甜瓜粉霉病病原菌鑒定及三種藥物對病原菌的體外抑制作用

范春霞,王軍節(jié),*,彭期定,王 鵬

(1.北方民族大學(xué)植物性農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,寧夏銀川 750021; 2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,寧夏銀川 750021)

玉金香甜瓜(CucumismeloL.cv.Yujinxiang)是我國西北地區(qū)主要栽培的經(jīng)濟(jì)作物,因其果實(shí)口感脆甜而深受廣大消費(fèi)者喜愛[1]。甜瓜果實(shí)采收期較為集中且正值夏季高溫,并且貯運(yùn)過程冷鏈缺乏或不完整,釆后流通各環(huán)節(jié)極易因遭受病菌侵染而腐爛變質(zhì),給當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶和經(jīng)銷商帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。研究表明黑霉、青霉、白霉和粉霉是造成該果采后主要的真菌病害,且由粉霉造成的粉霉病最為嚴(yán)重[3]。因此,研究玉金香甜瓜粉霉病的控制措施十分必要。

病原鑒定是病害防治的前提與基礎(chǔ),形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定是目前病原真菌鑒定的主要手段。殷輝等[4]采用形態(tài)學(xué)特征及ITS序列特征分析,確定引起棗貯藏期粉霉病的致病菌為粉紅單端孢。王勇等[5]對番茄粉霉病的致病菌進(jìn)行了鑒定,確定為粉紅單端孢。

化學(xué)殺菌劑如嘧菌酯雖能有效控制果蔬采后病害,但因存在藥物殘留、環(huán)境污染及病原物抗藥性等問題而應(yīng)用受限[4,6]。因此,開發(fā)綠色安全環(huán)保的措施已成為病害控制主要方向。植物精油和天然公認(rèn)的安全藥物成為研究熱點(diǎn),月桂酸是椰子、油棕等精油的主要成分之一,其對番茄葉霉病具有控制效果[7],富饒等[7]研究發(fā)現(xiàn):月桂酸對番茄葉霉菌菌絲均具有抑制作用,濃度為1 mmol/L時(shí)抑菌效果最好;香芹酚為牛至、石香蕾、百里香等植物精油的主要成分之一,對桔子青霉[8]、面包酵母和黑曲霉[9]具有抑制效果,王新偉等[9]發(fā)現(xiàn):香芹酚濃度為0.125 μL/mL時(shí)可抑制面包酵母的生長,濃度為0.0625 μL/mL時(shí)可抑制黑曲霉的生長;硅酸鉀具有控制指狀青霉、意大利青霉[10]和腐霉菌[11]等病原引起果實(shí)采后病害的潛力,Kaiser等[11]研究表明:硅酸鉀的濃度為40 mL/L及更高時(shí)可達(dá)到抑制腐霉菌的效果。

然而,月桂酸、香芹酚和硅酸鉀對甜瓜粉霉病菌控制效果研究和有關(guān)玉金香甜瓜果實(shí)粉霉病病原鑒定的研究鮮有報(bào)道。本研究首先對玉金香甜瓜果實(shí)粉霉病菌進(jìn)行分離純化,并通過孢子和群體形態(tài)觀察以及分子生物學(xué)方法進(jìn)行病原菌菌種鑒定。以化學(xué)殺菌劑嘧菌酯為陽性對照,通過月桂酸、香芹酚和硅酸鉀三種藥物對粉霉病病原菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn),以期探明三種藥物對甜瓜粉霉病菌抑菌效果。旨在為篩選控制甜瓜粉霉病的新型安全藥物提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

自然發(fā)粉霉病的玉金香甜瓜果實(shí) 寧夏中衛(wèi)市興仁鎮(zhèn)甜瓜種植農(nóng)田;月桂酸(99.5%)、硅酸鉀 上海麥克林生化科技有限公司;香芹酚(98.0%) 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

HPS-250生化培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;B1-220A雙筒生物顯微鏡、BA210-T生物顯微鏡 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司;Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀 北京九宇金泰生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌的分離純化 參照馬文平等[12]方法略作修改。取有典型病害癥狀的甜瓜,無菌刀片切取病健交界處的組織(5 mm×5 mm),無菌超凈工作臺上依次在70%的酒精中浸洗3～5 s,0.1%的升汞中消毒30～45 s,然后用無菌水連續(xù)漂洗3次去除殘余升汞,滅菌的吸水紙吸去多余的水分后放在事先備好的PDA平板上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。用無菌水配制孢子懸浮液,稀釋至每滴溶液中含有2～3個孢子。將配制的孢子懸浮液取10 μL于PDA培養(yǎng)基進(jìn)行涂布,28 ℃條件培養(yǎng)2～3 d至單個菌落長出,再用打孔器取單個菌落于新的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),即可獲得純化的菌株(LC-1701)。隨后將分離純化的菌株在 PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d,加入含0.05% Tween-80 的無菌水10 mL,無菌紗布過濾,制成106個/mL孢子懸浮液,回接至健康的甜瓜果實(shí),每個果實(shí)赤道部位用滅菌鐵釘刺破果面，形成四個直徑為5 mm、深為2 mm的接種點(diǎn),接入10 μL配制好的孢子懸浮液,并用無菌水作對照。將對照與各處理均放入塑料框中,外套PE袋,室溫(25±2) ℃培養(yǎng),每個處理8～10個果實(shí),觀察其發(fā)病情況。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 參考真菌鑒定手冊等工具書[13-16],以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,在28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d連續(xù)觀察菌落形態(tài)變化特征,記錄菌落表面的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及培養(yǎng)過程中菌落大小、顏色變化。并觀察有無分生孢子的產(chǎn)生以及分生孢子形態(tài)及產(chǎn)生方式、產(chǎn)孢梗的形態(tài)特征,對分離得到的菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 將純化后的菌株于PDA培養(yǎng)基28 ℃條件下恒溫培養(yǎng)7 d,加入10 mL無菌水在無菌環(huán)境下刮取菌絲,按照DNA提取試劑盒說明書步驟提取真菌基因組DNA,并對 rDNA-ITS 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,擴(kuò)增引物為通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(3′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-5′),引物均由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司合成。20 μL反應(yīng)體系:10×Ex Taq buffer 2.0 μL,5 U Ex Tap 0.2 μL,2.5 mmol/L dNTP Mix 1.6 μL,上下游引物各1.0 μL,模板DNA 0.5 μL,加ddH2O補(bǔ)至20 μL。PCR擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共25個循環(huán);72 ℃充分延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST程序與已知序列進(jìn)行比對分析,應(yīng)用ClustalX 2.1軟件進(jìn)行ITS序列對比,并利用MEGA 5.0軟件以鄰接法(NJ)構(gòu)建基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹,各分支置信度進(jìn)行1000次重復(fù)分析。

1.2.3 藥物處理對T.roseum菌絲生長的抑制作用 參照徐俊光[17]和李燦嬰等[18]方法略作修改。以硅酸鉀為例,其它兩種藥物及陽性對照嘧菌酯的方法相同。將濃度分別為 0.50、1.00、1.50和2.00 g/L的硅酸鉀(香芹酚濃度分別為0.02、0.04、0.06和0.08 g/L;月桂酸濃度分別為0.04、0.08、0.12和0.16 g/L;嘧菌酯濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 g/L)加入已滅菌并冷卻至 60 ℃的PDA培養(yǎng)基中。再取直徑為0.30 cm的菌餅,將菌餅放置于凝固后的培養(yǎng)基中央,于28 ℃避光條件培養(yǎng)。以不加任何藥物的PDA培養(yǎng)基為空白對照,待空白對照菌落擴(kuò)展至培養(yǎng)皿邊緣時(shí)觀察結(jié)果,采用十字交叉法測出菌落直徑[6]。按公式(1)計(jì)算抑菌率。以抑制率轉(zhuǎn)化為概率幾率作為縱坐標(biāo)(y),濃度轉(zhuǎn)化為濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)(x)做毒力回歸方程,通過方程計(jì)算得到EC50,即抑制中濃度。

式(1)

1.2.4 藥物處理對T.roseum孢子萌發(fā)的抑制作用 參照李大強(qiáng)[19]方法略作修改。以硅酸鉀為例,其它兩種藥物及陽性對照的方法相同。硅酸鉀(香芹酚、月桂酸)分別加入含4 mL PDB培養(yǎng)基的試管中,使其最終濃度分別為0.50、1.00、1.50和2.00 g/L(香芹酚最終濃度分別為0.02、0.04、0.06和0.08 g/L,月桂酸最終濃度分別為0.04、0.08、0.12和0.16 g/L;嘧菌酯濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.8 g/L)，再加入400 μL振蕩均勻的濃度為 1×106個/mL 的孢子懸浮液,于28 ℃搖床培養(yǎng)(200 r/min)15 h后,統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)數(shù),方法參照李燦嬰等[18]的方法。每處理各重復(fù)隨機(jī)觀察3個以上視野,每個視野數(shù)200個孢子,重復(fù)3 次。以不添加藥物但加入400 μL孢子懸浮液的PDB培養(yǎng)基為空白對照組,根據(jù)公式(2)和(3)分別計(jì)算孢子萌發(fā)率及孢子萌發(fā)抑制率。以抑制率轉(zhuǎn)化為概率幾率作為縱坐標(biāo)(y),濃度轉(zhuǎn)化為濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)(x)做毒力回歸方程,通過方程計(jì)算得到EC50。

式(2)

孢子萌發(fā)抑制率(%)=1-孢子萌發(fā)數(shù)

式(3)

1.2.5 最小抑菌濃度(MIC)的測定 參照陶翠等[20]方法略作修改。采用試管倍比稀釋法,以硅酸鉀為例,另外兩種藥物方法相同。將2 mL 4.00 g/L的硅酸鉀(香芹酚0.16 g/L、月桂酸0.32 g/L、嘧菌酯0.8 g/L)的藥液置于1號試管中,再吸取2 mL最高濃度(4.00 g/L)藥液于試管2號加2 mL稀釋液,從2號試管吸取2 mL稀釋液到試管3,以此類推,直到稀釋到第10管,最后每根試管加入2 mL 105個/mL的孢子懸浮液,第11管為生長對照組(加菌不加藥物),第12管為空白對照管(僅含培養(yǎng)基)。將各試管置于28 ℃(200 r/min)培養(yǎng)7 d,在不攪動的情況下肉眼判斷,溶液清晰透明視為真菌完全不生長,取完全不生長管的最低藥物濃度為MIC。

1.2.6 動態(tài)抑菌試驗(yàn) 參照熊駿等[21]方法并略作修改,取若干的干燥無菌試管于超凈工作臺中,加入經(jīng)滅菌的察氏培養(yǎng)基5 mL,然后加入不同體積的母液藥物配制成含硅酸鉀(0.50、1.00、1.50和2.00 g/L);香芹酚(0.02、0.04、0.06和0.08 g/L);月桂酸(0.04、0.08、0.12和0.16 g/L);嘧菌酯濃度(0.1、0.2、0.4和0.8 g/L)的察氏培養(yǎng)基,再加入200 μL的濃度為106個/mL的孢子懸浮液,無菌橡膠塞好管口做好標(biāo)記。以加入200 μL 106個/mL菌懸液的察氏培養(yǎng)基作為空白對照,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩(200 r/min)培養(yǎng),每隔1 d用分光光度計(jì)在λ=505 nm測定吸光值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)測定3次,取平均值。以吸光值為縱坐標(biāo),培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制動態(tài)抑菌曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差或進(jìn)行Duncan’s多重差異顯著性分析,p<0.05時(shí)為差異顯著。實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用M±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的鑒定

2.1.1 病原菌的形態(tài)學(xué)特征及致病性 粉霉病是甜瓜采后常見的病害之一,自然發(fā)病癥狀如圖1A所示,發(fā)病初期呈圓形或者橢圓形白色絮狀霉點(diǎn),后期形成厚重的粉色霉層。將分離純化得到的病原菌在PDA 培養(yǎng)基培養(yǎng),菌落初呈白色、粉狀或絮狀,后逐漸變成粉紅色(圖1B),背面呈米黃色(圖1C)。分生孢子梗(圖1D)無色、直立、不分枝,頂端稍膨大。分生孢子(圖1E)頂生,倒洋梨形,1個隔膜、隔膜處稍縊縮,著生痕在分生孢子基端或其一側(cè)。回接病原菌3 d后甜瓜果實(shí)表面出現(xiàn)明顯癥狀(圖1F),進(jìn)一步分離純化得到的病原與之前接種的病菌一致,符合科赫法則[12],證明該菌株(LC-1701)為致病菌。

圖1 粉霉病發(fā)病癥狀及LC-1701形態(tài)Fig.1 Symptoms of pink rot and morphology of LC-1701

2.1.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定 將該病原菌的ITS區(qū)測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對,從Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中搜索相似度達(dá)90%以上的同源序列,通過MEGA 5.05軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、致病性測定及分子鑒定,確定引起甜瓜粉霉病的病原為粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)。

圖2 LC-1701系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of LC-1701

2.2 藥物處理對T.roseum菌絲生長的抑制效果

三種藥物對T.roseum菌落直徑擴(kuò)展的影響如表1所示。由表1可知三種藥物處理對于病原菌T.roseum的菌落直徑均有抑制作用,且隨著濃度的增長,三種藥物的抑制率也隨之增長:硅酸鉀KSI濃度為2.00 g/L時(shí),抑制率為65.94%;香芹酚Xq濃度為0.08 g/L,抑制率為68.60%;月桂酸LA濃度為0.16 g/L,抑制率就達(dá)到80.41%。但是三種藥物與陽性對照嘧菌酯相比,抑菌率均偏低,其中月桂酸的抑菌率最接近于嘧菌酯的抑菌率。三種藥物的最大濃度抑制效果總體趨勢為LA>Xq>KSI。

表1 不同藥物濃度對T.roseum生長的影響Table 1 Effect of different chemical concentrations on the growth of T. roseum

三種藥物濃度對數(shù)與病原真菌T.roseum的抑制率轉(zhuǎn)化概率之間存在著一定的線性關(guān)系,線性方程如表2所示。從表2中可以看出決定系數(shù)R2均大于0.90,表明線性相關(guān)性良好。EC50數(shù)值的大小可以反映藥劑對菌絲的毒性大小,數(shù)值越小表示毒性越強(qiáng)。三種藥物中對于致病真菌菌絲的毒性均低于陽性對照嘧菌酯,其中香芹酚對致病真菌菌絲的毒性最接近陽性對照嘧菌酯,且三種藥物對T.roseum毒性由強(qiáng)弱為Xq>LA>KSI。

表2 不同藥物對T.roseum菌絲生長的抑制作用Table 2 Inhibition of different chemicals on the hyphae growth of T. roseum

2.3 藥物處理對T.roseum孢子萌發(fā)的抑制效果

三種藥物對T.roseum孢子萌發(fā)的影響如表3所示。從表3可知,三種藥物對T.roseum孢子萌發(fā)抑制率隨著藥物濃度的提高而增大。KSI濃度為2.00 g/L(Xq濃度為0.08 g/L,LA濃度為0.16 g/L)時(shí),對孢子萌發(fā)抑制率分別為:61.24%(70.04%、77.53%),但是三種藥物與陽性對照嘧菌酯相比,對T.roseum孢子萌發(fā)的抑菌率均偏低,其中月桂酸的抑菌率最接近于陽性對照嘧菌酯的抑菌率。三種藥物的最大濃度抑制效果總體趨勢為LA>Xq>KSI,該結(jié)果與三種藥物對T.roseum菌絲生長的抑制效果結(jié)果一致。

表3 不同濃度藥物對T.roseum孢子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different concentrations of chemical on the spore germination of T. roseum

三種藥物濃度對數(shù)與病原真菌T.roseum的抑制率轉(zhuǎn)化概率之間存在著一定的線性關(guān)系,線性方程如表4所示。毒力回歸方程直線斜率可以反映病原菌對藥劑的敏感性,斜率越大表明敏感性越強(qiáng)。由表4的數(shù)據(jù)可得T.roseum對于三種藥物的敏感程度均強(qiáng)于陽性對照嘧菌酯,T.roseum對于三種藥物的敏感程度由強(qiáng)至弱依次為Xq>KSI>LA。

表4 不同藥物對T.roseum孢子萌發(fā)的抑制作用Table 4 Inhibition of different chemicals on the spore germination of T.roseum

2.4 最小抑菌濃度(MIC)

MIC表示最小抑菌藥物濃度,數(shù)值越小,表明T.roseum對于該藥物越敏感。由表5可得出,KSI、Xq和LA三種藥物的MIC分別為1.50、0.08和0.12 g/L,說明T.roseum對Xq和AZX最敏感,LA次之,KSI最不敏感。

表5 不同藥物的最小的抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration of different chemicals

2.5 三種藥物的動態(tài)抑制效果

由圖3可知,三種藥物在不同時(shí)間段與對照組吸光值相差較大。隨著時(shí)間的增加,含藥培養(yǎng)基與CK的OD505值均在增加,培養(yǎng)時(shí)間為1～2 d時(shí),OD505值顯著增加(p<0.05),2 d后OD505值均趨于穩(wěn)態(tài)。培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí),各含藥培養(yǎng)基與CK相比,OD505值沒有顯著差異。而從2 d開始,含藥培養(yǎng)基與CK的吸光度值出現(xiàn)明顯差異,CK的OD505值顯著大于三種含藥培養(yǎng)基的OD505值(p<0.05),說明培養(yǎng)2 d開始,三種藥物均對病原菌T.roseum產(chǎn)生抑制作用。

圖3 不同藥物處理對T.roseum吸光度的影響Fig.3 Effect of different chemicals treatments on the absorbance of T. roseum注:同一時(shí)間標(biāo)有不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)。

3 討論與結(jié)論

采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法,確定了引起玉金香甜瓜粉霉病的病原菌為T.roseum。該結(jié)果與梨[22]、葡萄[23]、番茄[24-25]、菜豆[26]和辣椒[27]等果蔬發(fā)生粉霉病害的病原菌鑒定結(jié)果一致。形態(tài)學(xué)鑒定中該菌的形態(tài)特征與龍眼[28]和番茄[29]紅粉病的病原菌的分生孢子形態(tài)特征基本一致。且發(fā)病癥狀與棗果實(shí)[4]和番茄果實(shí)[5]發(fā)病癥狀一致,均呈現(xiàn)前期為水浸狀斑,初期呈圓形或橢圓形的白色絮狀霉點(diǎn);后期形成較厚的粉狀霉層,嚴(yán)重時(shí)霉層密布整個果面,致使果實(shí)發(fā)硬、發(fā)苦。

硅酸鉀、月桂酸和香芹酚三種藥物對T.roseum的菌絲擴(kuò)展和孢子萌發(fā)均有明顯的抑制作用,且隨著藥物濃度的增加,抑菌效果增強(qiáng)。當(dāng)硅酸鉀在濃度為2.00 g/L對T.roseum的菌絲擴(kuò)展和孢子萌發(fā)抑制率分別為65.94%和61.24%;月桂酸0.08 g/L對T.roseum的菌絲擴(kuò)展和孢子萌發(fā)抑制率分別為68.60%和70.04%;0.16 g/L對T.roseum的菌絲擴(kuò)展和孢子萌發(fā)抑制率分別為80.41%和77.53%。該結(jié)果與富饒等[6]和王新偉等[8]研究結(jié)果一致。王毅等[30]研究發(fā)現(xiàn)硅酸鈉可通過直接抑菌和誘導(dǎo)果實(shí)抗性來抑制杏的粉霉病。牛黎莉等[31]發(fā)現(xiàn)硅酸鈉之所以能夠抑制T.roseum孢子萌發(fā)和菌落生長,其主要原因是硅酸根離子對其孢子結(jié)構(gòu)的破壞。蔣增良等[32]研究結(jié)果表明:月桂酸的衍生物月桂酸單甘油酯的抑菌機(jī)理主要是通過影響細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、代謝酶及蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)等細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)來實(shí)現(xiàn)。潘永梅[33]發(fā)現(xiàn)香芹酚能夠抑制由炭疽病菌引起的批把果實(shí)腐欄的原因是間接提高果實(shí)抗氧化能力和抗病性以及直接抑菌作用三方面協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。Ultee 等[34-35]研究結(jié)果表明,香芹酚可使微生物膜流動性增強(qiáng),導(dǎo)致質(zhì)子和鉀離子滲漏,致使膜電位崩潰以及ATP 的合成受到抑制。由此可知,硅酸鉀、月桂酸和香芹酚三種藥物具有控制甜瓜果實(shí)粉霉病的潛力,但其對果實(shí)的體內(nèi)作用效果以及抑菌機(jī)理均有待進(jìn)一步研究。

綜上可知,甜瓜粉霉病病原菌是T.roseum;硅酸鉀、月桂酸和香芹酚三種藥物對該菌均有體外抑制效果,且香芹酚抑菌效果最佳;三種藥物均具有控制甜瓜粉霉病的潛力。