賦形劑乳液粒徑和油脂鏈長對橘子中β-胡蘿卜素的物化特性及生物可給性的影響

劉 涵,袁 曦,劉曉娟,*,曹 庸

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642; 2.廣東省功能食品活性物重點實驗室,廣東廣州 510642; 3.廣東省天然活性物工程技術(shù)研究中心,廣東廣州 510642)

β-胡蘿卜素(C40H56)是橘黃色脂溶性類胡蘿卜素,是自然界中最普遍存在的天然色素。許多天然食物例如菠菜、胡蘿卜、橘子、木瓜、芒果等[1],皆含有豐富的β-胡蘿卜素。β-胡蘿卜素是維護人體健康不可缺少的營養(yǎng)素,具有抗癌、預(yù)防心血管疾病、白內(nèi)障及抗氧化等多種活性,可防止老化和衰老引起的多種退化性疾病[2]。但人體自身無法合成β-胡蘿卜素,主要通過攝入水果和蔬菜來獲得。雖然β-胡蘿卜素的食物來源廣泛,但由于其含有多個共軛雙鍵組成的四萜結(jié)構(gòu),具有較高的疏水性,在胃腸液中的溶解度較低,并且不易從植物組織中釋放,從而導(dǎo)致其生物利用率相對較低[3-5]。目前,已有一些提高人體對某些親脂性生物活性物質(zhì)的口服生物利用率的方法,例如以膳食補充劑或營養(yǎng)補充劑的形式來提高活性成分的攝入量,或者對活性成分結(jié)構(gòu)進行修飾,將親脂性活性成分提取純化后再進行包埋制成片劑、脂質(zhì)體、乳液等[6-9]。但是類胡蘿卜素這類親脂性成分從果蔬中分離提取有一定的局限性,有學(xué)者認為類胡蘿卜素存在于原有食物組分中一同被消化吸收可能具有更好的功效[4,10-13]。許多研究表明,添加油脂或富含油脂的食物可以提高果蔬類胡蘿卜素的生物利用率。Nidhi等[14]研究了不同脂肪酸組成及飽和度的植物油對葉黃素生物可給性的影響,葉黃素在橄欖油中的生物可給性最大。Hedr? N等[12]的研究表明,在綠葉蔬菜的烹飪過程中加入紅棕櫚油后,β-胡蘿卜素的生物可給性為無油脂樣品的2倍。

McClements等[15]在2014年首次提出運用賦形劑食品(Excipient food)來增加生物活性物質(zhì)的生物利用率。賦形劑乳液是賦形劑食品中最具發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用最廣泛的一種形式,能夠充分發(fā)揮日常膳食中生物活性物質(zhì)的潛在功效。賦形劑乳液的油脂類型、粒徑大小和界面特征等因素對于提升果蔬中類胡蘿卜素生物可給性具有很大影響。小粒徑賦形劑乳液通常有利于脂溶性活性物質(zhì)從組織中的釋放,從而提高其生物可給性[16],然而有些穩(wěn)定性較差的脂溶性活性物質(zhì)(如姜黃素等)過早地暴露在胃腸道容易發(fā)生降解,從而導(dǎo)致其活性降低[17]。由于不同鏈長油脂形成的混合膠束(Mixed micelles)大小不同,并且不同分子量大小和結(jié)構(gòu)(如親水基團和疏水基團)的親脂性活性成分會導(dǎo)致混合膠束對其的承載量存在差異,從而影響其生物可給性[18]。此外,存在于不同果蔬中的活性成分由于受到果蔬中其它物質(zhì)的干擾,其釋放程度不同也會影響生物可給性。因此,賦形劑乳液在提高特定食品中特定生物活性物質(zhì)生物可給性的有效性方面仍然需要進一步闡明。

本實驗以β-胡蘿卜素的主要膳食來源之一的橘子為原料,利用體外消化模型,探究賦形劑乳液的粒徑大小和油脂類型對橘子中β-胡蘿卜素的物化特性及生物可給性的影響,旨在為設(shè)計高效的賦形劑乳液以提高人體對膳食中的脂溶性物質(zhì)的生物利用率提供更多理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橘子、玉米油 廣州當(dāng)?shù)爻?中鏈甘油三酯(Medium chain triacylglycerol,MCT) 上海源葉生物科技有限公司;豬胃粘液素II型、胃蛋白酶、脂肪酶 美國Sigma-Aldrich貿(mào)易有限公司;糖苷酶、膽鹽、L-乳酸鈉、檸檬酸鉀 上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇、丙酮、正己烷、吐溫20等 均為國產(chǎn)分析純;四氫呋喃、二氯甲烷 國產(chǎn)色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙腈、甲醇 為色譜純,美國J. T. Baker公司。

AL104萬分之一電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DELTA320 pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DF-101S數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋 鞏義予華儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市英峪高科儀器廠;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;FD-1冷凍干燥機 北京博醫(yī)康技術(shù)公司;TGL-16G高速臺式離心機 上海安亭儀器廠;LC-15C分析高效液相色譜系統(tǒng) 日本島津公司;Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) Dikma Technologies;90 Plus動態(tài)光散射粒度分析儀 Brookhaven;CX41光學(xué)顯微鏡 Olympus;DL-55全自動電位滴定儀 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FJ200-S型高速分散均質(zhì)機 上海嫩谷機電設(shè)備有限公司;AH-BASIC高壓均質(zhì)機 ATS Engineering Incorporated。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同粒徑大小賦形劑乳液的制備 將一定濃度的吐溫20(1.0%,w/w)溶解于5 mmol/L pH7.0的PBS中,再將玉米油與水相溶液按照1∶9的重量比混合,用高速分散均質(zhì)機在10000 r/min下分散2 min(大粒徑乳液),然后用高壓均質(zhì)機分別在20 MPa均質(zhì)1次(中等粒徑乳液)、120 MPa下均質(zhì)5次(小粒徑乳液)。

1.2.2 不同鏈長油脂類型賦形劑乳液及對照組乳液的制備 選用MCT油為代表的中鏈油脂和玉米油為代表的長鏈油脂為油相,與水相按照1∶9的重量比混合,用高速分散均質(zhì)機在10000 r/min下分散2 min,最后用高壓均質(zhì)機在120 MPa下均質(zhì)5次。對照組乳液即用PBS磷酸緩沖溶液替代油脂,與水相混合,后續(xù)制備方法相同。

1.2.3 體外消化模型的構(gòu)建 標(biāo)準(zhǔn)靜態(tài)體外模擬消化的過程參考了Minekus等[19]的實驗程序并稍作修改,構(gòu)建了一個模擬消化道[20],主要包括模擬口腔、模擬胃、模擬小腸三個消化階段。橘子經(jīng)過剝皮、榨汁、抽濾后得到的橘子汁與稀釋乳液混合,使最終樣品中含油量為2%,將所得橘子/賦形劑乳液通過模擬體外消化。

模擬口腔消化階段:通過將粘蛋白(3 mg/mL)和各種鹽分散于水中制備模擬唾液(SSF),然后取預(yù)熱的20 mL橘子/賦形劑乳液樣品與20 mL模擬胃液(SSF)混合,并用NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH6.8。所得混合物在連續(xù)攪拌(100 r/min)下于37 ℃溫育10 min,得口腔消化樣品。

模擬胃消化階段:將2 g NaCl和7 mL HCl溶解在1 L水中,然后將0.064 g胃蛋白酶(酶活力:250 U/mg)分散到20 mL該溶液中,攪拌30 min來制備模擬胃液(SGF)。然后取20 mL模擬口腔消化后的樣品與20 mL模擬胃液混合,調(diào)節(jié)至pH2.5。將胃樣品置于37 ℃的恒溫搖床中以100 r/min連續(xù)旋轉(zhuǎn)2 h,得胃消化樣品。

模擬小腸消化階段:取30 mL模擬胃消化的樣品,調(diào)節(jié)至pH6.8～7.0,加入1.5 mL模擬腸液(CaCl2·2H2O 36.6 g/L和 NaCl 219 g/L溶于蒸餾水中)、3.5 mL膽鹽溶液(0.1875 g膽鹽溶液溶于3.5 mL PBS(5 mmol/L,pH7.0)中)。再次調(diào)節(jié)至pH7.0,加入2.5 mL脂肪酶溶液(含脂肪酶30 g/L,脂肪酶酶活力:100～400 U/mg)。然后采用pH-stat法,利用恒電位滴定儀不斷向體系中加入0.25 mol/L的NaOH溶液,使體系恒定保持在pH7.0,并記錄2 h內(nèi)消耗的NaOH溶液的量。在整個消化過程中,體系溫度維持在37 ℃,攪拌頭以50%的速度不斷均勻攪拌。

1.2.4 體外模擬消化過程中橘子/賦形劑乳液混合體系粒徑和電位的測量 采用90 PLUS動態(tài)光散射激光粒度儀,測定初始乳液和經(jīng)各階段消化后混合體系的顆粒大小(用表面積加權(quán)平均粒徑(d32)表示)、顆粒分布和ζ-電位。為避免多重光散射以及橘子組織對測量結(jié)果的干擾,對原始乳液及各階段消化液進行稀釋。測量溫度:25 ℃,檢測角度:90°,波長:658 nm。

1.2.5 模擬消化過程橘子/賦形劑乳液混合體系的微觀形態(tài)觀察 取一滴消化液至載玻片上,然后用蓋玻片從左至右輕輕蓋上,用滴管取一滴香柏油脂滴在蓋玻片觀察區(qū)域內(nèi),利用100倍油鏡觀察,選擇合適區(qū)域拍攝獲得顯微結(jié)構(gòu)圖像。

1.2.6 體外模擬小腸消化階段中橘子/賦形劑乳液混合體系的脂肪酸釋放速率測定 在模擬小腸消化階段中,乳液中的油脂在經(jīng)脂肪酶的作用分解成游離的脂肪酸。在水解過程中,溶液中不斷釋放H+,使體系的pH降低。利用pH-stat法[21],向溶液中不斷滴入NaOH,使溶液恒定pH為7.0,根據(jù)NaOH的消耗體積量,計算小腸消化過程中游離脂肪酸(Free fat acid,FFA)的釋放量。

式(1)

式中,VNaOH是消耗的NaOH的體積(L),mNaOH是用于滴定的NaOH的摩爾濃度(M),Wlipid是指小腸消化液中油脂的總質(zhì)量(g),Mlipid是指油脂的分子質(zhì)量(g·mol-1)。

1.2.7 體外模擬消化過程中不同階段的β-胡蘿卜素的提取 分別取一定體積的各階段消化液和膠束,加入正己烷:丙酮(1∶1,V/V)離心(4000 r/min,2 min)后提取上清液。整個提取過程在避光、低溫環(huán)境中進行。將多次萃取得到的上清液合并,25 ℃下旋蒸,將其濃縮至合適體積,經(jīng)過氮吹將有機溶劑揮發(fā)完畢后置于-20 ℃冷凍過夜,再將提取物經(jīng)-80 ℃冷凍干燥后于-20 ℃密封保藏直至分析[22]。

1.2.8 體外模擬消化過程中β-胡蘿卜素生物可給性的測定 橘子/賦形劑乳液混合體系經(jīng)體外模擬消化后,取小腸消化液高速離心(15000 r/min,4 ℃)50 min,收集上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾得到膠束相,進行HPLC色譜分析。HPLC液相色譜分析條件為:固定相:Diamonsil C18(2)色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相A:乙腈∶甲醇(95∶5,V/V);流動相B:乙腈∶甲醇∶四氫呋喃(60∶20∶20,V/V/V),(其中乙腈中含有5%的三乙胺);進樣量:20 μL;流速:1 mL/min;檢測光波長:450 nm;柱溫:30 ℃。梯度洗脫程序:0～20 min:B泵:0%～30%;20～30 min:B泵:30%～100%;30～50 min:B泵:100%。通過HPLC色譜分析得到各個消化階段的β-胡蘿卜素的峰面積,計算出其濃度,再通過下式(2),便可計算得到不同賦形劑乳液經(jīng)過消化后對β-胡蘿卜素的生物可給性的影響。

生物可給性(Bioaccessibility)=膠束中β-胡蘿卜素含量/小腸消化液中β-胡蘿卜素含量

式(2)

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,進行單因素方差分析,不同處理間的顯著性檢驗采用Duncan式多重比較,均以p<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粒徑大小和鏈長油脂制備的賦形劑乳液表征

2.1.1 粒徑大小和分布 將玉米油與水相溶液按照1∶9的質(zhì)量比混合,用高速分散均質(zhì)機和高壓均質(zhì)機在不同的條件下分別制得(d32≈ 205 nm)、中等粒徑(d32≈ 510 nm)和大粒徑(d32≈ 10 μm)的乳液(圖1a),三種乳液粒徑具有顯著差異(p<0.05),從而為后續(xù)研究不同粒徑大小賦形劑乳液對橘子中β-胡蘿卜素生物可給性提供有效材料。由于玉米油具有更高的黏度,高壓均質(zhì)機對玉米油乳液的破碎效率較低[23-24],因此MCT制備的乳液的粒徑(d32≈ 128 nm)小于玉米油長鏈油脂制備的乳液(圖1b)。三種不同粒徑乳液的多分散指數(shù)(PDI)分別為0.099、0.141和0.291,MCT油乳液的PDI為0.139。一般認為,PDI<0.3的乳液具有較好的均一性[25-26]。從圖2也可看出,不同粒徑和鏈長油脂制備的賦形劑乳液都呈單峰,均一性好,小粒徑分布范圍較窄,集中在200 nm左右,大粒徑乳液分布在10 μm左右。

圖1 不同粒徑(a)和鏈長油脂(b)賦形劑乳液的平均粒徑(d32)Fig.1 The mean particle diameter(d32)of the excipient emulsion with different particle size(a)and different chain length lipids(b)注:不同大寫字母表示差異顯著(p<0.05),圖3、圖9、圖11同。

圖2 不同粒徑(a)和鏈長油脂(b) 賦形劑乳液的粒徑分布圖Fig.2 The particle size distribution of the excipient emulsion with different particle size(a)and different chain length lipids(b)

2.1.2 ζ-電位 ζ-電位是連續(xù)相與附著在分散粒子上的流體穩(wěn)定層之間的電勢差,是對顆粒之間相互排斥或吸引力強度的度量,用于衡量膠體分散體系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。ζ-電位的絕對值越大,顆粒間的排斥力越大,體系分散穩(wěn)定性越好[27-28]。此外,ζ-電位還影響著乳液其它成分之間的相互作用,對乳液功能特性的發(fā)揮也具有重要影響[29]。利用電位測量儀測量小、中、大粒徑乳液的ζ-電位分別為-29.87、-26.56和-19.62 mV(圖3a),三種乳液表面均呈高度的電負性,且電負性隨著粒徑的增大而減小。這是由于溶液中陰離子雜質(zhì)的存在,如油脂中的游離脂肪酸、乳液的脂質(zhì)成分等,非離子表面活性劑(吐溫20)包裹的油滴也可能帶有較強的電荷[30]。并且由于具有不同液滴尺寸的乳液的界面或水相性質(zhì)的變化,乳液的ζ-電位絕對值隨著平均粒徑的增加而降低[31]。MCT乳液的ζ-電位為-24.98 mV,絕對值顯著低于玉米油長鏈油脂乳液的電荷量(-29.87 mV)(圖3b),這是由于不同油脂含有的游離脂肪酸和磷脂等組分不同,長鏈油脂中含有更多的游離脂肪酸[21],這些陰離子或陽離子成分均可吸附到油-水界面,影響整個界面電荷特性[24]。

圖3 不同粒徑(a)和鏈長油脂(b)賦形劑乳液的ζ-電位Fig.3 The ζ-potential of the excipient emulsion with different particle size(a)and different chain length lipids(b)

2.2 不同粒徑大小和鏈長油脂制備的橘子/賦形劑乳液混合體系的體外模擬消化特性

在模擬胃腸道消化過程中,賦形劑乳液混合體系中乳液粒徑大小、聚集狀態(tài)和ζ-電位的變化能夠反應(yīng)其消化特性。所有乳液都是用非離子表面活性劑(吐溫20)包裹,不易受胃腸道消化過程中pH、鹽濃度的變化以及各種消化酶的作用的影響[17],因此乳液在口腔和胃階段消化過程中性質(zhì)較為穩(wěn)定,發(fā)生聚集的程度較小。

2.2.1 不同粒徑大小和鏈長油脂橘子/賦形劑乳液混合體系在消化過程中微觀結(jié)構(gòu)的變化 從圖4顯微圖像可以觀察到,玉米油、MCT油乳液與橘汁混合后液滴均勻分布,而大粒徑乳液與橘汁混合后可能導(dǎo)致其狀態(tài)不穩(wěn)定,大液滴容易分解成較小的乳滴。經(jīng)口腔階段機械作用的剪切力下,橘子碎片進一步被分解,有利于納米乳液的融入,使橘子植物組織中的色素物質(zhì)釋放,并融入納米乳液顆粒中[32]。因而可以觀察到在口腔階段小粒徑、中等粒徑乳液和MCT乳液中的顆粒相互聚集,大小不一。經(jīng)胃階段消化后,由于胃消化液的pH和離子強度變化可能改變了乳液脂滴間的吸引力和排斥力大小,乳液也會發(fā)生絮凝。但大粒徑乳液含有非常大的油滴,能夠抵抗粘蛋白分子對其的絮凝作用,并且在消化過程中,這些大油滴易在外力的作用下發(fā)生破裂[33],絮凝聚集現(xiàn)象不明顯。在模擬小腸階段,小粒徑和中等粒徑乳液的油脂幾乎被完全消化,而大粒徑乳液還有較多油脂未被完全消化。MCT乳液在小腸消化過程中形成了一些較大的囊泡[24]。與PBS對照組相比,橘子與賦形劑乳液共同體外模擬消化時,橘子組織中的色素物質(zhì)釋放更加完全,從圖4中可看出,PBS對照組中的橘子組織中殘留了較多色素物質(zhì)。這表明,賦形劑乳液能夠促進β-胡蘿卜素這一類親脂性活性成分在植物組織中的釋放。

圖4 不同橘子/賦形劑乳液混合體系各消化階段的顯微圖像(1000×)Fig.4 Microscopy images of orange/excipient emulsion mixtures after exposure to each stage of a simulated GIT(1000×)

2.2.2 不同粒徑大小和鏈長油脂橘子/賦形劑乳液混合體系在消化過程中物化性質(zhì)的變化 粒徑特性:由于pH和離子強度變化可能改變了乳液脂滴間的吸引力和排斥力大小,乳液經(jīng)模擬胃階段消化后發(fā)生絮凝。從圖5中看出,與口腔階段相比(d32≈234 nm),小粒徑乳液在胃、小腸階段的平均粒徑顯著增大(d32≈387 nm)(p<0.05),而由于大粒徑乳液含有非常大的油滴,能夠抵抗粘蛋白分子對其的絮凝作用,MCT乳液對胃酸性環(huán)境也有一定抵抗作用,因此其平均粒徑與口腔階段相比也沒有明顯變化。經(jīng)模擬小腸階段消化后,玉米油小粒徑乳液和MCT乳液的平均粒徑均顯著增大(p<0.05),但MCT乳液會形成一些較大的囊泡[24],因此其粒徑(d32≈892 nm)顯著大于玉米油乳液(d32≈638 nm)(p<0.05)。

圖5 不同粒徑(a)和鏈長油脂(b)橘子/賦形劑乳液混合體系各消化階段的平均粒徑(d32)Fig.5 The mean particle diameter(d32)of the orange/excipient emulsion mixtures with different particle size(a)and different chain length lipids(b) after passing through each stage of simulation注:不同大寫字母(A,B,C)代表同一樣品在不同消化階段 具有顯著性差異(p<0.05),不同小寫字母(a,b,c)代表同一消化階段不同樣品間 具有顯著性差異(p<0.05)。圖6同。

從圖6可以看出,在初始階段,大粒徑的電位顯著低于小粒徑和中等粒徑,MCT油乳液的電位也顯著低于玉米油乳液(p<0.05)。經(jīng)過模擬口腔消化后,各類乳液的負電荷均顯著減少(ζ-電位為-2.60～-22.55 mV)(p<0.05),該現(xiàn)象在Zhang、Liu等人的研究中也有報道[34-35]。這是由于唾液溶液中存在大量礦物離子和粘蛋白，附著在油脂液滴的表面上,通過靜電作用改變了非離子表面活性劑表面的界面狀態(tài)和張力。在液滴周圍的水相中,未吸附表面活性劑的液滴會產(chǎn)生滲透吸引力,從而導(dǎo)致乳液發(fā)生聚集和絮凝。在模擬胃消化階段時,小粒徑玉米油乳液的游離脂肪酸在胃酸環(huán)境下發(fā)生質(zhì)子化,導(dǎo)致電荷表面靜電排斥,降低了油滴的凈電荷,從而電位接近于零(ζ-電位為0.100 mV),但中粒徑和大粒徑乳液油滴仍帶有較多的負電荷,這在Liu等人的研究中也有相似結(jié)果[35]。模擬小腸階段,在脂肪酶、膽鹽等的作用下,形成不同陰離子膠體顆粒如膽汁鹽、磷脂、游離脂肪酸等[21,24]。除大粒徑乳液外,其余各類乳液帶電量均顯著增加(ζ-電位為-16.76～-21.02 mV)(p<0.05)。結(jié)合后續(xù)油脂消化特性結(jié)果(圖8a),由于小粒徑乳液的油脂消化程度更高,形成不同膠體顆粒的混合物可能更多,ζ-電位呈高度負值,因此更有利于色素物質(zhì)的溶解。與MCT油脂乳液相比,玉米油乳液釋放的長鏈脂肪酸更容易在油脂表面的積累,抑制了脂肪酸進一步釋放和脂肪酶的吸附[21]。

圖6 不同粒徑(a)和鏈長油脂(b)橘子/ 賦形劑乳液混合體系各消化階段的ζ-電位Fig.6 The ζ-potential of the orange/excipient emulsion mixtures with different particle size(a) and different chain length lipids(b)after passing through each stage of a simulated GIT

2.2.3 不同粒徑大小和鏈長油脂賦形劑乳液對油脂消化特性的影響 使用自動滴定法監(jiān)測不同粒徑大小的賦形劑乳液對脂質(zhì)消化速率程度的影響,在整個模擬小腸消化階段,脂肪在脂肪酶的作用下不斷分解,產(chǎn)生游離的脂肪酸,導(dǎo)致pH降低,用恒電位滴定儀滴定NaOH以維持樣品的中性環(huán)境,可以根據(jù)消耗NaOH的量計算隨著消化時間釋放的游離脂肪酸(Free fatty acid,FFA)的量。

圖7、圖8分別為賦形劑乳液粒徑大小和油脂鍵長對橘子/賦形劑乳液混合體系NaOH消耗量及FFA釋放量的影響。從圖8可以看出,在消化的初期階段游離脂肪酸釋放速率曲線斜率較大,游離脂肪酸含量增加較快,隨著消化時間的延長,游離脂肪酸含量逐漸增加,最終趨于穩(wěn)定。脂肪酸最終釋放量從大到小按以下順序排列:小粒徑乳液>中等粒徑乳液>大粒徑乳液。這是由于,游離脂肪酸的最終釋放量和脂滴暴露在消化酶中的比表面積呈正比,和乳液的平均粒徑成反比,小粒徑乳液脂滴尺寸最小,暴露在消化酶中的比表面積最大,增大了和消化酶的接觸面積和反應(yīng)機會,所以消化速率較快,在一定時間內(nèi),游離脂肪酸的釋放量較多。這一結(jié)果與Ruojie等[36]和Salvia-trujillo等[37]將胡蘿卜和番茄等果蔬與設(shè)計的不同粒徑大小的賦形劑乳液共同攝入的研究結(jié)果一致。

圖7 賦形劑乳液粒徑大小(a)和油脂鏈長(b)對消化 過程中橘子/賦形劑乳液混合體系NaOH消耗的影響Fig.7 The effects of excipient emulsion particle size(A) and chain length lipids(B)on NaOH consumption in orange/excipient emulsion mixing system during digestion

圖8 賦形劑乳液粒徑大小(a)和油脂鏈長(b) 對橘子/賦形劑乳液混合體系中FFA釋放的影響Fig.8 The impact of the particle size(A)and chain length lipids(B)of the excipient emulsions on the release of free fatty acids from orange/excipient emulsion mixtures

不同鏈長油脂的樣品的總體消化曲線比較相似:在最初20 min內(nèi),FFA生成速度快,之后逐漸增加,逐步趨于平緩。圖7(b)中,對比不同油脂制得的賦形劑納米乳液最終消耗NaOH的量可發(fā)現(xiàn),MCT中鏈油脂反應(yīng)結(jié)束時消耗NaOH的量為3.77 mL,顯著高于玉米油長鏈油脂(NaOH消耗量為1.76 mL)(p<0.05)。這是由于中鏈油脂分子量較低,甘油三酯所占的比例高,即每單位脂肪將釋放更多的脂肪酸。雖然長鏈脂肪酸更容易在油脂表面的積累,抑制了脂肪酸的釋放和脂肪酶的吸附[21],但最終從脂肪酸FFA釋放曲線(圖8(b))來看,長鏈油脂與中鏈油脂的消化速率的差異不顯著(p>0.05)。由此可以得出,游離脂肪酸的釋放與乳液粒徑大小密切相關(guān),而與油脂鏈長無明顯相關(guān)性。

2.2.4 不同粒徑大小和鏈長油脂橘子/賦形劑乳液對β-胡蘿卜素生物可給性的影響 通過離心、提取上清液除去了大顆粒的雜質(zhì)(如未消化的脂滴、囊泡和液晶等)后得到膠束,各類橘子/賦形劑乳液經(jīng)小腸消化后形成的膠束平均粒徑均明顯減小,這是因為β-胡蘿卜素需要溶解在粒徑較小的混合膠束中,穿過未攪動的微絨毛水層被腸粘膜細胞吸收[38]。

利用高效液相色譜法測定了不同賦形劑乳液/橘子中β-胡蘿卜素的生物可給性,以小粒徑乳液為代表的各消化階段色譜圖呈現(xiàn)的峰面積為樣品經(jīng)提取濃縮得到的各物質(zhì)峰面積,β-胡蘿卜素在37～39 min之間出峰,圖10中看到從初始階段到膠束階段的消化液樣品的峰面積逐漸降低,這是由于樣品在消化過程中不斷被稀釋,并且樣品中β-胡蘿卜素的含量逐級減少。

圖10 橘子/小粒徑乳液混合體系各消化階段的β-胡蘿卜素HPLC譜圖Fig.10 The HPLC profile of the orange/small particle size emulsion mixed system following exposure to different GIT regions注:1號色譜峰為β-胡蘿卜素。色譜圖中 由上至下分別為初始、口腔、胃、小腸及膠束樣品的 HPLC譜圖;由于在消化過程中樣品不斷被稀釋,色譜圖 呈現(xiàn)的峰面積為樣品經(jīng)提取濃縮得到的各物質(zhì)峰面積。

游離脂肪酸是混合膠束的重要組成成分,影響著混合膠束對脂溶性活性成分的溶解能力,從而影響β-胡蘿卜素的生物可給性。β-胡蘿卜素存在于油脂的疏水核心之中[39],只有當(dāng)油脂被脂肪酶消化后β-胡蘿卜素才能釋放出來,才能從植物組織轉(zhuǎn)移到由游離脂肪酸、膽鹽、磷脂等形成的混合膠束中,油脂的消化速率和形成的混合膠束均可能影響其生物可給性。從圖9中可以看出,玉米油長鏈油脂的膠束粒徑在250 nm左右,而MCT油脂的膠束粒徑為45 nm,MCT賦形劑乳液形成的混合膠束粒徑顯著小于玉米油賦形劑乳液(p<0.05),這是因為長鏈油脂更容易與膽鹽、磷脂等形成疏水結(jié)構(gòu)大的混合膠束[40]。混合膠束過小的粒徑可能阻礙了β-胡蘿卜素進入,從而影響其生物可給性。

圖9 不同類型橘子/賦形劑乳液的混合膠束平均粒徑(d32)Fig.9 The mean particle diameter(d32)of the mixed micelles of orange/excipient emulsion

圖11中,PBS對照組與長鏈油脂制備的小、中、大粒徑大小賦形劑乳液的生物可給性分別為6%、38.13%、24.93%和26.23%,這表明與PBS對照組相比,長鏈油脂的賦形劑乳液對橘子中β-胡蘿卜素的生物可給性有顯著提高(p<0.05),并且小粒徑賦形劑乳液提升效果優(yōu)于中粒徑和大粒徑賦形劑乳液。這是由于賦形劑乳液的粒徑大小決定了油脂暴露在胃腸消化液中的表面積,在油脂的量一定的情況下,小粒徑賦形劑乳液具有更大的比表面積,有利于橘子組織中β-胡蘿卜素的釋放,油脂的消化速率和消化程度更高,可形成更多的混合膠束來容納β-胡蘿卜素[41-42]。從圖11中未得到MCT油脂的生物可給性數(shù)據(jù),這是因為MCT油賦形劑乳液在膠束階段沒有檢測到β-胡蘿卜素的含量,結(jié)合圖8(b)來看,長鏈油脂與中鏈油脂的消化程度無顯著差異,因此兩種賦形劑乳液形成的不同混合膠束對β-胡蘿卜素生物可給性的影響起到主導(dǎo)作用。長鏈脂肪酸形成的混合膠束具有更大的疏水區(qū)域[43],對相對較長的疏水性物質(zhì)β-胡蘿卜素具有更高的溶解能力,因此長鏈油脂對于提高β-胡蘿卜素的生物可給性更加有效。這一研究結(jié)果與Liu和Ruojie研究不同類型油脂制備的賦形劑乳液對于提高黃椒[35]、芒果[21]和胡蘿卜[44]中的β-胡蘿卜素的生物可給性結(jié)果一致。

圖11 不同賦形劑乳液對橘子中β-胡蘿卜素生物可給性的影響Fig.11 The impact of the different excipient emulsions on the bioaccessibility of β-carotene from orange注:N/A表示未得出數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論

結(jié)果表明,乳液經(jīng)過模擬消化過程中,靜電作用會改變非離子表面活性劑表面的界面狀態(tài)和張力,從而導(dǎo)致乳液發(fā)生聚集和絮凝,小粒徑乳液更易發(fā)生絮凝,大粒徑乳液中的大油滴能夠抵抗粘蛋白分子對其的絮凝作用,MCT乳液對胃酸性環(huán)境也有一定抵抗作用。在模擬小腸階段,由于形成不同陰離子膠體顆粒,乳液帶電量顯著增加(p<0.05),但大粒徑乳液的電位沒有顯著變化。MCT乳液會在小腸消化階段形成一些較大的囊泡,導(dǎo)致粒徑顯著增大(p<0.05)。小粒徑(200 nm)乳液由于其暴露在消化酶中的比表面積最大,油滴與消化酶之間的接觸面積和反應(yīng)機會更多,因而對于提高β-胡蘿卜素的生物可給性的效果優(yōu)于中粒徑和大粒徑乳液。長鏈油脂制備的賦形劑乳液經(jīng)過體外模擬消化后,產(chǎn)生的長鏈脂肪酸形成的混合膠束粒徑更大,可能具有更大的疏水區(qū)域和溶解β-胡蘿卜素的能力,因此對提高橘子中β-胡蘿卜素的生物可給性具有更顯著的影響。

本實驗研究結(jié)果對于目的性設(shè)計賦形劑乳液的粒徑大小及油脂鏈長來提高果蔬中類胡蘿卜素的生物可給性具有重要指導(dǎo)意義,并為后續(xù)動物細胞實驗探究不同賦形劑乳液對果蔬中類胡蘿卜素在體內(nèi)的生物利用率奠定基礎(chǔ)。