絲素肽絡合Ca2+含量影響細胞生長的研究

魏如男 王富平 張媚 陳忠敏

摘要： 研究絲素肽（SFP）絡合Ca2+含量對人正常肝細胞L02生長的影響。采用CaCl2-乙醇-水三元體系制備絲素蛋白（SF），并獲得不同Ca2+含量的SFP后進行相對分子質(zhì)量分級;采用EDTA滴定法測定SFP中Ca2+含量，細胞增殖率評價其細胞毒性，圓二色譜（CD）檢測二級結構。結果表明：隨透析時間（12、24、36h）增加，SFP中Ca2+含量分別為16.00%、9.60%、0.40%，逐漸減小，對L02的生長作用由促進轉變?yōu)橐种?，其中在SFP相對分子質(zhì)量大于8kD時尤為明顯，L02細胞增殖率從（11868%±3.65%）減小到（59.78%±1.70%），對應SFP二級結構中3.43%的α螺旋和5.35%的無規(guī)則卷曲轉變?yōu)棣抡郫B。當SFP應用于組織工程支架領域時，絡合較高Ca2+含量的SFP更有利于細胞的增殖。

關鍵詞： 絲素肽;鈣離子含量;細胞生長作用;相對分子質(zhì)量;二級結構

中圖分類號： R318.08

文獻標志碼： A

文章編號： 1001-7003（2019）03-0007-05

引用頁碼： 031102

Study on the effect of silk fibroin peptide complex Ca2+ content on cell growth

WEI Ru’nan， WANG Fuping， ZHANG Mei， CHEN Zhongmin

（College of Pharmacy and Bioengineering， Chongqing University of Technology， Chongqing 400054， China）

Abstract： The effects of silk fibroin peptide （SFP） complex Ca2+ content on the growth of human normal hepatocyte L02 were studied. The CaCl2-ethanol-water system was used to prepare silk fibroin （SF）， and SFP with different Ca2+ content was obtained. Then， the relative molecular mass of SFP was classified. The content of Ca2+ in SFP was measured by EDTA titration. The cytotoxicity of L02 cells was evaluated by the proliferation rate， and circular dichroism （CD） was used to detect the secondary structure of SFP. The results show that as the time of dialysis （12， 24， 36h） increased， Ca2+ content of SFP （16.00%， 9.60%， 0.40%） gradually decreased， and the growth of L02 changed from promotion to inhibition. Especially when the relative molecular mass of SFP was greater than 8kD， the cell proliferation rate of L02 decreased from （118.68%±3.65%） to （59.78%±1.70%）. In the secondary structure of the corresponding SFP， 3.43% of alpha-helix and 5.35% of irregular curl transformed to beta-folding. In the field of tissue engineering scaffolds， SFP with higher content of complex Ca2+ is more conducive to cell proliferation.

Key words： silk fibroin peptide; Ca2+ content; cell growth; relative molecular mass; secondary structure

收稿日期： 2018-07-05;

修回日期： 2019-01-10

基金項目： 重慶市基礎與前沿研究計劃項目（cstc2014jcyjA10018）

作者簡介： 魏如男（1994），女，碩士研究生，研究方向為生物材料、功能高分子材料。通信作者：陳忠敏，教授，chenzhongmin@cqut.edu.cn

絲素蛋白（silk fibroin， SF）具有緩慢且可控的生物降解性，良好的生物相容性，能促進多種細胞的黏附、生長和增殖，現(xiàn)已廣泛應用于組織工程支架材料[1]。支架材料中SF在體內(nèi)生理環(huán)境下主要通過酶解的方式降解為游離氨基酸和小分子的絲素肽（silk fibroin peptide， SFP）[2]，被細胞新陳代謝利用，對細胞增殖起到了提供營養(yǎng)物質(zhì)的作用[3]，即SFP具有生長因子相似的作用，作為生物材料呈現(xiàn)出較為優(yōu)秀的應用價值。

但是，近年來有一些研究發(fā)現(xiàn)了絲素蛋白生物相容性方面有爭議的一面，如黃慧明等[4]研究發(fā)現(xiàn)SFP可抑制人胰腺癌細胞SW1990生長，Yamada H等[5]發(fā)現(xiàn)SFP可促進成纖維細胞的生長，在其對細胞生長影響方面兩者存在爭議。本課題組也發(fā)現(xiàn)SFP可抑制人肝癌細胞HepG2生長，且存在濃度依賴性[6]，同時，將SFP應用于肝臟組織工程支架中顯示，SFP有促進HepG2細胞生長的作用[7]。分析認為：SFP對細胞生長影響與其結構有關，而SFP由SF酶解獲得，是一種混合物，其結構及其相對分子質(zhì)量大小分布因提取方式、處理（如溫度、pH值變化、有機溶劑處理、金屬離子作用及應力作用等）存在較大差異，從而影響了其對細胞的作用。研究表明：隨著肽段分子鏈的加長，絲素的二級結構中無規(guī)則卷曲減少，α螺旋增加[8]。SF極易受外界條件影響，二級結構易由無規(guī)則卷曲向折疊結構的構象轉變[9]，如甲醇可使SF中的無規(guī)則卷曲或Silk Ⅰ結構向β折疊轉變[10];pH值改變可致絲素蛋白從無規(guī)線團到折疊結構轉變[11]。在采用CaCl2-乙醇-水三元體系再生SF時，隨著時間的延長，Ca2+與SF分子內(nèi)部的氫鍵和范德華力等作用并將其破壞，與絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）側鏈羥基進行配位形成螯合物，致分子構象由β折疊向無規(guī)線團轉變[12]，因此，Ca2+含量不同，SF二級結構存在一定差異。

在SFP制備過程中會大量使用Ca2+，Ca2+可通過透析除去，SFP中Ca2+含量差異與透析時間相關。由于Ca2+絡合作用力和透析的滲透壓平衡，所得SFP中仍然存在一定含量的Ca2+，Ca2+含量與SFP的二級結構存在相關性[13]，同時會影響酶切位點。因此Ca2+含量可能會影響SFP的相對分子質(zhì)量大小分布及其結構，從而導致其對細胞作用存在差異。而相關研究尚未見報道，因此通過對透析時間的控制來獲得不同絡合Ca2+含量的SFP，利用卷式膜將其分為不同相對分子質(zhì)量級別，基于肝臟組織工程中有使用人正常肝細胞作為種子細胞的研究[14]。所以利用L02對其進行細胞毒性評價，并用圓二色譜（circular dichroism， CD）進行二級結構的分析，從而分析SFP絡合Ca2+改變SFP二級結構后對細胞生長作用的影響。

1實驗

1.1材料和試劑

繭殼（重慶市纖維織品檢驗所），卷式膜小型實驗機JM18812-1、卷式超濾膜元件PA-NF-1812，PA-NF8-1812，PES3-1812，PES8-1812（大連屹東膜工程設備有限公司），細胞培養(yǎng)箱（FORMA3111，美國Thermo公司），酶標儀（Multiskan GO，美國Thermo公司），圓二色譜儀（英國APL Chiascan），透析袋（USA進口分裝，標定截留相對分子質(zhì)量MW為8000～14000），中性蛋白酶（酶活力20×104U/g，南寧龐博生物有限公司），人正常肝細胞L02（上海中喬新舟生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、HyClone（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、MTT（北京Solarbio生物科技有限公司），所用試劑Na2HPO4·2H2O、KH2PO4、二甲亞砜（DMSO）、EDTA-2Na等均為分析純（市售）。

1.2不同相對分子質(zhì)量Ca2+-SFP的分級制備

選用中等級蠶繭除雜后，置于Na2CO3溶液（0.4mg/mL）沸煮2.5h，浴比1︰25，水洗干凈，烘干得到純絲素;將純絲素置于CaCl2-C2H5OH-H2O（摩爾比為1︰2︰8）三元體系溶液中于80℃溶解30min，冷卻至室溫，抽濾;將濾液置于透析袋中（截留相對分子質(zhì)量為8kD～14kD），每隔12h換一次蒸餾水，分別透析12、24h和36h，得到不同Ca2+濃度的絲素溶液;采用卷式膜實驗機濃縮絲素溶液后，按照m純絲素︰m中性蛋白酶=20︰1在pH值為6.0～7.0條件下55℃水浴酶解1.5h;卷式膜實驗機將絲素溶液分為2kD以下、2kD～3kD、3kD～5kD、5kD～8kD、8kD以上的不同相對分子質(zhì)量絲素溶液;真空冷凍干燥獲得各相對分子質(zhì)量Ca2+-SFP，密封保存?zhèn)溆肹15]。

1.3Ca2+含量檢測

采用GB/T7476—1987《水質(zhì)鈣的測定EDTA滴定法》，用移液管分別移取透析12、24、36h絲素蛋白溶液50.00mL，置于250mL錐形瓶中，再加入2mL10%氫氧化鈉溶液，搖勻后加鈣指示劑少許（約0.1g），用0.01mol/L EDTA-2Na溶液滴定至溶液由酒紅色變?yōu)榧兯{色，記錄EDTA-2Na溶液的用量，滴定3次取平均值。并按照下式計算Ca2+濃度：

X=C×V1×MV2×1000（1）

式中：X為水樣的鈣離子含量，mg/L;M為CaCO3的摩爾質(zhì)量，g/mol;C為EDTA標準溶液的摩爾濃度，mol/L;V1為滴定時消耗的EDTA標準溶液的體積，mL;V2為所取水樣的體積，mL。

1.4細胞生長性能檢測

L02用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。用完全培養(yǎng)基配制質(zhì)量濃度為4mg/mL的SFP溶液，采用過濾除菌法（微孔濾器，220nm，Millipore，Ireland）處理后，再稀釋為質(zhì)量濃度2mg/mL和1mg/mL的SFP水溶液。待細胞生長適宜后，用血球計數(shù)板將細胞濃度分別調(diào)整為3×104個/mL，以每孔100μL加入到96孔板（Corning，USA）中，過夜待細胞貼壁后，每孔加入100μL制備好的含不同質(zhì)量濃度的SFP培養(yǎng)基，空白對照組加100μL完全培養(yǎng)基。實驗組每組設置3個復孔，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于培養(yǎng)1、2、3、4、5d后每天采用MTT法檢測細胞的活性：每孔加20μL MTT溶液，于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去96孔板中的液體，每孔加入100μL DMSO，使用酶標儀震蕩10min，然后檢測其在490nm處的吸光值。并按照下式計算相對增殖率RGR：

RGR/%=實驗組吸光值對照組吸光值×100（2）

1.5圓二色譜檢測

采用圓二色譜儀測試相對分子質(zhì)量8kD以上Ca2+含量為16.00%、9.60%、0.40%的SFP的二級結構，測試條件為能帶寬度1nm，響應1s，波長190～260nm，掃描速度500nm/min。

1.6統(tǒng)計學處理

使用IBM SPSS Statistics 19進行統(tǒng)計學分析，實驗結果用平均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間兩兩比較采用單因素方差分析方法，以P<0.05判定差異有統(tǒng)計學意義。

2結果與分析

2.1Ca2+含量檢測

采用水質(zhì)鈣的測定EDTA滴定法（表1），測得并計算得到透析12h的SFP中Ca2+含量為16.00%，透析24h的SFP中Ca2+含量為9.60%，透析36h的SFP中Ca2+含量為0.40%。統(tǒng)計學分析，透析12、24、36h的SFP的Ca2+含量之間存在顯著性差異。在透析過程中，隨著時間的延長，與絲素蛋白質(zhì)中酪氨酸、絲氨酸等進行配位絡合的Ca2+解離，然后沿濃度梯度擴散透出透析袋，在不更換透析外液情況下，開始時Ca2+含量和透析袋內(nèi)外濃度差較大，前15h的Ca2+會快速解離，后期變化逐漸減小，30h后SFP中Ca2+含量趨于恒定[16]，但本實驗中通過每隔12h更換透析外液，可使在透析36h時SFP中Ca2+幾近透出。

2.2各相對分子質(zhì)量級別SFP對L02生長的影響

SFP溶液質(zhì)量濃度0.5mg/mL時（圖1），SFP中Ca2+含量為0.40%，RGR值隨著相對分子質(zhì)量的增加而減小，當相對分子質(zhì)量大于8kD時，對L02的生長呈較強抑制作用，RGR為（59.78%±0.70%），根據(jù)樣品毒性級別評分對照（表2）進行細胞毒性級別評分[17]，細胞毒性級別為2級，其余相對分子質(zhì)量SFP的細胞毒性等級為1級;Ca2+含量為9.60%時，所有相對分子質(zhì)量SFP對L02的生長呈較弱抑制作用，細胞毒性等級均為1級;Ca2+含量為16.00%時，所有相對分子質(zhì)量SFP對L02的生長呈促進作用，RGR均大于（117.45%±2.33%）。統(tǒng)計學分析，相同相對分子質(zhì)量大小的絡合不同Ca2+含量SFP對L02的RGR值均有顯著性差異。SFP細胞形態(tài)觀察（圖2）得知，SFP相對分子質(zhì)量大于8kD時，隨著Ca2+含量的減少，細胞數(shù)量逐漸減少，且在Ca2+含量0.40%時大量細胞發(fā)生變形，體積發(fā)生萎縮。綜上，說明SFP絡合Ca2+含量對細胞生長存在明顯差異。

2.3相對分子質(zhì)量8kD以上SFP二級結構測定和分析

從SFP的相對分子質(zhì)量大小和Ca2+含量分析，相同相對分子質(zhì)量大小的SFP時，Ca2+含量不同對細胞生長的影響不同，可見SFP對細胞生長的影響主要取決于Ca2+含量，且在SFP相對分子質(zhì)量8kD以上時尤為明顯。因此對相對分子質(zhì)量8kD以上SFP進行圓二色譜測定，得到圓二色譜圖（圖3），并用CONTIN程序及Yang-chen公式計算其各二級結構成分。由表3所示，隨著Ca2+含量的升高，β折疊向α螺旋和無規(guī)則卷曲轉變，當Ca2+含量從0.40%增加到16.00%時，β折疊的含量減少了8.54%，α螺旋和無規(guī)則卷曲的含量分別增加了3.43%和535%。

在絲素脫鹽過程中，隨著脫鹽率越高即鈣離子含量越低時，絲素蛋白分子構象會由無規(guī)則卷曲向β折疊轉化[18]。且在絲素蛋白膜的制備中也有研究表明Ca2+含量為3.00%的絲素蛋白膜中β折疊含量比Ca2+含量為1.50%的絲素蛋白膜低[19]。因此，Ca2+在絲素蛋白鹽溶過程中改變了絲素蛋白的二級結構，使無規(guī)則卷曲和α螺旋向β折疊轉變，從而使其對細胞生長影響不同，隨著Ca2+含量減少，致β折疊含量增加，對細胞生長的抑制作用增強。有研究表明，α型絲素膜的多孔網(wǎng)狀凝膠結構更能夠適應細胞的附著、鋪展，對增殖極為有利[8]。β淀粉樣蛋白對人神經(jīng)母細胞瘤細胞具有毒性作用，主要原因也是其結構中α螺旋向β折疊的轉變[20]。故SFP中α螺旋結構對細胞的增殖有利，而β折疊含量較高則不利于細胞的增殖。

3結論

影響SFP對人正常肝細胞L02生長的主要因素是Ca2+含量，而非相對分子質(zhì)量大小。SFP絡合較高Ca2+含量（16.00%）對細胞生長有促進作用，而SFP絡合較低Ca2+含量（0.40%、 9.60%）對細胞生長有抑制作用，在相對分子質(zhì)量8kD以上時尤為明顯。這是由于在SFP絡合Ca2+含量減少的過程中，其有較大的二級結構改變，即無規(guī)則卷曲和α螺旋轉變?yōu)棣抡郫B，α螺旋結構對細胞的增殖有利，而β折疊含量較高不利于細胞的增殖。綜上所述，在組織工程支架領域，建議使用絡合較高Ca2+含量（β折疊含量較少）的SFP更有利于細胞增殖。

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