小檗堿及藥根堿在大鼠肝微粒體中的代謝轉(zhuǎn)化研究

楊巖濤 楊巖 江歡英 李森 劉金玲 周晉 周逸群 賀福元

〔摘要〕 目的 進(jìn)行小檗堿和藥根堿在大鼠肝微粒體中的代謝轉(zhuǎn)化研究，嘗試給中藥有效成分的體外和體內(nèi)關(guān)聯(lián)研究提供一定的參考。方法 制備大鼠肝微粒體，用Brad ford法測(cè)定酶活性，以此配制大鼠肝微粒體體外溫孵體系，加入藥物溫孵，用質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)測(cè)定并比較小檗堿、藥根堿代謝產(chǎn)物圖譜。結(jié)果 檢測(cè)到小檗堿經(jīng)大鼠肝微粒體代謝后產(chǎn)物中有藥根堿，藥根堿經(jīng)大鼠肝微粒體代謝后產(chǎn)物中有巴馬汀，但小檗堿代謝產(chǎn)物中未見巴馬汀。結(jié)論 小檗堿和藥根堿是同母核生物堿，在肝微粒體中孵化可相互影響，但體外代謝無法簡(jiǎn)單關(guān)聯(lián)體內(nèi)代謝過程。

〔關(guān)鍵詞〕 小檗堿;藥根堿;肝微粒體;代謝轉(zhuǎn)化;代謝物

〔中圖分類號(hào)〕R393;R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.009

Metabolic Transformation of Berberine and Jatrorrhizine in Rat Liver Microsomes

YANG Yantao1，2，3，4， YANG Yan1，4， JIANG Huanying1， LI Sen1，4， LIU Jinling1，4， ZHOU Jin1，3，4， ZHOU Yiqun1，3，4， HE Fuyuan1，3，4*

（1. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines & Institute of Materia Medica， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050， China; 3. Hunan Provincial Key Laboratory of Druggability and Preparation Modification of Traditional Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 4. Laboratory for Supramolecular Mechanism and Mathematic-Physics Characterization for Chinese Materia Medica， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To investigate the metabolic transformation of berberine and jatrorrhizine in rat liver microsomes， and to provide a reference for the in vitro and in vivo association studies of active constituents in traditional Chinese medicine （TCM）. Methods The rat liver microsome was prepared， and the enzymatic activity was determined by Brad ford method to prepare the in vitro incubation system of rat liver microsomes. After the incubation in the presence of berberine and jatrorrhizine， mass spectrometry was used to detect and compare the metabolites of berberine and jatrorrhizine. Results After the metabolic transformation in rat liver microsomes， jatrorrhizine was one of the metabolites of berberine; palmatine was one of the metabolites of jatrorrhizine， but not of berberine. Conclusion Berberine and jatrorrhizine are from the same parent alkaloid and they can affect each other during the incubation in liver microsomes. However， the in vitro metabolism cannot be associated with the in vivo metabolism.

〔Keywords〕 berberine; jatrorrhizine; liver microsome; metabolic transformation; metabolite

中藥復(fù)方是中醫(yī)治病的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過其所包含有效成分對(duì)人體產(chǎn)生作用，然藥物成分進(jìn)入人體后在體內(nèi)經(jīng)過吸收、分布、代謝、排泄等環(huán)節(jié)，體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物與原成分有可能共同構(gòu)成其物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥成分體內(nèi)代謝研究是揭示中藥復(fù)方藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的重要組成部分，因此對(duì)于中藥質(zhì)量的評(píng)價(jià)，必須從藥物成分及體內(nèi)代謝產(chǎn)物全盤考慮，只有這樣才能尋找到藥物質(zhì)量的代表性物質(zhì)。而藥物成分的體外代謝是否與體內(nèi)代謝一致？中藥及復(fù)方成分來源于原動(dòng)植物生命體，是一個(gè)巨大的超分子體系[1]，同樣，人體也是一個(gè)復(fù)雜的化學(xué)工廠，機(jī)體情況的變化必將對(duì)藥物作用產(chǎn)生影響，因此，有必要探討藥物成分代謝體外、體內(nèi)的相關(guān)性，為中藥藥效物質(zhì)研究及中藥質(zhì)量標(biāo)志物的確定提供幫助。

黃連Coptis chinensis Franch.為常用中藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[2]?，F(xiàn)代研究表明：黃連生物堿具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗心律失常、降血糖、增強(qiáng)免疫力及抗癌等廣泛藥理作用[3]。小檗堿和藥根堿為黃連中生物堿的重要組成成分，近年來小檗堿在臨床上已從單純的治療腸菌性腹瀉發(fā)展到治療糖尿病、心律失常、心力衰竭等重大疾病;藥根堿具有殺菌的作用。關(guān)于小檗堿、藥根堿的分離、含量測(cè)定及體內(nèi)代謝等已有許多報(bào)道，熊程億等[4]報(bào)道了用薄層法確認(rèn)大鼠尾靜脈注射小檗堿后尿及膽汁中各有一個(gè)明顯的代謝產(chǎn)物，潘俊芳等[5]報(bào)道了從人口服鹽酸小檗堿后的尿液中分得了3個(gè)硫酸結(jié)合型代謝產(chǎn)物，薛寶娟等[6]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了吳茱萸次堿對(duì)包括小檗堿和藥根堿在內(nèi)的5 種黃連生物堿成分均存在體外弱抑制作用，但均未探討二者在生物體外的代謝轉(zhuǎn)化。因此，本文通過建立大鼠肝微粒體體外代謝模型，探討并初步說明黃連中的重要組分小檗堿和藥根堿在大鼠肝微粒體中的代謝及轉(zhuǎn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1? 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SPF級(jí)SD大鼠，購買于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)為SCXK（湘）2011-0003。小檗堿（110713-201108，供含量測(cè)定用）、藥根堿（110733-200905，供含量測(cè)定用）對(duì)照品購自中國食品藥品檢定研究院。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G-6-P-DH），NADPH（輔酶II），葡萄糖-6-磷酸（glucose-6-phosphate，G-6-P）購自美國Sigma公司。十二烷基磺酸鈉（進(jìn)口分裝，廣州市醫(yī)藥公司），乙腈為色譜純，磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、EDTA、硫酸銨等其它試劑均為分析純，水為重蒸餾水。Waters高效液相色譜儀，Breeze工作站，Waters 2487 Dual Absorbance Detector;質(zhì)譜檢測(cè)器為Bruker Daltonics公司的esquire 6000離子阱質(zhì)譜儀。

1.2? 色譜條件

Ultimate XB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A：0.1%的磷酸緩沖溶液，pH3.74，流動(dòng)相B：0.1%的磷酸乙腈水溶液（乙腈∶水=6∶4），pH4.00，A、B均含0.5%的十二烷基硫酸鈉，pH4.00;A∶B梯度洗脫程序：0 min（80：20）→30 min（65：35）→50 min（20：80）→90 min（20：80）;流速為0.8 mL/min;UV檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm;esquire 6000質(zhì)譜，電噴霧離子化正離子檢測(cè)模式（ESI+）;柱溫40 ℃。

1.3? 供試品的制備

1.3.1? 肝微粒體制備? 按二次離心法制備肝微粒體[7]，實(shí)驗(yàn)大鼠禁食8 h后取肝，用K2HPO4-KH2PO4（pH7.4）的緩沖溶液清洗，稱取質(zhì)量，搗碎組織，然后于冰浴上用PBS液研成勻漿，先用3 000 r/min離心30 min，取上清液，12 000 r/min離心90 min，取沉淀，用PBS加甘油配成的貯存液分散，并用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量為8.79 mg/mL，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2? 配制孵育體系? 重蒸餾水690 μL，G-6-P（165 mmol/L）100 μL，NADP（65 mmol/L）100 μL，MgCl2（165 mmol/L）100 μL，G-6-P-DH（500 U/mL）10 μL，每次實(shí)驗(yàn)前新鮮配制。

1.3.3? 小檗堿、藥根堿溶液的配制? 精密稱取小檗堿10.04 mg，用甲醇溶解并定容到5 mL，使其濃度為2.01 mg/mL;精密稱取藥根堿10.14 mg，用甲醇溶解并定容到5 mL，使其濃度為2.03 mg/L。

1.3.4? 肝微粒體溫孵? 取“1.3.1”項(xiàng)下制備好的肝微粒體分為小檗堿組（A組）、藥根堿組（B組）、小檗堿+藥根堿組（C組）、空白組（D組）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組重復(fù)5次，依次向各組加入已配制的A、B、C、D組相應(yīng)干預(yù)溶液50 μL，底物加入后，N2揮干后加入40 μL的磷酸鹽緩沖液（pH7.4），重蒸餾水60 μL，大鼠肝微粒體（8.79 mg/mL）20 μL，置于37 ℃水浴下預(yù)孵化5 min，加入“1.3.2”項(xiàng)下配制的孵育體系40 μL 啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃水浴下孵化120 min后于冰水中終止反應(yīng)[8]。

1.3.5? 體外代謝樣品的制備? 上述“1.3.4”樣品終止反應(yīng)后，12 000 r/min離心15 min，取上清液，加入1 mol/L的NaOH溶液100 μL，渦旋5 min;再加入無水乙醚1.5 mL，渦旋10 min，6 000 r/min離心15 min，取上清液揮干乙醚，檢測(cè)前加入200 μL甲醇溶解進(jìn)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1? 肝微粒體體外代謝液相色譜分析

取“1.3.5”4組肝微粒體體外代謝樣品，分別按“1.2”色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，其液相色譜圖見圖1，對(duì)比發(fā)現(xiàn)：混合物組的代謝峰與小檗堿、藥根堿兩組代謝峰存在交叉重疊，這符合一般代謝規(guī)律，但卻不足以闡明3組肝微粒體的代謝轉(zhuǎn)化規(guī)律和代謝產(chǎn)物類別，為嘗試分析探討小檗堿與藥根堿之間是否存在相互轉(zhuǎn)化的代謝過程，驗(yàn)證小檗堿與藥根堿體外代謝過程是否吻合本研究團(tuán)隊(duì)前期所提出“網(wǎng)通虹勢(shì)”理論中的網(wǎng)通性規(guī)律[9]，進(jìn)一步采用質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)小檗堿和藥根堿肝微粒體體外代謝樣品進(jìn)行檢測(cè)。

2.2? 小檗堿與藥根堿肝微粒體體外代謝質(zhì)譜分析

在液相色譜分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用質(zhì)譜檢測(cè)器對(duì)肝微粒體體外代謝樣品進(jìn)行檢測(cè)分析，在正離子檢測(cè)方式檢測(cè)模式下，得質(zhì)譜圖2-3。小檗堿分子式及分子量為[C20H18NO4]+、336;藥根堿分子式及分子量為C20H20NO4、338;巴馬汀分子式及分子量為[C21H22NO4]+、352，其分子結(jié)構(gòu)圖見圖4-6。

ESI-MS在線檢測(cè)一級(jí)質(zhì)譜條件下獲得的是待測(cè)物的準(zhǔn)分子離子峰，幾乎不產(chǎn)生碎片離子。在正離子檢測(cè)方式檢測(cè)模式下，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：小檗堿肝微粒體代謝樣品質(zhì)譜圖中有分子離子峰m/z336，同正離子量相符合，且在小檗堿肝微粒體代謝樣品質(zhì)譜圖中也出現(xiàn)了分子離子峰m/z338，應(yīng)為藥根堿分子離子峰。藥根堿肝微粒體代謝樣品質(zhì)譜圖中有分子離子峰m/z338、m/z352，m/z338為藥根堿分子離子峰，M（m/z352）分子離子比藥根堿分子離子多14 U，主要二級(jí)碎片m/z337均比藥根堿的主要二級(jí)碎片m/z323多14 U相符合，說明M（m/z352）比藥根堿多了1個(gè)甲基，應(yīng)是原藥的甲基化軛合產(chǎn)物。由于原藥分子中只有1個(gè)羥基，因此是甲基化軛合的位置，即M（m/z352）就是巴馬汀的分子離子峰。

2.3? 與文獻(xiàn)體內(nèi)代謝對(duì)比分析

由圖2-3可知，在肝微粒體體外代謝過程中，小檗堿會(huì)代謝轉(zhuǎn)換為藥根堿，藥根堿將代謝轉(zhuǎn)換為巴馬汀，而王亮等[10]進(jìn)行黃連生物堿在大鼠體內(nèi)的代謝研究中發(fā)現(xiàn)，小檗堿體內(nèi)代謝有一部分轉(zhuǎn)化為藥根堿，這與本實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)相一致，而本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)了藥根堿在體外代謝時(shí)部分轉(zhuǎn)化為巴馬汀，但卻未見藥根堿體外代謝時(shí)有小檗堿的出現(xiàn)，這驗(yàn)證了同一母核衍生物群可相互轉(zhuǎn)化，但可能由于體外代謝速度不夠快，代謝不夠徹底，從而體外代謝產(chǎn)物種類較少，因此有必要探討小檗堿及藥根堿體外代謝動(dòng)力學(xué)過程，以闡明其代謝速度與代謝產(chǎn)物等結(jié)果。且小檗堿經(jīng)灌胃后主要分布在大鼠的肺中，其次才是肝臟，而藥根堿則主要分布在肝臟中[10]，這也反映了不同生物堿有可能經(jīng)由不同的代謝途徑或由多個(gè)代謝酶主導(dǎo)進(jìn)行代謝，不同物質(zhì)在不同臟器中會(huì)有不同的代謝過程，因此體外代謝過程的代謝途徑、代謝動(dòng)力學(xué)過程等均無法簡(jiǎn)單等效或推測(cè)體內(nèi)代謝過程。至于不同物質(zhì)體內(nèi)外代謝相關(guān)性如何，則需要針對(duì)性的展開研究。并且小檗堿與藥根堿為同母核生物堿，均是異喹啉類生物堿的衍生物，這符合同一母核的有效成分衍生物群的代謝過程可以相互抑制、加速及轉(zhuǎn)化，其代謝網(wǎng)絡(luò)相容相通的“網(wǎng)通性”理論[9]。邱峰等[11]已經(jīng)從人口服鹽酸小檗堿后尿液中分離并鑒定了7個(gè)代謝產(chǎn)物，其中4個(gè)為新發(fā)現(xiàn)的代謝產(chǎn)物。韓鳳梅等[12]已利用液相色譜-串聯(lián)電噴霧離子阱質(zhì)譜法鑒定大鼠尿液中藥根堿有7種代謝物，朱志勇[13]給大鼠灌胃小檗堿后，從大鼠的尿液中發(fā)現(xiàn)了大量的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物（次生代謝產(chǎn)物），而本實(shí)驗(yàn)中體外代謝產(chǎn)物種類明顯較少。

3 討論

本研究側(cè)重于闡述小檗堿與藥根堿體外代謝過程的網(wǎng)通性規(guī)律，因此對(duì)其肝微粒體中代謝產(chǎn)物的類別并未完整地進(jìn)行分析闡明，而主要關(guān)注了同一母核衍生物群在肝微粒體代謝過程中能否相互轉(zhuǎn)化。研究結(jié)果表明同母核生物堿的小檗堿和藥根堿，在肝微粒體中孵化可相互影響，但體外代謝無法簡(jiǎn)單與體內(nèi)代謝過程相關(guān)聯(lián)，因此本研究存在有一定的局限性，需要進(jìn)一步深入探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦表明中藥同一母核多衍生物成分有可能在體內(nèi)產(chǎn)生相似的代謝產(chǎn)物與藥效，單一成分可代謝轉(zhuǎn)變?yōu)槎喾N代謝產(chǎn)物，原成分及代謝成分可能呈相似的動(dòng)力學(xué)模型，同一母核的有效成分衍生物群在人體內(nèi)可以相互抑制、加速及轉(zhuǎn)化，符合同一母核的有效成分衍生物群代謝網(wǎng)絡(luò)相容相通的“網(wǎng)通性”理論，因此，在進(jìn)行中藥質(zhì)量控制及評(píng)價(jià)時(shí)不能單純著眼于中藥成分，可將中藥網(wǎng)絡(luò)代謝與系統(tǒng)生物學(xué)的代謝組學(xué)結(jié)合，研究有效成分群代謝規(guī)律，揭示生物體之間的網(wǎng)絡(luò)代謝普遍規(guī)律，有望揭示中藥作用的物質(zhì)基礎(chǔ)：有效成分及代謝物種類、構(gòu)成比及動(dòng)力學(xué)規(guī)律，為確定中藥質(zhì)量標(biāo)志物[14]提供支撐。

綜上所述，中藥成分在體內(nèi)、體外代謝過程中均存在“網(wǎng)通性”代謝規(guī)律，但體內(nèi)外環(huán)境條件的差異以及不同物質(zhì)可能經(jīng)由不同的代謝途徑進(jìn)行代謝或者主導(dǎo)代謝的酶不同，這些原因都造成藥物體外代謝過程與體內(nèi)代謝存在顯著的差異，需要系統(tǒng)地開展中藥成分代謝動(dòng)力學(xué)及代謝途徑的研究，并進(jìn)一步關(guān)聯(lián)其體內(nèi)外代謝過程，以完整闡明其體內(nèi)外代謝規(guī)律。

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