肉桂酸植物甾醇酯的酶法合成及對DPPH·的清除作用

陳林林 荊榮華 李 偉 韓 可 辛嘉英,2

(哈爾濱商業(yè)大學省高校食品科學與工程重點實驗室1，哈爾濱 150076) (中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室2，蘭州 730000)

植物甾醇又稱植物固醇[1]，是化學結構與膽固醇類似的一類天然活性物質，可有效減少人體對低密度脂蛋白膽固醇的吸收、促進膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的合成等[2-5]，具有抗癌、抗動脈粥樣硬化和抗氧化等功效[6-8]。然而，植物甾醇熔點較高，常溫下為結晶形式，在人體中的溶解性和生物可利用性較差；不溶于水，在油脂中的溶解度也很小[9]，在食品中的應用受到限制[10]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇酯作為植物甾醇的衍生物，具有和植物甾醇相同甚至更優(yōu)的生理活性功能[11]，有效增加其脂溶性和生物利用度[8]，逐漸成為研究熱點[12]。

植物甾醇酯的制取常采用化學合成法、酶催化合成法及離子液體催化合成法。酶催化合成法同化學合成法相比較具有催化反應條件較溫和，副產(chǎn)物較少及易于產(chǎn)物的分離純化等優(yōu)點，但需要選擇合適的有機溶劑同時提高酶的穩(wěn)定性，提高生產(chǎn)效率[13]。Nikolaus等[14]發(fā)現(xiàn)，和甾醇酯通過脂肪酶催化植物甾醇與脂肪酸酯或三酰甘油酯交換，可有效地制備植物甾醇酯。霍玉潔等[15]設計合成4 種離子液體催化肉桂酸和植物甾醇酯化制備肉桂酸植物甾醇酯，但離子液體的制備工藝較復雜，成本較高，反應體系粘度高、關于其對產(chǎn)物的毒性難以確定，并且關于離子液體催化合成植物甾醇酯的報道較少，研究較分散?；谝陨显?，選擇安全無毒的生物酶用于合成植物甾醇酯。本研究將優(yōu)化非水反應體系溶劑，通過脂肪酶催化轉酯反應合成肉桂酸植物甾醇酯，構建并優(yōu)化肉桂酸乙酯與植物甾醇的轉酯化反應體系，旨在提高植物甾醇的溶解性、穩(wěn)定性和抗氧化性，合成具有植物甾醇功效的功能性酯，為甾醇的安全、高效合成提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

固定化南極假絲酵母脂肪酶Novozym435脂肪酶(100 000 U/g)、豬胰脂肪酶PPL(80 000 U/g)、Lipozyme TL IM(100 000 U/g)、Lipozyme RM IM(70 000 U/g)、擴展青霉脂肪酶(70 000 U/g)、脂肪酶LBK4000(70 000 U/g)；肉桂酸乙酯、肉桂酸甲酯；植物甾醇(純度≥90%)；4 ?分子篩；甲醇(色譜純)；二氯甲烷、異辛烷、叔戊醇、正己烷、2-甲基四氫呋喃、叔丁醇、四氫呋喃、乙酸乙酯、石油醚、冰醋酸均為分析純。

1.2 主要儀器

BS210S電子天平；IKA磁力攪拌器；KH-2000型薄層色譜掃描儀；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱；R-1001N型旋轉蒸發(fā)儀；SHB-Ⅳ雙A循環(huán)水式多用真空泵；U3000高效液相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 肉桂酸植物甾醇酯的合成

在15 mL反應瓶中按底物比分別加入0.5 mmol肉桂酸乙酯與植物甾醇、0.5 g分子篩，再加入5.0 mL有機溶劑和一定量的Novozym435脂肪酶，在在一定溫度條件下，磁力攪拌器轉速300 r/min反應120 h。定時取樣分析，計算肉桂酸甾醇酯的產(chǎn)率，反應初速度。分別對酰基供體、脂肪酶種類進行篩選，并考察脂肪酶添加量、溫度、底物比等對轉酯反應的影響。具體實驗條件由反應體系因素的不同有所改變。

1.3.2 產(chǎn)物分離與檢測

采用薄層層析(TLC)分析每隔24 h吸取2.5 μL的反應混合物進行反應進程監(jiān)測。將反應樣品和對照樣品分別在GF 254硅膠板上點樣，展開劑根據(jù)篩選的最佳溶劑組分[9]之間的配比為石油醚∶乙酸乙酯(10∶1)，展開距離為10 cm，254 nm紫外光下觀察，對產(chǎn)物肉桂酸植物甾醇酯、底物肉桂酸乙酯、植物甾醇定性檢測。根據(jù)薄層層析的展開條件和分離效果，對反應后濾去酶的反應液進行硅膠柱分離純化，硅膠柱(40 cm×5 cm)，按照洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯(15∶1)洗脫，收集各部分洗脫液旋轉蒸發(fā)后可得到目標產(chǎn)物肉桂酸植物甾醇酯。

.nbhv利用高效液相色譜(HPLC)進行定量分析，色譜柱：XDB-C18(4.6 mm×150 mm, 5 μm)；流動相：溶劑A(100% 甲醇)和溶劑B(0.5% 冰乙酸)；流速為1 mL/min，保留時間為23 min；樣品經(jīng)甲醇稀釋20倍，進樣量10 μL；檢測波長：278 nm；檢測溫度：30 ℃。

肉桂酯乙酯產(chǎn)率及各產(chǎn)物產(chǎn)率按各物質峰面積(A)歸一化法[16]進行計算：

1.3.3 肉桂酸植物甾醇酯清除DPPH·清除能力測定

吸取濃度為0.025、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的樣品乙醇溶液，加入到2 mL濃度為0.16 mmol/L的DPPH乙醇溶液中，充分混合后，在黑暗處室溫放置30 min，在517 nm波長下測定吸光度值?？瞻兹芤河? mL乙醇和2 mL 0.16 mmol/L的DPPH乙醇溶液組成，按公式計算清除率[17]，并計算半數(shù)清除率濃度IC50值。

式中：A1為樣品DPPH混合溶液的吸光度值；A2為樣品吸光度值；A空白為空白的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 反應產(chǎn)物分析

2.1.1 TLC對反應產(chǎn)物的分析

對肉桂酸乙酯與植物甾醇反應液薄層層析板進行掃描，其薄層掃描結果如圖1所示。

注：A—植物甾醇；B—肉桂酸乙酯；C—反應液；D—肉桂酸植物甾醇酯。圖1 肉桂酸甾醇酯染色前后TLC示意圖

由圖1a可以清晰地看出，由Novozym435脂肪酶催化肉桂酸乙酯與植物甾醇反應有4種物質的展開點，通過對照肉桂酸乙酯標的展開點對照可知，Ⅰ點為底物肉桂酸乙酯，比移值為0.82，根據(jù)反應機理，理論上產(chǎn)物結構分析Ⅱ處的展開點推測為肉桂酸植物甾醇酯，測定得到比移值為0.31。由圖1b可知，A為植物甾醇，因為植物甾醇紫外吸收弱，所以在圖1a中并不能顯現(xiàn)出來，需要染色后才可以看出。在圖1a中可看出，產(chǎn)物肉桂酸植物甾醇酯在紫外顯示下明顯，經(jīng)染色后同樣可以清晰顯示，所以確定圖1a中Ⅲ點應為肉桂酸植物甾醇酯。

2.1.2 HPLC對反應產(chǎn)物的分析

使用高效液相色譜儀對底物、反應液與純化后產(chǎn)物進行測定，得到液相色譜圖如圖2～圖4所示。

在TLC分析結果基礎上，進一步通過高效液相色譜定性、定量分析，對應圖2中底物肉桂酸與肉桂酸乙酯的保留時間，且由于肉桂酸甾醇酯的極性大于肉桂酸乙酯的極性，故肉桂酸甾醇酯的保留時間小于肉桂酸乙酯的保留時間。因此，圖3轉酯化反應液中底物肉桂酸乙酯的保留時間為12.050 min，猜測2號峰為產(chǎn)物峰。通過進一步對產(chǎn)物肉桂酸甾醇酯的分離純化后進行高效液相色譜分析，液相色譜圖如圖4所示，得到產(chǎn)物的出峰位置，與反應液混點液相色譜圖上的吸收峰和保留時間對照，并從從疏水性的大小可判斷，圖3中保留時間為11.29 min的吸收峰為肉桂酸甾醇酯。

圖2 肉桂酸乙酯高效液相色譜圖

注：1代表肉桂酸乙酯；2代表肉桂酸甾醇酯；3代表肉桂酸。圖3 肉桂酸植物甾醇酯反應液高效液相色譜圖

圖4 純化后肉桂酸甾醇酯高效液相色譜圖

2.2 非水相體系催化轉酯反應條件的優(yōu)化

2.2.1 ?；w的篩選

以肉桂酸植物甾醇酯的產(chǎn)率和反應初速度為指標，考察不同底物生成肉桂酸植物甾醇酯的效果，結果如圖5所示。

注：反應條件為叔戊醇與2-甲基四氫呋喃混合溶劑(1∶1)5.0 mL，Novozym435脂肪酶80 mg，磁力攪拌器轉速300 r/min，反應溫度60 ℃，反應時間120 h。圖5 不同?；w對轉酯反應的影響

從圖5中可知，隨著?；w的改變，產(chǎn)率在其他條件相同的情況下有顯著變化(P<0.05)，肉桂酸乙酯與植物甾醇合成肉桂酸植物甾醇酯的產(chǎn)率明顯高于肉桂酸和肉桂酸甲酯作為?；w時合成肉桂酸植物甾醇酯的產(chǎn)率，在合成肉桂酸植物甾醇酯的過程中，肉桂酸甲酯水解成肉桂酸的水解率明顯高于肉桂酸乙酯。與其他兩種?；w相比，肉桂酸乙酯在反應前48 h產(chǎn)率增加明顯，說明其在反應初速度較高。若用肉桂酸作為?；w，雖然可以與植物甾醇直接酯化，而且不存在底物水解的問題，但是產(chǎn)率并不高，反應初速度也很低。因此，選用肉桂酸乙酯作為?；w。

2.2.2 脂肪酶種類的篩選

在叔戊醇和2-甲基四氫呋喃混合有機溶劑體系中，選擇了六種不同的酶作為催化劑，通過薄層層析未檢測到由擴展青霉和LBK4000脂肪酶催化的反應有產(chǎn)物生成，故只需在RM IM、Novozym435、TL IM、PPL這四種脂肪酶中進行篩選，結果如圖6、圖7所示。

注：A—肉桂酸乙酯；B—PPL酶反應液；C—TL IM酶反應液；D—RM IM酶反應液；E—Novozym435酶反應液。圖6 脂肪酶種類篩選反應TCL示意圖

注：反應條件為叔戊醇與2-甲基四氫呋喃混合溶劑(1∶1)5.0 mL，肉桂酸乙酯0.5 mmol及植物甾醇0.5 mmol，磁力攪拌器轉速300 r/min，反應溫度60 ℃，反應時間120 h。圖7 脂肪酶種類對轉酯反應的影響

由圖7可知，在其他條件相同的情況下，脂肪酶種類的不同，產(chǎn)率差異明顯(P<0.05)，由Novozym435脂肪酶催化合成肉桂酸植物甾醇酯的產(chǎn)率明顯高于其他三種脂肪酶，在120 h時產(chǎn)率達到最大，可達41.29%。與其他種類酶相比，Novozym435脂肪酶在反應初期產(chǎn)率變化明顯，說明其催化合成肉桂酸植物甾醇酯的反應初速度較高。并且通過圖6可以看出，Novozym435脂肪酶TCL檢測獲得的產(chǎn)物點最為明顯。因此，選用Novozym435脂肪酶進行后續(xù)的實驗，這個結果與李江濤等[18]研究脂肪酶催化合成α-亞麻酸植物甾醇酯脂肪酶選擇的結果一致。

2.2.3 有機溶劑的篩選

分別選用叔戊醇與2-甲基四氫呋喃混合溶劑(1∶1)、異辛烷、2-甲基四氫呋喃、四氫呋喃、叔戊醇、正己烷作溶劑。通過薄層層析檢測到在叔戊醇、異辛烷、正己烷作反應溶劑時并沒有產(chǎn)物生成，其他溶劑體系結果如圖8所示。

注：反應條件為肉桂酸乙酯0.5 mmol及植物甾醇0.5 mmol，Novozym435脂肪酶80 mg，磁力攪拌器轉速300 r/min，反應溫度60 ℃，反應時間120 h。圖8 有機溶劑對轉酯反應的影響

由圖8可知，在其他條件相同的情況下，有機溶劑的種類的不同產(chǎn)率差異明顯(P<0.05)。隨著反應時間的增加，肉桂酸植物甾醇酯的產(chǎn)率均逐漸增大，其中四氫呋喃作為溶劑的反應體系效果較差，原因是四氫呋喃的極性較強，脂肪酶在其中的穩(wěn)定性較差，很快失活，導致轉酯反應無法繼續(xù)進行。2-甲基四氫呋喃作為溶劑的反應體系中，產(chǎn)率最高，脂肪酶有良好的催化活力，且底物具有較好的溶解性，更有利于其擴散通過酶必需水層進入活性中心。因此，確定最佳反應溶劑為2-甲基四氫呋喃。

2.2.4 脂肪酶添加量對轉酯反應的影響

以肉桂酸植物甾醇酯的產(chǎn)率、反應初速度為指標，考察不同脂肪酶添加量對轉酯反應的影響，結果如圖9所示。

注：反應條件為2-甲基四氫呋喃5 mL，肉桂酸乙酯0.5 mmol及植物甾醇0.5 mmol，Novozym435脂肪酶，磁力攪拌器轉速300 r/min，反應溫度60 ℃，反應時間120 h。圖9 脂肪酶添加量對轉酯反應的影響

由圖9可知，反應開始時隨著酶量的增加，肉桂酸甾醇酯的產(chǎn)率明顯增大(P<0.05)。其原因主要是隨著酶量的增加，反應速度逐漸提高，參加反應底物的量增多，提高了肉桂酸植物甾醇酯的產(chǎn)率。當反應所加酶量達到120 mg時，產(chǎn)率達到最大，產(chǎn)率可達60.63%。但之后隨著酶量繼續(xù)增加，產(chǎn)率逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，造成這種結果的原因可能是酶的表面有一層水化層，加入過多的酶就會向體系中引入過多的水，從而使體系的初始水活度提高，使肉桂酸乙酯的水解反應增強，促進了可逆反應進行，使反應肉桂酸植物甾醇酯含量減少，降低了反應的產(chǎn)率。因此，最佳脂肪酶的加入量應為120 mg。

2.2.5 反應溫度對轉酯反應的影響

由圖10可知，反應開始時隨著溫度的增加，肉桂酸甾醇酯的產(chǎn)率顯著增加。溫度為55 ℃時，反應初期產(chǎn)率變化較大，說明溫度升高加快反應初速度；但溫度繼續(xù)升高，曲線變化平緩，原因是高溫提高反應速度的同時，也會加快酶的失活。而且反應長時間處于過高溫中，有機溶劑會部分蒸發(fā)，反應體系粘度增大，不利于反應介質的傳質，而且使得酶活性下降，導致轉酯化反應進行緩慢。由圖10也可以看出，當溫度達到65 ℃時，產(chǎn)率在120 h有所降低，這個結果與Zheng等[19]選擇分析討論結果一致。

注：反應條件為2-甲基四氫呋喃5 mL，肉桂酸乙酯0.5 mmol及植物甾醇0.5 mmol，Novozym435脂肪酶120 mg，磁力攪拌器轉速300 r/min，反應時間120 h。圖10 反應溫度比對轉酯反應的影響

2.2.6 底物比對轉酯反應的影響

由圖11可知，在轉酯反應中，隨著反應時間的增加，48 h前底物比對產(chǎn)率影響較小，肉桂酸乙酯、植物甾醇底物比為1∶1時肉桂酸植物甾醇酯產(chǎn)率最高，120 h時產(chǎn)率達到76.34%。將比例升高或減少都導致產(chǎn)率下降。由此可見，植物甾醇濃度過大會影響與肉桂酸乙酯的轉酯反應，導致產(chǎn)率下降，說明可能存在?；w的底物抑制作用，并且由于植物甾醇量的溶解性較差，對于其濃度的控制有利于后續(xù)產(chǎn)物的分離。因此，肉桂酸乙酯與植物甾醇比例為1∶1為最適摩爾比，此結論與Oyeyinka[20]等研究大豆甾醇與乙酸酐轉酯反應底物比選擇的結果一致。優(yōu)化后產(chǎn)率可達76.34%。植物甾醇與肉桂酸乙酯的轉酯反應同其他方法合成的植物甾醇酯，如植物甾醇醇山梨醇琥珀酸二酯[21]、谷甾醇煙酸酯[22]、甾醇高油酸葵花籽油酯[23]相比，合成的產(chǎn)率相近或較高，并具有成本較低，工藝簡單，催化反應條件較溫和等優(yōu)點。

注：反應條件為2-甲基四氫呋喃5 mL，Novozym435脂肪酶120 mg，磁力攪拌器轉速300 r/min，反應溫度60 ℃，反應時間120 h。圖11 底物比對轉酯反應的影響

2.3 肉桂酸植物甾醇酯對DPPH·的清除作用

相同條件下，對各濃度梯度的抗壞血酸、茶多酚、肉桂酸乙酯、植物甾醇和肉桂酸植物甾醇酯進行清除DPPH·的能力的測定，結果如圖12所示。

圖12 各濃度樣品清除DPPH·能力的變化曲線

由圖12可知，抗壞血酸在濃度0.025～0.25 mg/mL的范圍內，對DPPH·的清除率最大達到60%以上，但隨濃度的變化趨勢較為平緩；茶多酚隨著濃度的上升，清除率的先顯著增加，在0.25 mg/mL時大于抗壞血酸，抑制率為70.41%；本實驗底物肉桂酸乙酯和植物甾醇相較于同濃度的抗壞血酸和茶多酚對DPPH·清除能力較弱，但是二者均呈上升趨勢，肉桂酸乙酯在0.15 mg/mL以后清除率上升明顯，而植物甾醇的抑制率開始變緩，并且植物甾醇清除自由基能力稍強于肉桂酸乙酯；此次實驗合成的肉桂酸植物甾醇酯，經(jīng)過測定，具有一定的清除DPPH·的能力，即具有一定的抗氧化性，與底物肉桂酸乙酯和植物甾醇相比，清除自由基的能力稍強，并且改善了植物甾醇的溶解性和穩(wěn)定性。

表1 各樣品清除DPPH·的IC50值

通過表1中各實驗樣品的IC50值可以看出，所測試的樣品各自清除DPPH·的能力大小，IC50值從小到大可表示為：抗壞血酸<茶多酚<肉桂酸甾醇酯<植物甾醇<肉桂酸乙酯。可以看出抗壞血酸紅和茶多酚的IC50值較小，清除能力較強，產(chǎn)物肉桂酸植物甾醇酯的IC50值同兩個底物肉桂酸乙酯和植物甾醇相比，清除DPPH·效果有所改善。

3 結論

本實驗研究了Novozym 435脂肪酶在非水相體系中催化肉桂酸乙酯與植物甾醇合成肉桂酸植物甾醇酯，通過色譜法進行分析確定在最優(yōu)條件下，酶促合成肉桂酸植物甾醇酯的產(chǎn)率可達76.34%，說明轉酯反應的底物轉化率較高。通過對產(chǎn)物清除DPPH·能力的測定，發(fā)現(xiàn)與植物甾醇相比，具有良好的抗氧化活性。