因擴增儀 東盛興業(yè)科學儀器有限公司;EPS-300核酸電泳儀 上海天能科技有限公司;Basic 041BR蛋白質(zhì)電泳儀、GelDoCTMXR+凝膠快速成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司;LC-2030高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高絲氨酸乙?；D移酶基因hta的克隆 根據(jù)已報道的P.ostreatusPC15中的hta基因(Genbank登錄號:KDQ30216.1)的核苷酸序列,利用軟件Primer5設計PCR擴增引物,其中上游引物為HTA-F:5′-ATGGCGGCTTTCGCAAATCTCAT-3′,下游引物為HTA-R:5′-TTACCATCTTGTGATATCGACC TCCGC-3′。采用Fungal RNA Kit試劑盒提取平菇菌絲球總RNA,采用反轉錄試劑盒合成cDNA的第一鏈,以cDNA的第一鏈為模版進行PCR擴增,反應體系為:1 μL 模版,上、下游引物各2 μL,5 μL 10×Ex Taq Buffer,4 μL dNTP Mixture,0.25 μL Ex taq,加ddH2O至50 μL。反應條件為:94 ℃預變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸81 s,30個循環(huán),72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物回收后與克隆載體pMDTM18-T于4 ℃連接過夜,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞,經(jīng)菌落PCR驗證后,將結果呈陽性的克隆子送往廣州天一輝遠生物技術有限公司測序。

表1 質(zhì)粒的多克隆位點、抗生素抗性及誘導劑分析Table 1 Analysis of multiple cloning sites,antibiotic resistance and inducer of plasmid

1.2.2 高絲氨酸乙酰基轉移酶hta基因序列分析 使用網(wǎng)上在線軟件ExPAS-ProtParam tool、Protscale、PSIPRED、SWISS-MODEL分析hta基因編碼氨基酸序列的理化性質(zhì)、親疏水性、二級結構和三級結構。

1.2.3hta基因表達載體的構建 以陽性克隆子測序正確的重組克隆質(zhì)粒pMD18-T-hta為模版,在上、下游引物的5′端分別加上酶切位點EcoRI和SalI進行PCR擴增,回收獲得的PCR產(chǎn)物與空載體pET32a分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I 和Sal I進行雙酶切,回收目的基因及載體DNA片段后用T4 DNA 連接酶連接,連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,經(jīng)菌落PCR及測序驗證后,獲得含有重組表達載體(pET32a-hta)的重組大腸桿菌(BL21/pET32a-hta)。

1.2.4 重組菌的hta基因誘導表達及其產(chǎn)物的SDS-PAGE分析 將重組大腸桿菌(BL21/pET32a-hta)接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp+)中,37 ℃,200 r/min過夜培養(yǎng);以1%的接種量將1 mL活化后的菌液接種于100 mL LB(含100 μg/mL Amp+)液體培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.6,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG,16 ℃、120 r/min誘導表達16 h。發(fā)酵液于4 ℃、4000 r/min離心收集菌體,用10 mL的PBS(pH7.4)重懸菌體,冰浴超聲破碎(300 W,工作時間3 s,間歇時間3 s,全程時間5 min)后,4 ℃、8000 r/min離心10 min,收集上清,沉淀溶于等量的PBS(pH7.4)中,上清液、沉淀液分別取樣進行SDS-PAGE電泳,待電泳結束后將蛋白膠用考馬斯亮藍染色液染色30 min,再換脫色液過夜脫色至膠塊上出現(xiàn)清晰條帶,用GelDoCTMXR+凝膠快速成像系統(tǒng)拍照,根據(jù)蛋白電泳條帶粗步分析HTA蛋白的表達情況。

1.2.5 重組菌的hta基因誘導表達條件的優(yōu)化 為了探究重組酶的最優(yōu)表達條件,按1.2.4的方法分別對誘導溫度、IPTG終濃度、誘導時間進行優(yōu)化,根據(jù)SDS-PAGE電泳條帶粗步分析HTA蛋白的表達情況,以期得到最適的表達條件。

1.2.5.1 誘導溫度對重組蛋白表達的影響 設置IPTG終濃度為0.5 mmol/L,分別在溫度37、30、25、20、16 ℃下誘導表達16 h。

1.2.5.2 IPTG終濃度對重組蛋白表達的影響 設置IPTG終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L,在25 ℃下誘導表達16 h。

1.2.5.3 誘導時間對重組蛋白表達的影響 設置IPTG終濃度為0.2 mmol/L,在25 ℃下分別誘導4、8、12、14、16、20、24 h。

1.2.6 HTA酶活鑒定 將重組大腸桿菌(BL21/pET32a-hta)在最適條件下誘導表達,并按1.2.4中的方法收集菌體,超聲破碎離心后的上清液即為粗酶液,采用Protein Assay Kit試劑盒測定粗酶液中蛋白濃度。HTA酶活力單位1U為37 ℃、pH7.5的條件下,每分鐘轉化acetyl-CoA生成1 μmol CoA所需的酶量。重組酶HTA反應體系(600 μL)為:100 mmol/L磷酸鉀(pH7.5),25%蔗糖,0.13 mmol/L乙酰輔酶A(acetyl-CoA),10 mmol/L高絲氨酸,80 μL粗酶液,37 ℃孵育30 min;其中,陰性對照設置為不含酶只含底物的反應體系。HPLC條件為:WondaSil? C18Superb色譜柱(5 μm,4.6 mm×250 mm),流動相為磷酸鹽緩沖液(pH7.0)∶甲醇=(90∶10),檢測波長為259 nm,流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣量為20 μL。在該液相條件下對CoA標品制作標準曲線,采用面積外標法對樣品進行定量分析,并根據(jù)樣品中CoA的產(chǎn)量計算其比活力。

1.2.7 重組菌的hta基因誘導表達系統(tǒng)的優(yōu)化 為了探究重組酶的最適表達體系,選取了pET32a、pET22b 兩個表達載體,Rosetta(DE3)、Origami B(DE3)、Rosetta gami(DE3)plysS 三個表達宿主,組合了6組體系(Rosetta/pET32a-hta、Origami B/pET32a-hta、Rosetta gami plysS/pET32a-hta、Rosetta/pET22b-hta、Origami B/pET22b-hta、Rosetta gami plysS/pET22b-hta),以BL21/pET32a-hta為參照,在IPTG終濃度為0.2 mmol/L、溫度為25 ℃的條件下誘導表達16 h,按1.2.6的方法將上清粗酶液進行反應后,采用HPLC測定CoA濃度并計算比活力,以期得到最適的表達系統(tǒng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理和圖形的制作。

2 結果與分析

2.1 高絲氨酸乙?；D移酶hta基因的克隆

以HTA-F/HTA-R為引物,使用RT-PCR法從平菇中擴增hta基因片段,經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,獲得一條約為1338 bp的亮帶,與預期條帶大小一致(見圖2)。將回收的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接轉化后,隨機挑取LB(Amp+)固體培養(yǎng)基上長出的單菌落進行菌落PCR驗證,陽性克隆子測序后經(jīng)DNAMAN軟件進行核苷酸序列比對,結果與NCBI已上傳的P.ostreatusPC15基因組中的hta基因(GenBank登錄號:KDQ30216.1)DNA序列一致性為100%,說明已成功克隆hta基因。

圖2 平菇cDNA的RT-PCR擴增hta基因Fig.2 RT-PCR amplification of hta gene注:M:DNA Marker3;1、2:hta基因。

2.2 高絲氨酸乙?；D移酶hta基因功能預測分析

通過ExPAS-ProtParam tool對hta基因所編碼的蛋白質(zhì)進行理化分析,得到hta基因所編碼蛋白大小為49 kDa,由445個氨基組成,等電點pI 5.93。利用NCBI-Conserved Domains Search database進行保守結構序列分析,結果顯示HTA屬于α/β水解酶超家族,結構域序列號為c126325,結構域匹配E值為3.07e-161。利用Signal P 3.0對該氨基酸序列進行信號肽預測,結果表明并不存在信號肽特征。使用protscale在線分析氨基酸序列親疏水性結果如圖3所示。圖3中,正值越大,表示越疏水,負值越大,表示越親水,介于+0.5和-0.5的為兩性氨基酸,可知HTA的前后兩端無明顯的親疏水性,中間部分親水。如圖4為PSIPRED分析HTA的二級結構結果。由圖4可知,該氨基酸序列主要由無規(guī)則卷曲、螺旋和延伸鏈組成。利用SWISS-MODEL預測蛋白質(zhì)的三級結構,結果如圖5所示。由圖5可知,該蛋白具有明顯的空間結構且主要由螺旋和無規(guī)則卷曲組成,這與PSIPRED的分析預測結果一致。

圖3 氨基酸序列親疏水性分析Fig.3 The hydrophilicity and hydrophobicity analysis of the amino acid sequence

圖4 HTA的二級結構分析Fig.4 The secondary structure analysis of HTA

圖5 高絲氨酸乙?；D移酶三級結構圖Fig.5 The tertiary structure of HTA

2.3 重組菌的hta基因誘導表達及其產(chǎn)物的SDS-PAGE分析

將構建好的表達載體pET32a-hta轉化BL21(DE3)鑒定后,按1.2.4中的方法進行誘導表達,收集菌體溶于10 mL的PBS(pH7.4)中,超聲破碎釋放細胞中的蛋白,破碎液離心后可溶性蛋白主要存在于上清液中,而包涵體因其不可溶性主要聚集在沉淀中,將沉淀溶于等量的PBS(pH7.4)后,上清液、沉淀液分別取樣進行SDS-PAGE分析,結果如圖6所示。由圖6可以看出,在68.7 kDa(49 kDa+載體自帶蛋白19.7 kDa)處有清晰條帶,但主要存在于菌體破碎后的沉淀中,說明HTA重組蛋白在大腸桿菌中成功得到了表達,并且表達的蛋白只有少量以可溶性形式存在,而大部分重組蛋白仍以包涵體形式存在。

圖6 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of expression products注:M:蛋白Marker,圖7～圖9同; 箭頭標注處為HTA重組蛋白。

2.4 重組菌的hta基因誘導表達條件的優(yōu)化

2.4.1 誘導溫度的優(yōu)化 工程菌BL21/pET32a-hta在不同溫度下誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結果如圖7所示。由圖7可知,當溫度為25 ℃及以上溫度時,可溶性HTA蛋白的表達量相對較高;在16、20 ℃時,可溶性HTA蛋白的表達量相對較低。可能是因為溫度過低,菌體生長慢,外源蛋白表達速度低,從而導致最終重組蛋白中可溶性表達量減少。一般認為溫度越高,蛋白表達越快[24],積累的蛋白多肽來不及正確折疊,而易形成無活性的包涵體;而較低的誘導溫度有利于重組蛋白折疊形成正確的結構,提高外源蛋白的可溶性,因此,在后續(xù)實驗中,選取25 ℃作為最適誘導溫度。

圖7 不同誘導溫度對HTA蛋白表達的影響Fig.7 Effects of different induction temperatures on HTA expression

2.4.2 IPTG濃度的優(yōu)化 工程菌BL21/pET32a-hta在不同IPTG終濃度下誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結果如圖8所示。由圖8可知,當IPTG終濃度為0.2、0.4 mmol/L時,上清液中可溶性HTA蛋白的表達量相對較高,再增加IPTG濃度,可溶性HTA蛋白的表達量不再增加,反倒有下降趨勢。IPTG是乳糖類似物,少量的IPTG即能誘導乳糖操縱子,濃度過高會對菌體產(chǎn)生毒害作用[25],影響細胞的生長狀態(tài),從而影響可溶性蛋白的表達量。因此,在后續(xù)實驗中,選取IPTG終濃度為0.2 mmol/L作為最適誘導劑濃度。

圖8 不同IPTG濃度對HTA蛋白表達的影響Fig.8 Effect of different IPTG concentrations on HTA expression

2.4.3 誘導時間的優(yōu)化 工程菌BL21/pET32a-hta在不同誘導時間下誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結果如圖9所示。由圖9可知,隨著誘導時間的增加,可溶性HTA蛋白的表達量有上升的趨勢,而在16 h以后,可溶性HTA蛋白的表達量增加并不明顯。因此,為考慮時間成本,在后續(xù)實驗中,選取誘導時間為16 h作為最適誘導時間。

圖9 不同誘導時間對HTA蛋白表達的影響Fig.9 Effects of different induction time on HTA expression

2.5 HTA酶活鑒定

HTA能夠催化高絲氨酸和acetyl-CoA發(fā)生反應生成O-乙酰高絲氨酸和CoA,本實驗通過檢驗產(chǎn)物CoA的生產(chǎn)來鑒定酶活性。HPLC結果如圖10所示。圖10a中顯示CoA標準品的出峰時間為8.357 min;圖10b中確未見到有洗脫峰的出現(xiàn),說明沒有酶的存在,產(chǎn)物不會生成;10c中反應體系反應后出現(xiàn)洗脫峰時間為8.359 min 左右,出峰時間與標準品CoA 基本一致,所以HPLC結果初步證明HTA具有轉移乙?；钚?按1.2.6中的方法計算得到其比活力為1.6 mU/mg。

圖10 HPLC檢測結果Fig.10 HPLC test results注:a:CoA標準品;b:不添加酶的陰性對照; c:添加酶液的反應體系;箭頭標注處為目標產(chǎn)物峰。

2.6 表達系統(tǒng)的優(yōu)化

7株工程菌誘導表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結果如圖11所示。由圖11可知,當表達載體為pET32a時,在68.7 kDa(49 kDa+載體自帶蛋白19.7 kDa)處有清晰條帶;當表達載體為pET22b時,在51 kDa(49 kDa+載體自帶蛋白5 kDa)處有條帶,說明重組蛋白均成功得到表達。將7組表達體系誘導表達的可溶性HTA蛋白進行酶活檢測,結果如圖12所示。由圖12可知,當表達載體為pET32a-hta,表達宿主為Rosetta時,工程菌Rosetta/pET32a-hta誘導表達的HTA比活力最高,其最高比活力為2.2 mU/mg。

圖11 不同表達體系HTA蛋白表達情況Fig.11 Expression of HTA in different expression systems

圖12 不同表達體系HTA比活力Fig.12 Specific activity of HTA in different expression systems注:1:BL21/pET32a-hta;2:Rosetta/pET32a-hta; 3:Origami B/pET32a-hta;4:Rosetta gami plysS/pET32a-hta; 5:Rosetta/pET22b-hta;6:Origami B/pET22b-hta; 7:Rosetta gami plysS/pET22b-hta。

3 討論與結論

包涵體是大腸桿菌高效表達重組蛋白時由于錯誤的折疊形成的蛋白質(zhì)多聚體,并無生物活性,故而,探究重組蛋白在大腸桿菌中有效的可溶性表達具有較高的學術價值和廣泛的應用前景,但是蛋白質(zhì)的種類紛繁復雜,理化性質(zhì)各不相同,目前無法得到一個可以提高可溶性表達的通用方法,因而,針對不同的基因必須要對誘導條件進行優(yōu)化,才能獲得最大程度的可溶性表達。本研究中,對hta基因的誘導條件進行了優(yōu)化,結果表明:當IPTG終濃度為0.2 mmol/L,誘導溫度為25 ℃,誘導時間為16 h時,可溶性蛋白的表達量最高。

pET32a和pET22b屬于pET系列表達載體,是在原核生物中用來表達目的蛋白常用的表達載體,在T7 噬菌體啟動子和宿主菌提供的T7 RNA聚合酶的作用下能進行轉錄和翻譯,其中pET22b是pET系統(tǒng)中的分泌型表達載體,它主要靠載體上的pelB信號肽分泌目的蛋白到細胞周質(zhì)中,而pET32a載體則是在細胞質(zhì)中將重組蛋白進行表達。本實驗中,當選用pET22b載體時,可溶性蛋白的比活力相對較低,可能是因為通過超聲破碎法并未能將細胞周質(zhì)空間的重組蛋白完全釋放出來,另外本研究也采用滲透壓休克法對表達載體為pET22b的工程菌進行周質(zhì)蛋白提取,得到結果也并不理想。因此,當通過超聲破碎法釋放目的蛋白時,為獲得高比活力的可溶性蛋白,應選取pET32a表達載體。

不同的宿主菌對蛋白的可溶性表達也具有一定影響,當異源目的基因的mRNA在大腸桿菌中過表達時,tRNA的數(shù)量直接反映了mRNA的密碼子偏倚性,不充足的tRNA庫可能導致翻譯延遲、成熟前翻譯終止、翻譯移碼和氨基酸錯配,最終導致外源蛋白的活性喪失,而本研究所采用的表達宿主Rosetta(DE3)菌株能夠補充大腸桿菌缺乏的6種稀有密碼子(AUA、AGG、AGA、CUA、CCC、GGA)對應的tRNA,提高外源基因尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達水平。此外,由于大腸桿菌的細胞質(zhì)呈還原環(huán)境,致使重組蛋白無法折疊形成正確二硫鍵,因此構建促進二硫鍵形成的宿主不失為一種提高蛋白可溶表達的途徑,而本研究所采用的表達宿主Origami B(DE3)菌株包含突變的硫氧還蛋白還原酶和谷胱甘肽還原酶基因,表達主要還原途徑的兩個關鍵酶,有利于形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白。表達宿主Rosetta gami(DE3)pLysS賦予其Rosetta(DE3)和Origami B(DE3)的優(yōu)點,本研究中當表達宿主為Rosetta gami(DE3)pLysS時雖然解決了包涵體的問題,但可溶性蛋白的含量和比活力卻降低了,可能是因為該菌株攜帶的pLysS質(zhì)粒含有表達T7溶菌酶的基因,降低了目的基因的背景表達水平。Rosetta(DE3)、Origami B(DE3)及Rosetta gami(DE3)pLysS菌株均有自己獨特的優(yōu)勢提高外源蛋白的可溶性表達,具體選擇哪一種菌株還要視情況而定。當以酶活力為參考依據(jù),本研究中選用表達宿主Rosetta(DE3)時,工程菌Rosetta/pET32a-hta誘導表達的HTA蛋白比活力最高,為2.2 mU/mg。