超聲波對花生粕蛋白功能特性及結(jié)構(gòu)特性的影響

張艷艷 王冰蕊 張少可 李銀麗 張 華

(鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院;食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心;河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點實驗室，鄭州 450002)

花生蛋白在壓榨提取花生油的過程中發(fā)生嚴(yán)重?zé)嶙冃?，進而導(dǎo)致花生蛋白的營養(yǎng)價值降低，功能特性也降低，這極大地限制了花生粕在其他領(lǐng)域的應(yīng)用，花生粕資源浪費嚴(yán)重。植物蛋白的功能特性是指蛋白質(zhì)本身具有能影響食品質(zhì)量的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì)。主要包括起泡性、乳化性、持水性、吸油性、溶解性等。這些特性除了與氨基酸組成、分子大小和結(jié)構(gòu)形態(tài)等屬性有關(guān)外，還與蛋白質(zhì)相互作用的組分和其所在環(huán)境等有關(guān)。物理改性是指改變蛋白分子間的聚集方式和蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。這種方法具有無毒，可接受性高的特點，因此更廣泛的被應(yīng)用到食品領(lǐng)域。

超聲波是一種快速無損的物理加工方法，超聲波的空化作用，機械作用及定向作用可有效增強物料的傳質(zhì)傳熱，加速其化學(xué)反應(yīng)的進行。Zhang等[1]研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理后，花生分離蛋白的乳化性得到了明顯的改善，并且蛋白分子的平均直徑由474.70 nm減少到255.80 nm。超聲波處理可盡量減少花生蛋白三級空間結(jié)構(gòu)的變化。邵悅等[2]研究了不同超聲波處理時間和對花生蛋白功能特性的影響，研究發(fā)現(xiàn)，不同的超聲波處理時間對花生蛋白的功能影響效果不同，超聲波處理5～20 min后，花生蛋白的起泡性、泡沫穩(wěn)定性、乳化性、吸油性和溶劑性都得到了一定的改善。

研究證實，超聲波的作用效果與其工作模式直接相關(guān)，不同工作模式的超聲波對物料的結(jié)構(gòu)的影響具有較大差異[3, 4]。

本研究以熱榨花生粕為主要原料，研究了探頭式、平板式、平板式協(xié)同探頭式超聲波對花生粕蛋白功能特性的影響，并對其蛋白結(jié)構(gòu)進行表征，以期揭示不同模式超聲波對花生粕蛋白功能特性的改良機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

熱榨花生粕：周口魯花濃香花生油有限公司；金龍魚大豆植物油：上海嘉里食品工業(yè)有限公司；三羥甲基氨基甲烷；甘氨酸；乙二胺四乙酸；5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)；8-苯胺-1-萘磺酸：麥克林生化科技有限公司；其他試劑均為分析純或優(yōu)級純。

1.2 花生粕蛋白的制備及多模式超聲波的處理

1.3 花生粕蛋白功能特性的測定

1.3.1 花生粕蛋白起泡性及泡沫穩(wěn)定性測定

根據(jù)馬勇等[6]的方法進行。根據(jù)式(1)計算花生粕蛋白的起泡性，再根據(jù)式(2)計算其泡沫穩(wěn)定性。

(1)

(2)

1.3.2 花生粕蛋白的乳化性及乳化穩(wěn)定性測定

參考李維遙等[7]的方法進行，取20 mL的蛋白溶液倒入燒杯中,再加入等體積的20 mL大豆植物油混勻。均質(zhì)2 min,轉(zhuǎn)速為10 000 r/min,取20 mL于50 mL離心管中，配平后進行離心，離心力設(shè)定為1 750 g,離心時間設(shè)定為5 min。借助直尺進行讀數(shù)，并記錄液體總高度和乳化層高度。再將測量后的離心管放置在60 ℃的水浴鍋中，恒溫放置30 min后取出，待冷卻至室溫后，再次進行離心，離心力設(shè)定為1 750 g,離心時間設(shè)定為5 min,最后再借助直尺測量離心管中乳化層的高度。根據(jù)式(3)計算花生粕蛋白的乳化性，再根據(jù)式(4)計算乳化穩(wěn)定性。

(3)

在數(shù)學(xué)概念教學(xué)中，某些數(shù)學(xué)規(guī)律教師要善于鼓勵學(xué)生們大膽去猜想，并讓學(xué)生們真正在經(jīng)歷猜想，驗證結(jié)論的具體過程，這樣教學(xué)，符合學(xué)生們接受認(rèn)知的學(xué)習(xí)習(xí)慣，使學(xué)生對要學(xué)習(xí)的新知識的特點更清晰，思維也更活躍，在這個合情推理的過程中，學(xué)生概念知識的獲得也就顯得自然而然，水到渠成了。

(4)

1.3.3 花生粕蛋白的溶解性、吸油性和持水性的測定

參考文獻(xiàn)[2]中的方法進行。

1.4 花生粕蛋白結(jié)構(gòu)特性的測定

1.4.1 紫外光譜和熒光光譜的掃描

將200 mg花生粕蛋白粉溶解在15 mL的磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L, pH為7.0)中離心(4 670 g)10 min，離心后棄去沉淀。取0.5 mL的蛋白上清液稀釋至12倍，用紫外分光光度對其進行光譜掃描[8]。紫外掃描參數(shù)為：掃描范圍200～400 nm，掃描速度 60 nm/min，光程 1.0 cm，狹縫寬度0.2 nm。熒光掃描參數(shù)為：激發(fā)波長290 nm，掃描范圍：300～400 nm，掃描速度240 nm/min，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度5 nm[9]。

1.4.2 紅外光譜掃描及二級結(jié)構(gòu)的測定

準(zhǔn)確稱量0.002 g的花生粕蛋白粉樣品，加入KBr 0.018 g，充分混勻后用研缽將混合物研磨成粉末，將混合粉末壓制成薄片。利用傅里葉紅外光譜掃描儀，對壓制好的薄片進行波段掃描，波段掃描的范圍設(shè)定在4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)設(shè)定為32。每個樣品做3次平行試驗[10]。在1 600～1 700對蛋白二級結(jié)構(gòu)單元含量的分析參照[11]等的方法。

1.4.3 花生粕蛋白的巰基含量測定

取200 mg花生粕蛋白粉于50 mL的離心管中，倒入15 mL的Tris-Gly緩沖液(0.086 mol/L Tris，0.090 mol/L Gly，4 mmol/L EDTA，pH 8.0)，漩渦震蕩提取30 min,然后進行離心，離心力設(shè)定為5 836 g,離心時間設(shè)定為20 min，離心后取上清液1 mL加入表面包有避光材料的10 mL的離心管中，再加入5 mL由8 mol/L的尿素和0.5%的EDTA(用Tris-Gly緩沖液配制)配制的溶液，最后加入50 uL的Ellman’s試劑(由4 mg的DTNB試劑溶于1 mL的Tris-Gly緩沖液配制成的Ellman’s試劑)，充分搖勻，至于30 ℃水浴鍋中反應(yīng)1 h,用分光光度計在412 nm處測定吸光度值。根據(jù)吸光度值計算出巰基含量[12]。根據(jù)式(5)計算巰基含量。

(5)

1.5 熱特性的檢測

參照Meng等[13]的方法進行。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Origin 8.5、PeakFit v4.12、及Excel等軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波對花生粕蛋白功能性特性的影響

由表1所示，不同工作模式的超聲波處理后，花生粕蛋白各項功能特性發(fā)生了顯著變化。對于蛋白的起泡性，乳化性和持油性，效果最優(yōu)的是平板+探頭式超聲波。與對照樣品相比分別增高了15.0%、62.9%和7.0%。對于蛋白的泡沫穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性、溶解性和持油性，效果最好的探頭式超聲波。與對照樣品相比分別增高了8.1%、24.3%、5.1%、23.8%。

表1 超聲波對花生粕蛋白功能特性的影響

注：同列肩標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同。

不同的超聲波作用方式，對蛋白不同的結(jié)構(gòu)單元影響會不同，造成了功能特性也會有不同的變化。平板式超聲波作用均勻，但是其在物料分子之間的穿透力度不夠。探頭式超聲波穿透能力強，但是其波形是自上而下的駐波，作用范圍有限且分布不均。對于蛋白的溶解性，探頭式超聲波作用力集中，使蛋白顆粒破裂，粒徑變小，表面積增大，有利于維持原來有序結(jié)構(gòu)的次級鍵打開，溶解度提高。對于蛋白的乳化性，蛋白分子更容易在均勻超聲場的誘導(dǎo)下產(chǎn)生極化現(xiàn)象，使維持蛋白空間結(jié)構(gòu)的非共價鍵(疏水相互作用、二硫鍵、靜電相互作用)被破壞，蛋白分子部分展開，分子的柔性提高，更多的蛋白分子結(jié)合到油-水界面[14,15]。同時，蛋白分子內(nèi)部的疏水殘基暴露在蛋白表面，蛋白表面的疏水性增強，故蛋白的乳化活性增強，因此平板式+探頭式超聲波優(yōu)勢更為明顯。

2.2 超聲波對花生粕蛋白結(jié)構(gòu)特性的影響

天然的花生蛋白具有較好的起泡性、乳化性、吸油性、持水性和溶解性等功能特性，花生粕蛋白功能特性劣變的主要原因為高溫壓榨時花生蛋白質(zhì)發(fā)生了熱變性。為了揭示超聲波對花生粕蛋白功能特性的改良機制，分別研究了不同超聲波工作模式對花生粕蛋白紫外、熒光光譜特性、蛋白二級結(jié)構(gòu)、巰基含量和表面疏水性的影響。

2.2.1 紫外光譜和熒光光譜

由圖1a可以看出，經(jīng)過超聲波處理后，紫外最大吸收波長發(fā)生了藍(lán)移。這是因為經(jīng)過超聲波處理后，花生粕蛋白質(zhì)子解聚展開產(chǎn)生了新的亞基，從而使得紫外最大吸收波長發(fā)生了藍(lán)移。同時也能夠表明多模式超聲波處理后，花生粕蛋白分子的展開程度變大，分子表面具有紫外吸收的殘基可能增多。對于花生粕蛋白的紫外光譜特性，改變最大的是探頭式超聲波。由圖1b可以看出，經(jīng)過多模式超聲波處理后，花生粕蛋白的熒光最大吸收峰位發(fā)生了顯著性的偏移。與對照組相比，探頭式超聲波處理的花生粕蛋白的熒光最大吸收峰偏移最顯著。最大吸收峰位紅移表明分子結(jié)構(gòu)的展開，同時展現(xiàn)為分子內(nèi)部色氨酸殘基的逐漸暴露[16]。實驗數(shù)據(jù)顯示，多模式超聲波處理后的花生粕蛋白的峰位在紅移，表明花生粕蛋白的結(jié)構(gòu)在不斷展開，分子內(nèi)部的色氨酸殘基在逐漸暴露。這說明超聲波會導(dǎo)致花生粕蛋白的聚集和結(jié)構(gòu)的變化，且探頭是超聲波的作用效果最為顯著。

圖1 超聲波對花生粕蛋白紫外光譜和熒光光譜的影響

2.2.2 巰基含量

由圖2所示，多模式超聲波處理后的花生粕蛋白的巰基含量發(fā)生了明顯的變化。其中，改善效果最好的是平板式超聲波，增高了20.3%。探頭式超聲波對其影響不大。平板+探頭式超聲波處理后，巰基含量下降，與對照組相比，下降了8.5%。經(jīng)過一定方式處理后，蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)會發(fā)生伸展變性，繼而引起二硫鍵含量和巰基含量的變化。巰基含量的上升就是因為蛋白結(jié)構(gòu)改變，而蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開使得內(nèi)部巰基暴露，蛋白的亞基發(fā)生解離和二硫鍵斷裂生成巰基，這些都有可能帶來這種改變。巰基含量降低是因為巰基氧化、SH和S-S交換導(dǎo)致二硫鍵的形成[17]。因此，平板式超聲波可能導(dǎo)致花生粕蛋白內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開，從而使內(nèi)部巰基暴露，使得總巰基含量變高；而平板+探頭式超聲波可能導(dǎo)致巰基和二硫鍵之間形成了交換，使得巰基向二硫鍵轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致總巰基含量降低。

圖2 超聲波對花生粕蛋白巰基含量的影響

2.2.3 蛋白二級結(jié)構(gòu)

本次實驗利用多模式超聲波對花生粕蛋白進行處理，通過傅里葉紅外掃描儀對樣品進行4000～400 nm波段掃描，得到了紅外吸收光譜圖如圖3。對其酰胺Ⅰ帶進行分峰擬合之后得到表4。

表2所示，超聲波處理顯著改變了花生粕蛋白的二級結(jié)構(gòu)。對于α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊，平板+探頭式和探頭式超聲波對其相對百分含量影響效果最為顯著，但兩者之間并無顯著差別。對于無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，三種模式的超聲波處理并無顯著差別?；ㄉ傻鞍字械摩?螺旋結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的相對百分含量有明顯的上升，而β-折疊結(jié)構(gòu)和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的相對百分含量在下降。超聲波造成β-折疊結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的聚集結(jié)構(gòu)解離，導(dǎo)致兩者百分含量下降，進而轉(zhuǎn)化為α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，造成后兩者百分含量上升[19]。

表2 超聲波對花生粕蛋白中二級結(jié)構(gòu)的影響

圖3 紅外光譜圖

2.3 超聲波對花生粕蛋白熱力學(xué)特性的影響

在表3中，Td是蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的代表，Td值越大，代表蛋白熱穩(wěn)定性越高，經(jīng)過平板式超聲波處理后的花生粕蛋白的Td值最大，因此其熱穩(wěn)定性最好。ΔH代表焓變，反映熱變性程度，ΔH值越小，熱變性程度越低。平板+探頭式超聲波處理后的花生粕蛋白的ΔH最小，其熱變性程度最低，與對照樣品相比，降低了8.6%。ΔH還能反映蛋白質(zhì)的疏水性，同時也反映的是蛋白質(zhì)分子的聚集程度，ΔH越高，代表疏水性越小，聚集程度越大?？芍?，平板+探頭式超聲波處理的花生粕蛋白的疏水性變大。在表5中還有兩個參數(shù)就是Ta初始溫度，Tc終止溫度，這兩者的差值代表著峰的寬窄。峰的寬窄可用來說明變性轉(zhuǎn)變的協(xié)同性，峰越窄，說明協(xié)同性越高[20-22]。可知，三種超聲波模式中，平板式超聲波處理后的花生粕蛋白的Tc-Ta值最小，說明平板式超聲波處理后的花生粕蛋白的協(xié)同性最高。

圖4 DSC譜圖

工作模式Ta/ ℃Tc/ ℃Tc-Ta/ ℃Td/ ℃ΔH/J/g對照142.28182.7740.49146.14643.10平板151.92195.5942.67162.59641.94探頭144.45195.3250.87148.55658.26平板+探頭145.95194.5248.57159.20588.03

注：Ta是初始溫度，Tc為終止溫度，Td為峰值溫度，ΔH為變性焓值。

3 結(jié)論

本文研究了探頭式、平板式和平板協(xié)同探頭式超聲波處理對花生粕蛋白功能特性及蛋白結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果顯示，超聲波可以顯著改善花生粕蛋白的功能特性。對于蛋白的起泡性，乳化性和持油性，效果最優(yōu)的是平板+探頭式超聲波，與對照樣品相比分別增高了15.0%、62.9%和7.0%。對于蛋白的泡沫穩(wěn)定性、乳化穩(wěn)定性、溶解性和持油性，效果最好的探頭式超聲波。與對照樣品相比分別增高了8.1%、24.3%、5.1%和23.8%。超聲波處理后，花生粕蛋白的分子結(jié)構(gòu)有明顯的改變。紫外光譜結(jié)果表明：超聲對花生粕蛋白分子構(gòu)象有改變，紫外最大吸收波長發(fā)生了藍(lán)移，熒光最大吸收峰明顯的指示峰位在紅移，蛋白的結(jié)構(gòu)在不斷展開，分子內(nèi)部的色氨酸殘基逐漸暴露，超聲波導(dǎo)致花生粕蛋白的聚集和結(jié)構(gòu)的變化。探頭式、平板+探頭式超聲波對α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角和β-折疊的相對百分含量的影響最大，但兩者無顯著差別；平板式超聲波顯著提高了花生粕蛋白的巰基含量，與對照樣品相比提高了20.6%；熱力學(xué)特性的結(jié)果顯示，探頭式超聲波處理后的焓變最小，與對照樣品相比下降了8.6%。超聲波處理通過改變花生粕蛋白的分子結(jié)構(gòu)改善其功能特性，降低其熱變形的程度。