鱟血細胞之鱟素Tachyplesin I對水產(chǎn)常見病原菌之抑菌作用

高德友,鄭學淵

摘要：鱟的血淋巴中所存在的鱟素（tachyplesin）為抗菌肽的一種，本研究使用中國鱟（Tachypleus tridentatus）為研究材料，自鱟血細胞中以高效液相層析儀萃取鱟素，并利用電泳分析測定其分子量，確定所萃取蛋白質為鱟素，以之進行水產(chǎn)常見病原的抗菌試驗，希望作為未來新藥開發(fā)以及運用生物技術防范病害的可能。以不同濃度的鱟素進行細菌的抗菌試驗，發(fā)現(xiàn)鱟素有顯著的抗菌效果。在低濃度鱟素處理組中（1及2 μg/ml），24小時內(nèi)各細菌間之活存率沒有顯著差異（<0.05），鱟素對于Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Lactococcus garvieae 以及 Photobaterium damselae之半致死劑量（LD50）分別為7.31 μg/mL、13.26 μg/mL、15.27 μg/mL及6.68 μg/mL。以50 μg/mL鱟素加入菌液經(jīng)過24小時后，V. alginolyticus、A. hydrophila、L. garvieae及P. damselae之活存率分別只有5.8%、11.6%、18.9%及3.2%，顯示鱟素對于上述細菌具有一定的抑菌作用。

關鍵詞：鱟;鱟素;抑菌作用;抑菌肽

中圖分類號：Q2-3 ? ?文獻標識碼：A

抗菌肽（antimicrobial peptides， AMPs）廣泛分布在許多的生物體中，在如蜜蜂（Apis melliferal） 刺裡的毒液中所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽-melittins [1]、比目魚（Pleuronectes americanus）中所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽-pleurocidin [2]、植物wheat seeds中所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽-purothionins [3]，甚至在人類的嗜中性白血球 （neutrophils）、單核球細胞（monocyte）及T淋巴球細胞 （T lymphocyte） 中所發(fā)現(xiàn)的抗菌肽-LL-37 [4]，都可以發(fā)現(xiàn)到抗菌肽的存在。

抗菌肽的研究大約是由80年代開始興起。Hultmark等人[5]由天蠶（Hyalophora cecropia）中分離純化得到具有抗菌性的多肽鏈-cecropin后，學者便相繼由細菌、昆蟲、植物、哺乳動物甚至人類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)到抗菌勝肽的存在。目前所發(fā)現(xiàn)的抗菌勝肽已有800多種?？咕目山逵善浣Y構區(qū)分為雙性和疏水性螺旋肽 （amphipathic and hydrophobic α-helices）、β-褶板肽及較小的蛋白質 （β-Sheet peptides and small proteins）以及擁有特殊胺基酸組成的抗菌勝肽等[6]。

鱟素（tachyplesin）為含有17個胺基酸的β-褶板肽，分子量約為2.36 kDa。鱟素具有抑菌作用，另外對于部分真菌如Candida albicans [7]，以及對于腫瘤細胞亦有抑制的效果[8]。過去對抗細菌多使用抗生素，造成細菌對抗生素的抗藥性正快速增加，而對抗此一現(xiàn)象的方法以天然型態(tài)的抗菌肽最有潛力。

近年來水產(chǎn)養(yǎng)殖出現(xiàn)大量細菌性疾病，造成在魚介貝類養(yǎng)殖的重大損失，本研究以中華鱟（Tachypleus tridentatus）為材料，取其血細胞進行培養(yǎng)，收集其鱟素進行水產(chǎn)養(yǎng)殖常見之病原菌如Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Lactococcus garvieae以及 Photobaterium damselae之抗菌試驗，以了解鱟素對上述菌的抑菌作用，希望做為未來水產(chǎn)新藥開發(fā)以及運用生物技術防范病害的可能，因此抗菌勝肽的研究在目前醫(yī)學的發(fā)展及疾病的控制中是刻不容緩的課題。

1 ?材料與方法

1.1 ?鱟的來源與畜養(yǎng)

鱟收購后先蓄養(yǎng)于檢疫預備槽，經(jīng)用淡水沖洗污泥，并進行消毒去除寄生蟲后再移入蓄養(yǎng)池，蓄養(yǎng)兩周后可進行抽血，蓄養(yǎng)環(huán)境底部放置細沙，并以過濾后之海水進行蓄養(yǎng)，蓄養(yǎng)其間每兩天投喂一次解凍的生餌，包括下雜鮮魚、小卷、烏賊、牡蠣及帶殼蝦子做為飼料。

1.2 ?鱟血淋巴抽取

抽血所使用的玻璃器皿，先以界面活性劑清洗后，用超音波震蕩清洗一小時，經(jīng)二次蒸餾去離水沖洗后、瀝干，以鋁箔紙包好于180℃干熱滅菌4小時后備用。采血部位為后頭胸甲部與腹甲部交接關節(jié)韌帶中央，采血時先將腹甲固定，將頭胸甲與腹甲間關節(jié)曲折并固定，使鱟不易掙脫。采血部位先以優(yōu)碘及70%酒精的棉棒消毒，代表面干后，以1 1/2” 18G無熱原針頭穿透韌帶膜即可達后圍心腔進行采血。采取之血液與抗凝血劑均勻混合，在注入無熱原離心管中，進行離心。

細胞培養(yǎng)皿先以0.1 mg/mL 之poly-L-lysine進行涂抹，在直徑100 ㎜及150 ㎜的細胞培養(yǎng)皿中放入poly-L-lysine，半小時后回收使用并用無菌水清洗兩次，放置于無菌操作臺內(nèi)烘干即可，以利細胞黏著。細胞培養(yǎng)液的配方以DMEM為主酸堿值調整至7.4，將鱟血細胞培養(yǎng)在直徑150 mm的細胞培養(yǎng)皿，置于37℃，10% CO2/90%air，濕度100%的培養(yǎng)箱（incubator）進行培養(yǎng)，每隔二至三天更換新培養(yǎng)液。培養(yǎng)皿已事先覆蓋一層poly-L-lysine，繼代培養(yǎng)（passage）的時候使用trypsin-EDTA（0.05%（w/v） trypsin， 0.5 mM EDTA， pH 7.4）以分散鱟血細胞。

1.3 ?鱟素萃取

將鱟血細胞經(jīng)超音破震碎機震碎后稀釋至適當倍數(shù)，在離心機上以10300 g離心30分鐘，取其上清液通過0.22 μm的過濾膜過濾后，注入高效液相層析儀（high-performance liquid chromatography）中，以高壓幫浦將A緩沖溶液（20 mmol/l Tris-HCl）與B緩沖溶液（20 mmol/l Tris-HCl，0.5 M NaCl）以0.5 mL/min的流速打入DEAE-Sepharose管柱中，并連接紫外光檢測器與電化學檢測器進行鱟素分離與萃取，并收集鱟素測定蛋白質濃度。

取protein assay kit（Bio-Rad， No.500-0006）稀釋5倍，取稀釋液5 mL加入稀釋至適當倍數(shù)之血淋巴0.1 mL，在分光亮度計上以波長595 nm測定其吸光值，并以BSA（bovine serum albumin， 66 kDa， Sigma）做為蛋白標準以換算萃取鱟素的蛋白質濃度。自HPLC分液收集器收集鱟素后，取鱟素10 μg加入sample buffer （1% SDS，1% 2-mercapto-ethanol， 10 mM pH 6.8 Tris buffer，1% bromophenol blue） 以12.5% SDS-PAGE進行電泳分析，電泳架設完成后，將膠體通以電流10 mA，20分鐘后再將電流改為15 mA直至bromophenol blue跑出膠體外即切斷電源。將膠體取出后以染色劑（2.5% coomassi brilliant blue溶于50% methanol及10% acetic acid）進行染色40分鐘后，以脫色劑 （25% methanol及7% acetic acid）進行脫色直至背景顏色消失為止，膠片以電泳膠片掃描機掃描后分析其分子量以確定收集之蛋白質為鱟素。

1.4 ?鱟素抗菌試驗

調配鱟素濃度至0（control）、1 μg/mL、2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL于含有50 mL NB液態(tài)培養(yǎng)基之錐形瓶中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，分別以轉速150 rpm 震蕩培養(yǎng)24小時及48小時。培養(yǎng)后將菌液以6， 000 ×g，4℃離心10分鐘，取上清液，隨即進行4種病原菌之抑菌實驗，本抑菌試驗所用之菌株分別為Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Photobaterium damselae以及Lactococcus garvieae。

將上述4種病原菌分別接種于鹽度34‰之tryptic soy broth （TSB）液態(tài)培養(yǎng)基，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24小時。將病原菌之濃度調整為109 cfu/mL，取100 μL之菌液，涂盤于TSA固態(tài)培養(yǎng)基上 （使成每片plate有108 cfu） 各處理組進行5重復分析。經(jīng)24小時后，測定細菌數(shù)并記錄。

所得細菌活存率以SAS軟件進行單因子變異數(shù)分析（one-way ANOVA table），檢驗樣本之間是否具有顯著差異，顯著水平設為p<0.05。

2 ?結果

鱟血淋巴以HPLC分析后，以分液收集器收集其流洗液，發(fā)現(xiàn)鱟素出現(xiàn)在28-31分鐘之流洗區(qū)段（圖1）。收集流洗液后以SDS-PAGE電泳分析其分子量，確定其分子量約為2.36 kDa，以確定為鱟素（圖2）。

將鱟素進行抗菌試驗的結果中，分現(xiàn)在24小的培養(yǎng)后，低濃度鱟素（1 μg/mL、2 μg/mL） 的試驗組中﹐各細菌的活存率在統(tǒng)計上沒有顯著的差別（p>0.05）。在5 μg/mL的試驗組中，在V. alginolyticus、A. hydrophila、P. damselae以及L. garvieae之活存率分別只有控制組的64.8%、75.3%、57.3%及81.5%。在50 μg/mL之試驗組中，經(jīng)果24小時后，發(fā)現(xiàn)于V. alginolyticus及P. damselae 之活存率更只剩下5.8及3.2%，明顯低于A. hydrophila及L. garvieae的11.6及18.9% （p<0.05）。因此鱟素對于本研究所設定之四種細菌均有抑菌能力（圖3）。

鱟素對于V. alginolyticus、A. hydrophila、P. damselae 及L. garvieae之半致死劑量（LD50） 95%置信區(qū)間分別為7.31±1.04 μg/mL、13.26±2.05 μg/mL、6.68±1.13 μg/mL及15.27±2.18 μg/mL。

3 ?討論

鱟有活化石之稱，目前全世界的鱟共有四種，分別為中國鱟（T. tridentatus）、南方鱟（T. gigas）、圓尾鱟（Carcinoscorpius rotundicauda）及美洲鱟（Limulus polyphemus），本研究所使用的中國鱟主要分布于日本南方沿海及中國長江以南，包括浙江、福建、廣東、廣西、海南及臺灣西部沿海之潮間帶。

鱟之血淋巴細胞中所含的鱟素（tachyplesin I）是一個含有17個胺基酸以及兩個雙硫鍵的肽，現(xiàn)存的四種鱟中均可發(fā)現(xiàn)。本研究將鱟血淋巴取出后，以高效液相層析儀經(jīng)DEAE-Sepharose管柱分離鱟素，收集28～31分鐘之流洗液，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后，測定其主要蛋白質之分子量約為2.36 kDa，與其他文獻所提及之鱟素相同，因此本研究所萃取之主要蛋白質應為鱟素。

近幾年，養(yǎng)殖魚蝦類大量死亡，本研究想要了解鱟素對于常見水產(chǎn)疾病的病原菌的抑菌作用，弧菌屬的細菌性疾病是最早被發(fā)現(xiàn)在水產(chǎn)養(yǎng)殖病原菌之一，常見于河口、半淡咸水、海水養(yǎng)殖及野生生物中[9][10]。海水的弧菌種類繁多，其中可引起蝦類疾病產(chǎn)生的約有6～7種，這些弧菌會產(chǎn)生大量的外毒素侵襲蝦體，引發(fā)蝦體組織細胞病變，進而引起蝦只急性及慢性死亡。且環(huán)境長期受到有機或無機物質的污染，或病原菌的大幅增長，這些因素都構成蝦類病變死亡，且是主要導致養(yǎng)蝦業(yè)經(jīng)營困難的原因。

溶藻弧菌Vibrio alginolyticus 最早出現(xiàn)在以色列的鯛類（Sparus aurata）養(yǎng)殖中[11]，之后發(fā)現(xiàn)在海水烏魚（mugil cephalus）的紅斑癥，也會感染蝦類早成細胞和溶解及肝胰臟周圍結締組織的空洞化[12]。V. alginolyticus是海洋弧菌中的格蘭氏陰性菌，此一弧菌可能造成在身體末端的傷口感染，不但造成傷口感染，還會造成軟組織及耳感染。另外，在人身上V. alginolyticus會引起中耳炎、外耳炎、結膜炎及傷囗感染，有時引起敗血癥，在人體有傷口或是免疫力降低時才會發(fā)病 [13]。

親水性產(chǎn)氣單孢菌A. hydrophila為革蘭氏陰性桿菌，因具有極性的單鞭毛，使其具有移動性，屬于人畜共通病原菌，亦是主要的水生病原菌之一[14][15]。感染魚類后之典型病征為體表及魚鰭基部潰爛及產(chǎn)生出血性敗血癥、腹水，并造成脾及腎臟等造血組織壞死[16]。

P. damselae屬于革蘭氏陽性菌，生存的棲息地大多數(shù)位于熱帶海洋近海沿海海岸附近，造成海洋動物的死亡而且它存在于到處有海洋魚類的環(huán)境中高溫期較易發(fā)生也就會導致海洋（熱帶）魚類的皮膚潰爛或者有其他多樣化的疾病產(chǎn)生例如腸胃道疾病進而導致漁業(yè)經(jīng)濟上的損失[17]。L. garvieae為鏈球菌的一種，屬于革蘭氏陽性菌，亦是人畜共通菌[18]。L. garvieae 最早由杜氏鰤Seriola dumerili中分離，罹病魚只會有體色變暗、凸眼、腹部澎大及眼睛出血的癥狀，在鰓蓋及魚鰭的基部會有出血的現(xiàn)象，腹部有積水及出血等癥狀[19][20]。受L. garvieae感染的淡水長臂大蝦（Macrobrachium rosenbergii），全身肌肉組織呈現(xiàn)會死病灶[21]。

抑菌肽普遍存在于動物和植物中的先天性免疫系統(tǒng)中[22][23]。抑菌肽對于細菌的抑菌效果顯著，開發(fā)天然抑菌肽對于細菌抑制及新藥開發(fā)具有相當幫助，并且可以大幅度降低對抗生素的依賴。結構相連的兩個雙硫鍵讓鱟素可以在低pH及高溫中仍然可以維持穩(wěn)定[7]，鱟素（tachyplesin I）在細菌的細胞膜上形成環(huán)形的孔洞，進而造成細菌死亡[24]。

鱟素濃度50 μg/mL之試驗組中，經(jīng)果24小時后，發(fā)現(xiàn)于V. alginolyticus及P. damselae之活存率只剩下5.8%及3.2%，顯著低于A. hydrophila、L. garvieae的11.6%及18.9%，此一結果可發(fā)現(xiàn)鱟素對于V. alginolyticus及P. damselae之抑菌效果明顯高于A. hydrophila及L. garvieae，此一結果可能與細菌之細胞壁與其細胞外產(chǎn)物之組成有關。

本研究中在低濃度的鱟素抑菌實驗組（1 μg/mL及2 μg/mL），在四種細菌間沒有顯著的差異，鱟素對于V. alginolyticus、A. hydrophila、P. damselae及L. garvieae之24小時之半致死劑量分別為7.31 μg/mL、13.26 μg/mL、6.68 μg/mL及15.27 μg/mL，顯示鱟素對格蘭氏陰性菌之抑菌效果除產(chǎn)氣單胞菌外較革蘭氏陽性菌效果為大，但是其造成原因以及抑菌機制還需要進一步研究闡明。

參考文獻

[1]Steiner， H.， Hultmark， D.， Engstrom， A.， Bennich， H. and Boman， H.G.， 1981. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. Nature 292：246-248.

[2] Cole， A.M.， Weis， P. and Diamond， G.， 1997. Isolation and characterization of pleurocidin， an antimicrobial peptide in the skin secretions of winter flounder. Journal of Biological Chemistry. 272：12008-13.

[3] Fernandez de Caleya， R.， Gonzalez-Pascual， B.， Garcia-Olmedo， F. and Carbonero， P.， 1972. Susceptibility of phytopathogenic bacteria to wheat purothionins in vitro. Applied Microbiology. 23：998-1000.

[4] Frohm， M.， Agerberth， B.， Ahangari， G.， Stahle-Backdahl， M.， Liden， S.， Wigzell， H. and Gudmundsson， G.H.， 1997. The expression of the gene coding for the antibacterial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during inflammatory disorders. Journal of Biological Chemistry. 272： 15258-63.

[5] Hultmark， D.， Steiner， H.， Rasmuson， T. and Boman， H.G.， 1980. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia. European. Journal of Biochemistry. 106：7-16.

[6] Epand， R.M. and Vogel， H.J.， 1999. Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochimica et Biophysica Acta. 1462：11-28.

[7] Nakamura， T.， Furunaka， H.， Miyata T.， Tokunaga， F.， Muta， T. and Iwanaga， S.， 1988. Tachyplesin， a class of antimicrobial peptide from the hemocytes of the horseshoe crab （Tachypleus tridentatus）. Isolation and chemical structure. Journal of Biological Chemistry. 263（32）：16709-13.

[8] Chen， J.， Xu， X.M.， Underhill， C.B.， Yang， S.， Wang， L.， Chen， Y.， Hong， S.， Creswell， J. and Zhang， L.， 2005. Tachyplesin Activates the Classic Complement Pathway to Kill Tumor Cells. Cancer Research. 65：4614-4622.

[9] Egidius， E.， 1987. Vibriosis： Pathogenicity and pathology. Aquaculture. 67：15-28.

[10]Liu， P.C.， Lee. K.K.， Chen， S.N.， 1996. Pathogenicity of different I. galbanalates of Vibrio hareyi in tiger prawn （Penaeus monodon）. Letters in Applied Microbiology. 22：413-416.

[11]Colorni， A.， Paperna， I.， Gordin， H.， 1981. Bacterial infections in gilthead sea bream Saparus aurata cultured at Elat. Aquaculture. 23：257-267.

[12]Esteve， M.， Herrera， F.C.， 2000. Hepatopancreatic alterations in Litopenaeus vannamei （Boone， 1939）（Crustacea： Decapoda： Penaeidae） experimentally infected with a Vibrio alginolyticus strain. Journal of Invertebrate Pathology. 76：1-5.

[13]H?rmansdorfer， S.， Wentges， H.， Neugebaur-Büchler， K.， and Bauer， J. 2000. Isolation of Vibrio alginolyticus from seawater aquaria. International Journal Hygiene and Environmental Health， 203（2）：169-175.

[14]Jho， Y.， Park， D.， Lee， J.K.， Cha， S. and Han， J.， 2011. Identification of bacteria from the oral cavity and cloaca of snakes imported from Vietnam. Laboratory Animal Research. 27：213-217.

[15]Hudson， J.A.， DeLacy， K.M.， 1991. Incidence of motile Aeromonas in New Zealand retail foods. Journal of Food Prottection. 54：696-699.

[16]Janda， J.M.， Abbort， S.L.， 1998. Evolving concepts regarding the genus Aeromonas： an expanding panorama of species， disease presentation and unanswered questions. Infectious Diseases. 27：332-344.

[17]Thompson， F.L.， Gevers， D.， Thompson， C.C.， Dawyndt， P.， Naser， S.， Hoste， B.， Munn， C.B. and Swings， J.， 2005. Phylogeny and molecular identification of vibrios on the basis of multilocus sequence analysis. Applied and Environmental Microbiology. 71：5107–5115.

[18]Vendrell， D.， Balcázar， J.L.， Ruiz-Zarzuela， I.， de Blas， I.， Gironés， O. and Múzquiz， J.L.， 2006. Lactococcus garvieae in fish： a review. Comparative Immunology， Microbiology & Infectious Diseases. 29（4）：177-198.

[19]Bartham， W. T.， Schoonbee， H.， Smit， G.L.， 1979. The occurrence of Aeromonas and Streptococcus in rainbow trout （Salmo gairdneri）. Journal of Fish Biology. 15：457-460.

[20]Bullock， G.L.， 1981. Streptococcal infections of fishes. United States Department of the Interior， Fish and Wildlife Service， Fish Disease Leaflet. 63：1-7.

[21]Chen， S.C.， Lin， Y.D.， Liaw， L.L.， Wang， P.C.， 2001. Lactococcus garvieae infected in the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii confirmed by polymerase chain reaction and 16s rRNA sequencing. Diseases of Aquatic Organisms. 45：45-52.

[22]Boman， H.G.， 2003. Antibacterial peptides： basic facts and emerging concepts. Journal of Internal Medicine. 254：197-215.

[23]Douglas， S.E.， Gallant， J.W.， Liebscher， R.S.， Dacanay， A. and Tsoi， S.C.， 2003. Identification and expression analysis of hepcidin-like antimicrobial peptides in bony fish. Developmental and Comparative Immunology. 27：589-601.

[24]Imura， Y.， Nishida， M.， Ogawa， Y.， Takakura， Y.， Matsuzaki， K.， 2007. Action mechanism of tachyplesin I and effects of PEGylation. Biochimica et Biophysica Acta. 1768：1160-1169.