鉻天青S法結(jié)合高效液相色譜法測(cè)定甲烷氧化菌素含量

陳林林,韓 可,李 偉,吳嘉樹(shù),辛嘉英,2

(1.哈爾濱商業(yè)大學(xué)省高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150076； 2.中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所羰基合成與選擇氧化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅蘭州 730000)

甲烷氧化菌是一類可以直接以甲烷作為碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌[1],對(duì)溫室效應(yīng)起到了有效的抑制作用[2]。甲烷氧化菌素(methanobactin,Mb)是一種小分子的熒光肽,在細(xì)胞外能以分泌物的形式存在,在細(xì)胞內(nèi)參與顆粒性甲烷單加氧酶(MMO)的組成,并且存在于細(xì)胞內(nèi)膜上[3]。Mb與銅結(jié)合后所形成的物質(zhì)會(huì)影響MMO的活性[4],MMO作為甲烷氧化菌的典型特征代謝產(chǎn)物,能將甲烷催化氧化為甲醇[5]。Mb與銅的結(jié)合物Mb-Cu具有超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性[6-7],Mb不僅能清除超氧陰離子,而且能夠清除羥自由基,可以應(yīng)用于延緩衰老的功能性食品或化妝品當(dāng)中,作為抗氧化劑也具有一定的應(yīng)用前景。

由于Mb發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng),且甲烷氧化菌在發(fā)酵過(guò)程中由于發(fā)酵條件的限制產(chǎn)生的Mb含量較低。因此為了獲得純度高、成熟的Mb,需要在發(fā)酵過(guò)程中實(shí)現(xiàn)對(duì)Mb含量的監(jiān)控以及對(duì)發(fā)酵成熟的Mb進(jìn)行檢測(cè)。Mb含量的檢測(cè)方法有分光光度法、紫外光譜法、熒光法以及高效液相色譜法等[8]。利用紫外檢測(cè)定量Mb會(huì)有很大的誤差,因?yàn)榧淄檠趸诎l(fā)酵的過(guò)程中會(huì)向菌液釋放很多有紫外吸收的小肽,對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響。國(guó)外曾有利用鉻天青(CAS)法瓊脂平板檢測(cè)甲烷氧化菌產(chǎn)Mb的例子[9-10],利用CAS法,通過(guò)顏色變化更直接地進(jìn)行檢測(cè)。

利用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)M.trichosporiumOB3b代謝的Mb每24 h含量進(jìn)行測(cè)定,確定M.trichosporiumOB3b分泌Mb的日變化趨勢(shì),但是卻無(wú)法驗(yàn)證Mb的成熟程度。鉻天青法可以通過(guò)咪唑基團(tuán)與Cu的結(jié)合產(chǎn)生顏色的變化,從而檢測(cè)Mb發(fā)酵的程度以及含量。本文通過(guò)紫外光譜對(duì)Mb在CAS體系中發(fā)生的光譜變化,作為分析利用CAS法檢測(cè)Mb的測(cè)定依據(jù),并通過(guò)優(yōu)化后的CAS法檢測(cè)M.trichosporiumOB3b發(fā)酵液當(dāng)中的Mb含量。既實(shí)現(xiàn)了對(duì)Mb的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),又可以更準(zhǔn)確直接地檢測(cè)Mb,為Mb通過(guò)發(fā)酵法富集和應(yīng)用的研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲基彎菌(M.trichosporiumOB3b) 俄羅斯科學(xué)院催化研究所;鉻天青S、十六烷基三甲基溴化銨(HDTMA) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所;乙二胺四乙酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉、無(wú)水乙醇、甲醇 天津市天力化學(xué)試劑有限公司;HP-20大孔吸附樹(shù)脂 日本三菱化學(xué)公司。

BSA224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;DHG-9203A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、R-20旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;HDL潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;YY-15-2PF2 單相電容運(yùn)轉(zhuǎn)電動(dòng)機(jī) 上海申勝生物技術(shù)有限公司;U3000高效液相色譜儀 Themo儀器有限公司;SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HNY-100B恒溫培養(yǎng)振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司;TGL-16高速臺(tái)式離心機(jī) 上海醫(yī)療器械六廠;2-16K冷凍離心機(jī)、Z-16K冷凍離心機(jī) Sigma公司;UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津;F-7000FL220-240V熒光光譜儀 Watter公司;UV-2550組合式紫外檢測(cè)器 上海金達(dá)生化儀器有限公司;HL-2S恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司;Ulti Mate3000高效液相色譜儀 賽默飛世爾儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 Mb的培養(yǎng)以及分離純化 根據(jù)文獻(xiàn)[11]按照OB3b菌種培養(yǎng)基配制方法,配制1 L培養(yǎng)基置于發(fā)酵罐中,以甲烷為碳源,培養(yǎng)周期為24 h。培養(yǎng)周期結(jié)束后對(duì)Mb進(jìn)行分離純化。通過(guò)冷凍干燥后,得到Mb的凍干粉。

1.2.2 光譜分析Mb及CAS法測(cè)定的依據(jù)

1.2.2.1 紫外光譜分析Mb發(fā)酵程度 取1.2.1純化后的Mb利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在200～700 nm之間進(jìn)行掃描,通過(guò)Mb在紫外中的特征峰判定Mb的成熟程度,以確定發(fā)酵成熟后Mb可利用CAS法測(cè)定的依據(jù)。在此基礎(chǔ)上可以測(cè)定分離純化后Mb凍干粉的純度,進(jìn)一步作為HPLC定量的依據(jù),從而實(shí)現(xiàn)發(fā)酵前4 d Mb含量的測(cè)定。

1.2.2.2 排除其他小肽對(duì)檢測(cè)方法的影響 將純化到的Mb干粉,取2.5 mg利用蒸餾水定容至5 mL制成樣液。取2個(gè)25 mL的容量瓶,分別向其中加入2.0 mL 0.02 mmoL/L CAS 溶液、4.0 mL 0.02 mmoL/L HDTMA溶液及2.0 mL磷酸緩沖溶液(0.4 g/L K2HPO4、0.262 g/L KH2PO4、0.74 g/L Na2HPO4),向其中一個(gè)容量瓶中加入1 mL的Mb樣液。搖勻定容,15 min后用1 cm比色皿,在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,得二者的紫外吸收光譜圖進(jìn)行分析對(duì)比。

1.2.2.3 Mb與Mb-Cu紫外光譜檢測(cè) 在比色皿中加入2 mL濃度為5×10-4moL/L的Mb溶液,使用5 μL微量進(jìn)樣器向其中逐漸注入0.1 moL/L的CuSO4溶液,利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)觀察Cu加入后Mb的紫外光譜變化。

1.2.2.4 Mb奪取CAS體系中Cu2+的證明 將純化到的Mb干粉,取2.5 mg定容至5 mL制成樣液。取4個(gè)25 mL的容量瓶,分別用移液管移取2.0、2.0、1.2、4.0、1.0、1.0 mL的磷酸緩沖溶液、0.02 mmoL/L 的CAS、CuSO4、HDTMA溶液、0.01 moL/L EDTA溶液及Mb樣液,按CAS+HDTMA、CAS+HDTMA+CuSO4、CAS+HDTMA+CuSO4+EDTA、CAS+HDTMA+CuSO4+Mb的組合方式在四個(gè)瓶中加入溶液,搖勻定容,15 min后分別在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描,得四者的紫外吸收光譜圖進(jìn)行分析對(duì)比。

1.2.3 CAS法檢測(cè)條件的確定 取數(shù)個(gè)25 mL容量瓶,加入2 mL的0.02 mmoL/L CAS溶液,不同體積的0.02 mmoL/L CuSO4溶液、0.02 mmoL/L HDTMA溶液以及磷酸緩沖溶液,搖勻定容,靜置幾分鐘后,以蒸餾水作空白,在607 nm下測(cè)定吸光值。每組平行測(cè)3次,取平均值繪制曲線。分別考察反應(yīng)條件為CAS溶液2.0 mL、HDTMA溶液4.0 mL、磷酸緩沖溶液0.5 mL、反應(yīng)時(shí)間15 min時(shí),CuSO4溶液添加量(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL)對(duì)CAS絡(luò)合體系的影響;反應(yīng)條件為CAS溶液2.0 mL、CuSO4溶液1.2 mL、磷酸緩沖溶液0.5 mL、反應(yīng)時(shí)間15 min時(shí),HDTMA溶液添加量(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL)對(duì)CAS絡(luò)合體系的影響;反應(yīng)條件為CAS溶液2.0 mL、CuSO4溶液1.2 mL、HDTMA 4.0 mL、反應(yīng)時(shí)間15 min時(shí),磷酸緩沖液添加量(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL)對(duì)CAS絡(luò)合體系的影響;以及反應(yīng)條件為CAS溶液2.0 mL、CuSO4溶液1.2 mL、HDTMA溶液4.0 mL、磷酸緩沖溶液2.0 mL時(shí),絡(luò)合時(shí)間(5、10、15、20、25、30 min)對(duì)CAS絡(luò)合體系的影響。

1.2.4 CAS法檢測(cè)Mb含量

1.2.4.1 Mb含量的測(cè)定 取7支試管并進(jìn)行編號(hào),按CAS:HDTMA:CuSO4體積比為1.0∶8.0∶0.7的比例配制100 mL C液,分別向試管中加入9 mL C液及1 mL 1.2.1中的凍干粉溶液和蒸餾水混合液,其凍干粉溶液的添加量依次為0.0、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL,以1號(hào)為空白在607 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,每組平行測(cè)3次,取平均值繪制曲線。通過(guò)在含有2.0 mL 0.02 mmoL/L CAS溶液、1.2 mL 0.02 mmoL/L CuSO4溶液、4.0 mL 0.02 mmoL/L HDTMA溶液、2.0 mL磷酸緩沖溶液的反應(yīng)體系中,依次加入不同體積的0.01 moL/L EDTA溶液,于607 nm紫外吸收波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光值[12]。此操作平行3次,計(jì)算平均值。

1.2.4.2 Mb含量的計(jì)算 取8個(gè)25 mL容量瓶,分別用移液管移取2.0 mL 0.02 mmoL/L CAS溶液、1.2 mL 0.02 mmoL/L CuSO4溶液、4.0 mL 0.02 mmoL/L HDTMA溶液、2.0 mL磷酸緩沖溶液置于容量瓶中,然后依次加入0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.0 mL的0.01 moL/L EDTA溶液,搖勻定容,靜置15 min后,以蒸餾水作空白,在607 nm下測(cè)定吸光值。平行測(cè)3次,取平均值繪制EDTA工作曲線,根據(jù)EDTA工作曲線y=-0.0447x+0.0738,r=0.9895,求出Mb對(duì)EDTA的當(dāng)量濃度(μmoL·mL-1),由公式[13-16]求出1 L發(fā)酵液中的Mb含量。Mb含量計(jì)算公式為:

Mb含量(μmoL/250 mL)=EDTA當(dāng)量濃度×25×2.5

1.2.5 HPLC法檢測(cè)Mb含量

1.2.5.1 HPLC法的檢測(cè)條件 色譜柱:C18XDB(4.6 mm×150 mm,5 μm);檢測(cè)器:二極管陣列檢測(cè)器;柱溫:30 ℃;流速:0.4 mL/min;流動(dòng)相:A為去離子水,B為100%乙腈;采用梯度洗脫,0～2 min 100%～88% A、2～5 min 88%～75% A、5～11 min 75%～68% A、11～15 min 68%～50% A、15～25 min 50%～0% A運(yùn)行25 min;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5.2 HPLC法檢測(cè)Mb含量 取10 μL發(fā)酵液純化獲得Mb干粉樣液于高效液相色譜儀中檢測(cè),結(jié)合三維液相色譜圖與紫外光譜圖確定Mb的出峰位置。取0.5 mg的OB3b Mb凍干粉加入蒸餾水配成1 mL干粉溶液,在高效液相色譜儀中進(jìn)樣1 μL濃度分別為2.5×10-3、5×10-3、7.5×10-3、1×10-2、1.25×10-2、1.5×10-2g/mL的凍干粉溶液進(jìn)行檢測(cè),得到不同含量Mb的液相色譜圖,獲得相應(yīng)保留時(shí)間內(nèi)各Mb含量對(duì)應(yīng)的峰面積,繪制出峰面積與Mb含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每24 h對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行提取,于高效液相色譜儀下進(jìn)行檢測(cè),得到不同時(shí)間段下的Mb液相分析圖后,利用線性關(guān)系,得到相應(yīng)的Mb含量,考察M.trichosporiumOB3b代謝Mb的日含量變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 光譜分析Mb及CAS法測(cè)定的依據(jù)

2.1.1 紫外光譜分析Mb發(fā)酵程度 對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的Mb每24 h進(jìn)行分離純化提取,以蒸餾水為空白,在200～700 nm波長(zhǎng)下掃描的紫外吸收光譜如圖1所示。由圖1可知,發(fā)酵24 h的Mb只在290 nm處有一個(gè)特征峰;發(fā)酵48 h在290 nm處有一個(gè)特征峰;發(fā)酵72 h在290、340 nm處有兩個(gè)特征峰;發(fā)酵96 h在290、340、390 nm有三個(gè)特征峰;發(fā)酵120 h在290、340、390 nm有三個(gè)特征峰。根據(jù)文獻(xiàn)[11]可知與Cu2+結(jié)合的咪唑基團(tuán)在340、390 nm處產(chǎn)生。由此可見(jiàn)Mb只有發(fā)酵72 h后才有與Cu結(jié)合的咪唑基團(tuán),發(fā)酵96 h后的Mb較為成熟。

圖1 Mb紫外光譜圖Fig.1 Mb ultraviolet spectrum

2.1.2 排除其他小肽對(duì)檢測(cè)方法的影響 由圖2可知,兩種混合體系在400 nm以后幾乎是重合的,在不加 CuSO4的情況下,加Mb體系與不加Mb體系在607 nm處均無(wú)特征吸收峰,說(shuō)明MethylosinustrichosporiumOB3b向發(fā)酵液中分泌的多種小肽并不會(huì)影響Mb的紫外檢測(cè)結(jié)果,故排除發(fā)酵液中雜蛋白的干擾。

圖2 無(wú)銅CAS體系添加Mb的紫外光譜Fig.2 UV spectrum of Mb added to copper-free CAS system

2.1.3 Mb紫外光譜的檢測(cè) 由圖3可以看出,Mb紫外-可見(jiàn)光譜圖中有三處吸收峰,分別為290、340、394 nm,這與文獻(xiàn)報(bào)道的Mb的結(jié)構(gòu)[17]一致。當(dāng)加入Cu2+后,340 nm的4-羥基-5-亞硫酰咪唑基團(tuán)以及394 nm的硫酰咪唑基團(tuán)的特征峰均下降,表明純化后的Mb具有4-羥基-5-亞硫酰咪唑基團(tuán)和硫酰咪唑基團(tuán),且Cu2+與Mb的咪唑酮環(huán)發(fā)生了配位結(jié)合。

圖3 Mb及Mb-Cu紫外光譜Fig.3 UV spectrum of Mb and Mb-Cu

2.1.4 Mb奪取CAS體系中Cu2+的證明 CAS+HDTMA、CAS+HDTMA+CuSO4、CAS+HDTMA+CuSO4+EDTA、CAS+HDTMA+CuSO4+Mb四種組合方式的混合體系在200～700 nm波長(zhǎng)下掃描得到的紫外吸收光譜結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,CAS溶液與CuSO4溶液形成的絡(luò)合體系在加入Mb和EDTA后,607 nm附近的吸收峰均有所降低,表明Mb與EDTA相同,均能夠奪取絡(luò)合物CAS-Cu中的Cu2+,從而具有降低特征吸收峰的作用[18]。因此利用鉻天青法檢測(cè)Mb含量可行。

圖4 四種反應(yīng)體系的紫外光譜Fig.4 UV spectrum of four reaction systems

2.2 CAS法檢測(cè)條件的優(yōu)化

2.2.1 CuSO4溶液添加量對(duì)CAS體系的影響 由圖5可知,絡(luò)合體系的吸光值會(huì)隨著CuSO4溶液的添加量逐漸增加,一定量后達(dá)到最大值。在0～1.2 mL時(shí)絡(luò)合體系的吸光值逐漸上升。當(dāng)CuSO4的添加量為1.2 mL時(shí),吸光度達(dá)到最大值,說(shuō)明體系中有足夠的Cu2+發(fā)生反應(yīng)。繼續(xù)添加CuSO4溶液,吸光度呈下降趨勢(shì),使得溶液中含有多余游離Cu2+而不利于工作曲線及Mb的測(cè)定。因此選取CuSO4溶液的添加量為1.2 mL。

圖5 CuSO4溶液添加量對(duì)CAS體系的影響Fig.5 Effect of addition of CuSO4 solution on CAS system

2.2.2 HDTMA溶液添加量對(duì)CAS體系的影響 由圖6可知,隨著HDTMA由1 mL增加至4 mL時(shí),絡(luò)合體系的吸光值上升明顯,而當(dāng)HDTMA添加量高于4.0 mL后,吸光值趨于穩(wěn)定,這表明HDTMA溶液添加量為4.0 mL時(shí),對(duì)整個(gè)體系的增色效果達(dá)到最大。因此選取HDTMA溶液的添加量為4 mL。

圖6 HDTMA溶液添加量CAS體系的影響Fig.6 Effect of addition of HDTMA solution on CAS system

2.2.3 磷酸緩沖溶液添加量對(duì)CAS體系的影響 由圖7可知,添加不同體積的磷酸緩沖溶液,其絡(luò)合體系對(duì)應(yīng)的吸光度值接近,表明磷酸緩沖液對(duì)于反應(yīng)體系影響不明顯。在0～2 mL時(shí),絡(luò)合體系的吸光值有小幅度的上升,當(dāng)添加量超過(guò)2.0 mL時(shí),吸光值趨于平穩(wěn),這表明磷酸緩沖溶液添加量為2.0 mL時(shí),絡(luò)合體系的穩(wěn)定性較好。因此選取磷酸緩沖溶液的添加量為2.0 mL。

圖7 磷酸緩沖溶液添加量對(duì)CAS體系的影響Fig.7 Effect of addition of phosphate buffer solution on CAS system

2.2.4 絡(luò)合時(shí)間對(duì)CAS體系的影響 由圖8所示,CAS與CuSO4絡(luò)合時(shí)間在0～15 min波動(dòng)明顯。當(dāng)絡(luò)合體系形成時(shí)間大于15 min時(shí),體系吸光度稍有下降并處于穩(wěn)定,表明絡(luò)合時(shí)間為15 min時(shí)反應(yīng)完全,絡(luò)合體系達(dá)到穩(wěn)定。因此選取反應(yīng)時(shí)間為15 min。

圖8 絡(luò)合時(shí)間對(duì)CAS體系的影響 Fig.8 Effect of complexation time on CAS system

2.3 CAS法對(duì)Mb含量的檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 CAS法對(duì)Mb含量線性關(guān)系的測(cè)定 按0.1 mmol/L CAS:0.1 mmol/L HDTMA:0.1 mmol/L CuSO4體積比為1.0∶8.0∶0.7的比例配成CAS絡(luò)合體系,加入不同濃度的Mb凍干粉溶液后,在607 nm吸收波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光值如圖9所示。

圖9 Mb含量與吸光值的線性關(guān)系 Fig.9 Linear relationship between Mb content and absorbance

從圖9可以看出,在含有Mb的CAS-Cu絡(luò)合體系中,Mb的濃度與反應(yīng)體系的吸光度同EDTA與吸光度的關(guān)系(y=-0.0447x+0.0738,r=0.9895)相似,均呈線性關(guān)系,且其線性方程為y=-0.0042x+0.1232,其中r值為0.9495,線性關(guān)系可靠。因此可通過(guò)EDTA的工作曲線求得Mb的EDTA當(dāng)量濃度,進(jìn)而求得發(fā)酵液中的Mb含量。

2.3.2 CAS法對(duì)發(fā)酵液中Mb含量的測(cè)定 將2.0 mL發(fā)酵液純化的Mb樣液加入到由2.0 mL 0.02 mmoL/L CAS溶液、1.2 mL 0.02 mmoL/L CuSO4溶液、4.0 mL 0.02 mmoL/L HDTMA溶液、2.0 mL磷酸緩沖溶液配成的絡(luò)合體系中,靜置15 min后于607 nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光值,此操作平行3次,求出的Mb含量如表1所示。表1表明 OB3b 1 L發(fā)酵液當(dāng)中Mb的含量為26.91 μmoL,并且其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%,重現(xiàn)性較好。

表1 Mb含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of Mb content

2.3.3 Mb含量最低檢測(cè)限的測(cè)定 將1 mL的Mb樣液稀釋后,加入到由2.0 mL 0.1 mmoL/L CAS溶液、1.2 mL 0.02 mmoL/L CuSO4溶液、4.0 mL 0.1 mmoL/L HDTMA溶液、2.0 mL磷酸緩沖溶液配成的絡(luò)合體系中,靜置15 min后于607 nm波長(zhǎng)下測(cè)得吸光值,此操作平行3次,求出Mb含量如表2所示。由表2可知,通過(guò)CAS法檢測(cè)OB3b 1 L發(fā)酵液當(dāng)中Mb最低含量為稀釋50倍后的濃度值,最低檢測(cè)限為0.042 μmoL/L,并且其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5%,重現(xiàn)性較好。

表2 Mb含量最低檢測(cè)限Table 2 Minimum detection limit of Mb

2.4 HPLC法對(duì)Mb含量的檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 HPLC法檢測(cè)Mb的定性分析 10 μL發(fā)酵液純化的Mb樣液的高效液相色譜圖及3D液相色譜圖如圖10、圖11所示。由圖10可以看出,在保留時(shí)間為10.843 min出現(xiàn)的吸收峰與在圖11在同一保留時(shí)間出峰位置相對(duì)應(yīng),說(shuō)明為同一種物質(zhì),且由圖11中可以看出,保留時(shí)間為10.843 min出現(xiàn)的吸收峰分別出現(xiàn)在275、340、394 nm,再結(jié)合2.1.3中的紫外光譜圖當(dāng)中Mb的特征峰出峰位置,分析證實(shí)保留時(shí)間10.843 min處的吸收峰為Mb。

圖11 Mb三維液相色譜圖Fig.11 Mb three-dimensional liquid chromatogram

圖10 Mb高效液相色譜圖Fig.10 High performance liquid chromatogram of Mb

2.4.2 HPLC檢測(cè)Mb的定量分析 將經(jīng)CAS法檢測(cè)獲得Mb含量為83.33 μmoL的凍干粉制成1 mL干粉溶液,在高效液相色譜儀中進(jìn)樣1 μL濃度分別為2.5×10-3、5×10-3、7.5×10-3、1×10-2、1.25×10-2、1.5×10-2g/mL進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)繪制出的峰面積與Mb含量的線性關(guān)系曲線,線性方程為y=10.5251x+4.4038,r值為0.9998,線性關(guān)系可靠。

將20 μL 24 h間隔下取出的250 mL發(fā)酵液的Mb樣液于高效液相色譜儀下進(jìn)行檢測(cè),得到不同時(shí)間段下Mb保留時(shí)間內(nèi)的峰面積,將其代入到峰面積與Mb含量的線性關(guān)系中,得到發(fā)酵液中的Mb日含量如表3所示。由表3可知,24、48 h下測(cè)得的Mb含量為1.008、1.336 μmoL·250 mL-1,表明在培養(yǎng)前期,MethylosinustrichosporiumOB3b分泌出的Mb含量極低;72～96 h時(shí)間段內(nèi),得到250 mL發(fā)酵液當(dāng)中的Mb含量分別為3.125、7.500 μmoL,OB3b培養(yǎng)后期分泌的Mb含量明顯增加,每個(gè)時(shí)間段樣品重復(fù)測(cè)定3次,由標(biāo)準(zhǔn)差SD和RSD的結(jié)果分析可知,重現(xiàn)性良好。

表3 甲烷氧化菌不同培養(yǎng)時(shí)間段下分泌的Mb含量Table 3 Mb content secreted by methane oxidizing bacteria at different culture time

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)MethylosinustrichosporiumOB3b的Mb的紫外光譜圖與三維液相色譜圖的結(jié)合分析,證明發(fā)酵液中Mb具有硫酰咪唑基團(tuán)及酪氨酸活性基團(tuán),并結(jié)合色譜分析時(shí)的出峰位置獲得了利用CAS方法結(jié)合HPLC方法測(cè)定Mb的依據(jù)。通過(guò)優(yōu)化后的CAS分光光度法(各試劑的添加量為0.02 mmoL/L CAS溶液2.0 mL、0.02 mmoL/L CuSO4溶液1.2 mL、0.02 mmoL/L HDTMA溶液的添加量4.0 mL、磷酸緩沖液2.0 mL、絡(luò)合時(shí)間為15 min)測(cè)定了1 L發(fā)酵液當(dāng)中Mb的含量為26.91 μmoL;通過(guò)CAS法檢測(cè)OB3b 1 L發(fā)酵液當(dāng)中Mb最低含量為稀釋50倍后的濃度值,最低檢測(cè)限為0.042 μmoL/L,重現(xiàn)性較好。在此基礎(chǔ)上結(jié)合HPLC法實(shí)現(xiàn)了對(duì)發(fā)酵液中Mb含量的周期監(jiān)測(cè),在發(fā)酵24、48、72、96 h時(shí)發(fā)酵液中Mb含量分別為1.008、1.336、3.125、7.500 μmoL/250 mL。本文對(duì)前人所述方法進(jìn)行了進(jìn)一步的改進(jìn),精密度和方法的穩(wěn)定性都有所提高,為Mb的發(fā)酵、生產(chǎn)和應(yīng)用提供依據(jù)。