牛大力種子特性與萌發(fā)研究

鄧祿軍1， 李金玲， 夏錦慧1， 范士杰1， 韋忠斌， 謝永軍

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所， 貴陽 550006；2.貴州省藥用植物繁育與種植重點(工程)實驗室， 貴陽 550025)

牛大力(Millettiaspecisoachamp)是豆科崖豆藤屬植物，又名血藤、血風藤、倒吊金鐘、甜牛大力、甜牛力、美麗崖豆藤等[1]，其氣味甘香、性溫和，藥性甘平、歸肺、腎經(jīng)[2]。牛大力種子較大，約0.6 cm×1.5 cm(長×寬)，黑褐色，卵圓形[3]。牛大力根藥用有非常悠久的歷史，可潤肺補虛、活絡(luò)強筋，民間用于治療肺虛咳嗽、慢性肝炎、風濕麻痹、肺結(jié)核等癥[4-10]。牛大力主要分布于福建、湖南、廣東、廣西、海南、貴州等地[11]。藥用植物牛大力作為一種藥食兼具的中藥資源，備受青睞，需求與日俱增，其資源的利用和開發(fā)具有廣闊的前景[12-13]。多年來，由于過度采挖，野生牛大力資源瀕臨枯竭，發(fā)展牛大力的繁育種植技術(shù)尤為迫切[14]。近些年，牛大力的人工種植面積不斷擴大[15]，目前產(chǎn)區(qū)主要通過種子育苗擴大種植，但由于牛大力種子顏色差異大，且種子發(fā)芽率不理想，在一定程度上影響了牛大力種苗的培育。牛大力種子發(fā)芽率相對較低，發(fā)芽不整齊，很大程度上增加了育苗成本，進而影響了牛大力藥用價值的充分開發(fā)利用[14,16]。為此，開展牛大力種子基本特性及不同外源物質(zhì)處理對牛大力種子萌發(fā)的影響，探明牛大力種子萌發(fā)的最佳條件，以期為牛大力規(guī)范化、規(guī)?；N植的優(yōu)良種苗獲得提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

牛大力種子來自江蘇省宿遷市沭陽縣顏集鎮(zhèn)。通過對牛大力種子顏色進行分級處理，得到三類，分別為黑色牛大力種子、淺棕色牛大力種子、深棕色牛大力種子。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗設(shè)計

種子前處理：將牛大力種子洗凈后，用0.1%HgCl2消毒10 min左右，用無菌水清洗5次瀝干備用。

不同萌發(fā)床下萌發(fā)試驗：將前處理后種子用常溫水浸泡24 h后撈出瀝干備用。將種子播于分別鋪有濾紙、紗布、棉花的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度統(tǒng)一設(shè)置為23 ℃。6 d后開始觀察記錄萌發(fā)情況，芽點露白即為萌發(fā)，每3 d記錄1次數(shù)據(jù)，計算牛大力種子萌發(fā)率和萌發(fā)勢。

不同濃度梯度GA處理萌發(fā)試驗：用0，50，100，150，200，250 mg·L-1的濃度梯度(分別以GA0，GA50，GA100，GA150，GA200，GA250表示)浸泡處理后的種子24 h左右后取出瀝干，點播于紙床培養(yǎng)皿上，置于23 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 d后觀察記錄萌發(fā)情況并記錄數(shù)據(jù)，每3 d記錄1次，計算種子萌發(fā)率和萌發(fā)勢。

不同濃度梯度中性單鹽處理萌發(fā)試驗：設(shè)定Na+濃度梯度為0，10，30，50，70，90 mmol·L-1，其中0 mmol·L-1即為蒸餾水對照組。將前處理種子點播于紙床培養(yǎng)皿中，加入相應(yīng)的Na+濃度梯度鹽溶液置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設(shè)置為23 ℃。6 d后觀察記錄萌發(fā)情況，每3 d記錄1次，計算種子萌發(fā)率和萌發(fā)勢。

不同濃度梯度外源SNP處理萌發(fā)試驗：根據(jù)表1，首先用相對應(yīng)的SNP濃度浸泡種子24 h后，置于23 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其中培養(yǎng)皿中的紙床按照下表1中的數(shù)據(jù)加入Na+。6 d后觀察記錄萌發(fā)情況，每3 d記錄1次。計算種子萌發(fā)率和萌發(fā)勢。

表1 不同濃度梯度外源SNP處理實驗

處理NaCl/(mmol·L-1)SNP/(mmol·L-1)空白對照00鹽對照700.00 處理1700.02 處理2700.04 處理3700.06 處理4700.08 處理5700.10 處理6700.12

1.2.2實驗方法

千粒重測定：隨機選取牛大力種子100粒，稱重，計算每粒種子重量。重復進行8次，計算千粒重。

雜質(zhì)率(%)=(雜質(zhì)重量/供試種子重量)×100%；

種子相對含水量=[(測定樣品烘干前重量-測定樣品烘干后重量)/測定樣品烘干前重量]×100%；

種子活力采用紅墨水染色法測定：

種子活力=(供試種子未染色數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

萌發(fā)率(%)=(萌發(fā)終期萌發(fā)種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

萌發(fā)勢(%)=(指定日期內(nèi)種子萌發(fā)數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

1.2.3實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和作圖，并進行數(shù)據(jù)分析，SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛大力種子基本特性

3種不同顏色牛大力種子的平均含水量差異不顯著。淺棕色牛大力種子含水量最高，達13.13%；其次是黑色牛大力種子，含水量為13.11%；含水量最低的是深棕色牛大力種子，為12.29%。

由表2可見，黑色牛大力種子的千粒重極顯著高于淺棕色和深棕色種子千粒重，而淺棕色與深棕色的千粒重差異不顯著；黑色牛大力種子的千粒重為163.12 g；淺棕色牛大力種子的千粒重平均為146.41 g；深棕色牛大力種子千粒重平均為140.28 g。

3種不同顏色牛大力種子的平均活力差異不顯著。黑色牛大力種子平均活力為91.67%；淺棕色牛大力種子平均活力較高，達96.67%；深棕色牛大力種子平均活力為95.0.%?？梢姡?種不同顏色牛大力種子的平均活力均達到了90%以上，牛大力種子顏色越淺，種子活力越高。

表2 牛大力種子雜質(zhì)率測定結(jié)果

牛大力種子顏色含水量/%千粒重/g種子活力/%黑色13.11±0.066aA163.12±2.64aA91.67±0.91aA淺棕色13.13±0.067aA146.41±2.38bB96.67±0.96aA深棕色12.29±0.062aA140.28±1.95bB95.00±0.95aA

2.2 牛大力種子萌發(fā)

2.2.1不同萌發(fā)床對牛大力種子萌發(fā)的影響

用深棕色牛大力種子進行不同萌發(fā)床對種子萌發(fā)影響的試驗研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種不同萌發(fā)床處理下種子的萌發(fā)率差異并不顯著，其中萌發(fā)率最高的是布床，達96.56%，最低的為紙床，萌發(fā)率為94.33%。牛大力種子在紙床下的萌發(fā)勢顯著低于在布床與棉床下的萌發(fā)勢，萌發(fā)勢最高的是布床，達76.41%，其次是棉床(75.00%)，紙床處理下的萌發(fā)勢最低；牛大力種子在布床與棉床下的萌發(fā)勢差異不顯著。

表3 不同萌發(fā)床試驗牛大力種子的萌發(fā)率與萌發(fā)勢

不同萌發(fā)床萌發(fā)率/%萌發(fā)勢/%紙床94.33±0.011aA50.58±0.024bA布床96.56±0.009aA76.41±0.099aA棉床94.44±0.014aA75.00±0.044aA

2.2.2不同濃度梯度GA處理對牛大力種子萌發(fā)的影響

用3種顏色牛大力種子進行不同濃度梯度GA處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑色牛大力種子在GA50、GA100、GA150、GA250處理下的萌發(fā)率顯著的高于對照，但是GA200處理下的黑色牛大力種子的萌發(fā)率與對照的差異不顯著，不同濃度梯度GA各處理黑色牛大力種子的萌發(fā)率差異不顯著；其中GA250處理下的萌發(fā)率最高，達85.51%，其次是GA50處理(84.71%)萌發(fā)率最低的是對照組，為76.49%。

淺棕色牛大力種子在不同濃度梯度GA各處理下的萌發(fā)率均極顯著高于空白對照組，而不同濃度梯度GA各處理之間的差異不顯著；其中GA50處理下的萌發(fā)率最高，達94.93%，萌發(fā)率最低的是空白對照組，為69.60%。

深棕色牛大力種子在GA50、GA150、GA200、GA250處理下的萌發(fā)率顯著高于空白對照組，且在GA50、GA150處理下的萌發(fā)率極顯著高于空白對照組，而在GA100處理下的萌發(fā)率與空白對照組的萌發(fā)率差異不顯著；其中GA150處理下的萌發(fā)率最高，達90.91%，其次是GA50，為90.82%，其它各處理均低于90.00%；萌發(fā)率最低的是對照組，為65.22%。

表4 不同濃度梯度GA處理下牛大力種子萌發(fā)率(%)

GA濃度/(mg·L-1)黑色種子淺棕色種子深棕色種子ck76.49±0.052bA69.60±0.057bB65.22±0.024bB5084.71±0.024aA94.93±0.009aA90.82±0.02aA10081.63±0.030aA85.46±0.050aA78.20±0.062abAB15081.32±0.018aA90.71±0.010aA90.91±0.025aA20079.40±0.070abA88.56±0.012aA79.85±0.066aAB25085.51±0.038aA86.09±0.030aA81.67±0.042aAB

不同濃度梯度GA處理黑色牛大力種子的萌發(fā)勢的差異不顯著，空白對照組的萌發(fā)勢最高，其萌發(fā)勢為16.14%，萌發(fā)勢最低的是GA200處理，僅為7.80%。

表5 不同濃度梯度GA處理下牛大力種子萌發(fā)勢

GA濃度/(mg·L-1)黑色種子淺棕色種子深棕色種子ck16.14±0.074aA26.93±0.043aA10.41±0.041cB5014.05±0.025aA32.22±0.031aA32.78±0.081aA10011.40±0.055aA18.89±0.031aA24.78±0.016abAB1509.47±0.024aA24.25±0.026aA31.67±0.017aA2007.80±0.024aA33.42±0.122aA17.86±0.014bcAB2509.04±0.020aA25.20±0.044aA23.33±0.010abAB

不同濃度梯度GA處理淺棕色牛大力種子萌發(fā)勢的差異不顯著，其中GA200處理下的萌發(fā)勢最高，為33.42%，萌發(fā)勢最低的是GA100處理，為18.89%。

深棕色牛大力種子在GA50、GA100、GA150、GA250處理下的萌發(fā)勢顯著高于空白對照，GA200處理下的萌發(fā)勢顯著低于其他處理，GA50、GA150處理下的萌發(fā)勢極顯著的高于空白對照組；其中GA50處理下的萌發(fā)勢最高，其萌發(fā)勢為32.78%，萌發(fā)勢最低的是對照組,僅為10.41%。

2.2.3中性單鹽脅迫對牛大力種子萌發(fā)的影響

用深棕色牛大力種子進行中性單鹽(NaCl)脅迫試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對照與Na 10處理下種子的萌發(fā)率差異不顯著，試驗組Na 10、Na 30、Na 50各處理間種子的萌發(fā)率差異也不顯著，而Na 30、Na 50、Na 70、Na 90處理的萌發(fā)率與空白對照組的萌發(fā)率達到顯著水平，Na 70、Na 90處理下的萌發(fā)率極顯著低于空白對照，Na 90處理下的萌發(fā)率均極顯著低于其它各處理；不同濃度中性單鹽(NaCl)脅迫下的萌發(fā)率隨著NaCl濃度的升高而降低，當Na+濃度為90 mmol·L-1時，其萌發(fā)率比Na+濃度分別為0，10，30，50 mmol·L-1和70 mmol·L-1的處理降低了24.40%、18.98%、16.21%、16.09%、9.10%，說明中性單鹽(NaCl)對牛大力種子的萌發(fā)率有一定的抑制作用。

由表6可知，空白對照牛大力種子的萌發(fā)勢均顯著高于各處理，而Na 90處理下的萌發(fā)勢均顯著低于其它各處理，試驗組中Na 30、Na 50、Na 70、Na 90處理下牛大力種子的萌發(fā)勢均極顯著低于空白對照；牛大力種子在不同濃度中性單鹽(NaCl)脅迫下的萌發(fā)勢同樣隨著NaCl濃度的升高而降低，對照組的萌發(fā)勢最高，各NaCl濃度處理的萌發(fā)勢均比對照低，說明中性單鹽(NaCl)對深棕色牛大力種子的萌發(fā)勢具有抑制作用。

表6 中性單鹽(NaCl)脅迫對萌發(fā)率與萌發(fā)勢的影響

NaCl濃度/(mmol·L-1)萌發(fā)率/%萌發(fā)勢/%ck94.69±0.010aA69.18±0.088aA1089.27±0.006abA48.02±0.032bAB3086.50±0.009bAB39.69±0.036bcBC5086.38±0.026bAB35.90±0.070bcBC7079.39±0.039cB29.16±0.042cdBC9070.29±0.011dC18.08±0.028dC

2.2.4外源SNP處理對牛大力種子萌發(fā)的影響

用3種顏色牛大力種子進行不同濃度梯度外源SNP處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑色牛大力種子在Na+鹽對照組的萌發(fā)率顯著低于空白對照，不同濃度梯度外源SNP處理下種子的萌發(fā)率除了SNP 0.06與Na+鹽對照組處理下的萌發(fā)率差異不顯著外，其他各處理的萌發(fā)率均顯著高于Na+鹽對照組，其中空白對照組、SNP 0.02、SNP 0.04、SNP 0.08、SNP 0.10、SNP 0.12處理下黑色牛大力種子的萌發(fā)率極顯著高于Na+鹽對照組；不同濃度梯度外源SNP處理下種子的萌發(fā)率均比Na+鹽對照組的高，SNP處理試驗組中萌發(fā)率最高的是SNP 0.02，萌發(fā)率達94.54%，比Na+鹽對照組高了15.53%。

淺棕色牛大力種子在Na+鹽處理下的萌發(fā)率極顯著低于空白對照，不同濃度梯度外源SNP各處理牛大力種子的萌發(fā)率除了SNP 0.12處理下的萌發(fā)率與Na+鹽處理下的萌發(fā)率差異不顯著外，其它均顯著高于Na+鹽處理，其中空白對照組、SNP 0.02、SNP 0.04、SNP 0.08處理下淺棕色牛大力種子的萌發(fā)率極顯著的高于Na+鹽；SNP 0.12處理下的萌發(fā)率與SNP 0.04處理、空白對照組的萌發(fā)率差異顯著；不同濃度梯度外源SNP處理下淺棕色牛大力種子的萌發(fā)率均比Na+鹽對照組的高，SNP各處理萌發(fā)率最高的是SNP 0.04，達94.82%，比Na+鹽對照組高了16.49%。

深棕色牛大力種子Na+鹽對照組的萌發(fā)率極顯著低于其它處理，不同濃度梯度外源SNP處理中SNP 0.02、SNP 0.04、SNP 0.06、SNP 0.08、SNP 0.10處理下種子的萌發(fā)率差異不顯著，不同濃度梯度外源SNP 0.08、SNP 0.12處理下的萌發(fā)率顯著低于空白對照組；不同濃度梯度外源SNP處理下種子的萌發(fā)率均比Na+鹽對照組的高，不同濃度梯度外源SNP處理萌發(fā)率最高的是SNP 0.04，萌發(fā)率達94.36%，比Na+鹽對照組高了23.04%。

表7 外源SNP處理下牛大力種子萌發(fā)率

SNP濃度/(mmol·L-1)黑色種子淺棕色種子深棕色種子ck94.69±0.007aA95.56±0.003aA94.93±0.014aANa7079.01±0.028bB78.33±0.044cB71.32±0.027dC0.0294.54±0.032aA91.40±0.017abA91.07±0.014abcAB0.0493.07±0.018aA94.82±0.030aA94.36±0.005abAB0.0686.49±0.033abAB89.63±0.004abAB93.78±0.015abAB0.0891.22±0.035aA91.67±0.044abA89.27±0.015bcAB0.1092.36±0.018aA90.00±0.000abAB92.22±0.011abcAB0.1290.72±0.019aA85.00±0.029bcAB87.47±0.016cB

3種顏色牛大力種子進行不同濃度梯度外源SNP處理，從萌發(fā)勢上分析，黑色牛大力種子在Na+鹽對照組處理下的萌發(fā)勢顯著低于空白對照，不同濃度梯度外源SNP處理下黑色牛大力種子的萌發(fā)勢除了SNP 0.08、SNP 0.10與Na+鹽對照組萌發(fā)勢差異不顯著外，其它各處理的萌發(fā)勢均顯著高于Na+鹽對照組，其中空白對照組、SNP 0.02、SNP 0.04的萌發(fā)勢均極顯著高于Na+鹽對照組；不同濃度梯度外源SNP處理下黑色牛大力種子的萌發(fā)勢均比Na+鹽對照組的高，其中空白對照組的平均萌發(fā)勢最高，達69.18%，SNP處理中平均萌發(fā)勢最高的是SNP 0.02，為46.50%。

不同濃度梯度外源SNP處理淺棕色牛大力種子的萌發(fā)勢差異不顯著，外源SNP各處理種子的萌發(fā)勢均比Na+鹽對照組的高，其中空白對照組的平均萌發(fā)勢最高，達到了48.14%，SNP處理各處理萌發(fā)勢最高的是SNP 0.04，為45.00%，比Na+鹽對照組高了16.67%。深棕色牛大力種子Na+鹽對照組的萌發(fā)勢極顯著低于各處理，其空白對照組、SNP 0.02、SNP0.04、SNP 0.06、SNP 0.08、SNP 0.10、SNP 0.12處理下深棕色牛大力種子的萌發(fā)勢差異不顯著；不同濃度外源SNP處理下深棕色牛大力種子的萌發(fā)勢均比Na+鹽對照組的高，其中SNP 0.02組的平均萌發(fā)勢最高，達到了58.33%，比Na+鹽對照組高了32.35%，Na+鹽對照組的萌發(fā)勢最低。

表8 外源SNP處理下牛大力種子萌發(fā)勢

SNP濃度/(mmol·L-1)黑色種子淺棕色種子深棕色種子ck47.18±0.013aA48.14±0.026aA56.41±0.014aANa7020.70±0.062bB28.33±0.159aA25.98±0.061bB0.0246.50±0.033aA33.33±0.088aA58.33±0.035aA0.0445.53±0.071aA45.00±0.076aA50.27±0.023aA0.0640.79±0.079aAB36.67±0.044aA49.10±0.066aA0.0833.21±0.028abAB33.33±0.033aA45.29±0.044aA0.1033.33±0.111abAB41.67±0.073aA54.44±0.011aA0.1238.30±0.059aAB30.00±0.050aA55.71±0.016aA

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

不同顏色牛大力種子含水量差異不大，黑色牛大力種子千粒重最大，與淺棕色和深棕色種子差異達到極顯著水平；牛大力種子隨著顏色變深，種子活力逐漸降低。

不同萌發(fā)床對深棕色牛大力種子萌發(fā)率的影響不大，在3種萌發(fā)床上深棕色牛大力種子的萌發(fā)率均達94%以上，其中萌發(fā)率最高的是布床，達96.56%；不同萌發(fā)床的處理下萌發(fā)勢差異不顯著，萌發(fā)勢最高的是布床，為76.41%。

不同濃度梯度GA處理下黑色牛大力種子在GA250處理下的萌發(fā)率最高，達到了85.51%，其次是GA50處理下的萌發(fā)率(84.71%)；淺棕色牛大力種子的萌發(fā)率最高的是GA50處理下的萌發(fā)率,達94.93%；深棕色牛大力種子的萌發(fā)率最高的是GA150處理下的萌發(fā)率，為90.91%，與GA150處理下的萌發(fā)率最接近的是GA50，平均萌發(fā)率達90%以上。

在中性單鹽(NaCl)脅迫處理下，深棕色牛大力種子萌發(fā)率隨著中性單鹽(NaCl)濃度的升高而降低，萌發(fā)勢與萌發(fā)率變化趨勢相同，說明中性單鹽(NaCl)對深棕色牛大力種子的萌發(fā)率與萌發(fā)勢均具有抑制作用。

3.2 討 論

SNP是一種常用的外源NO供體，NO作為一種信號分子和活性氧清除劑，能調(diào)節(jié)植物對生物和非生物脅迫的適應(yīng)及反應(yīng)[17]。湯紹虎等研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol·L-1SNP可以顯著促進滲透脅迫下黃瓜種子的萌發(fā)和幼苗生長[17]，劉文瑜等研究表明，0.1 mmol·L-1和0.3 mmol·L-1SNP預(yù)處理蒺藜苜蓿種子，可以顯著提高鹽脅迫下種子的萌發(fā)率、萌發(fā)勢、萌發(fā)指數(shù)和活力指數(shù)[18]；本研究表明，牛大力種子的萌發(fā)率與萌發(fā)勢均比Na+鹽對照組的高，說明不同濃度梯度外源SNP具有一定的抗鹽作用；外源SNP的抗鹽效果最佳的濃度為0.02～0.04 mmol·L-1。

姚紹嫦等研究表明，最適宜牛大力種子萌發(fā)的條件是在25 ℃雙層紙床上浸種24 h，并給予適宜光照[19]。黃秋銀等研究表明，清水浸種為較好的牛大力種子處理，種子平均發(fā)芽率達61.25%；河沙為較好的萌發(fā)基質(zhì)，播種后35 d就開始發(fā)芽，種子平均發(fā)芽率達55.00%[20]。段左俊等研究表明，用50 ℃的溫水浸種，以河沙為基質(zhì)播種，在適當光照下能有效提高種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率[21]。蘇鈺琴研究表明，短時高壓電場處理植物種子，可對植物種子發(fā)芽率產(chǎn)生促進或抑制的生物學效應(yīng)[16]。本研究表明，牛大力種子最佳萌發(fā)床是布床，促進牛大力種子萌發(fā)效果最佳的GA濃度是50 mmol·L-1，中性單鹽對牛大力種子的萌發(fā)抑制作用最強的是Na+90 mmol·L-1，外源SNP的抗鹽效果最佳的濃度在0.02～0.04 mmol·L-1。

黑色牛大力種子的重量比深棕色牛大力種子與淺棕色牛大力種子都要高，而且差異達到極顯著水平，并且黑色牛大力種子的活力均比其他2種的要低。在其他處理條件一致的情況下，黑色牛大力種子的萌發(fā)率與萌發(fā)勢較淺棕色牛大力種子和深棕色牛大力種子的要低。關(guān)于牛大力種子種皮顏色、重量對牛大力種子萌發(fā)的研究尚見報道，對于本研究中黑色牛大力種子萌發(fā)率與萌發(fā)勢均比另外2種低的現(xiàn)象，原因可能是黑色牛大力種子種皮比較硬而導致的，也可能是其他生理生化指標的不同而引起的。牛大力種子種皮不同顏色的生理生化指標對牛大力種子萌發(fā)率與萌發(fā)勢的研究是一個新的探索，其相關(guān)深層機理還有待于進一步研究。