蠐螬提取物對視網(wǎng)膜靜脈阻塞兔 內(nèi)皮抑素表達的影響

梁凱霞 蔣鵬飛 彭俊 彭清華

〔摘要〕 目的 評價蠐螬提取物對兔視網(wǎng)膜靜脈阻塞的治療作用及其機制。方法 將40只兔隨機分為4組：空白組、模型組、復(fù)方血栓通組、蠐螬組，每組10只兔20只眼，除空白組外，其余3組均用光化學(xué)動力法建立視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion， RVO）動物模型，于給藥后1周、3周行FFA檢查、HE染色、免疫組化觀察內(nèi)皮抑素表達。結(jié)果 FFA檢查結(jié)果顯示：給藥后周1周，模型組中央靜脈熒光滲漏、出血，復(fù)方血栓通組和蠐螬組滲漏、出血較模型組少;給藥后3周，模型組滲漏、出血的靜脈周圍出現(xiàn)無灌注區(qū)，復(fù)方血栓通組滲漏、出血明顯減小，蠐螬組滲漏、出血基本吸收。視網(wǎng)膜切片光鏡觀察結(jié)果顯示：蠐螬組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)病理變化均輕于模型組、復(fù)方血栓通組。內(nèi)皮抑素免疫組化結(jié)果顯示：各造模組內(nèi)皮抑素表達均下降，蠐螬組表達最強，模型組表達最弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 蠐螬提取物能改善視網(wǎng)膜缺血缺氧的狀態(tài)，促進RVO模型中內(nèi)皮抑素的表達。

〔關(guān)鍵詞〕 視網(wǎng)膜靜脈阻塞;蠐螬提取物;內(nèi)皮抑素

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.03.005

Effect of Grub Extract on the Expression of Endostatin in Rabbits with Retinal Vein Occlusion

LIANG Kaixia1，2， JIANG Pengfei1，2， PENG Jun2，3， PENG Qinghua1，2，3*

（1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. The First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 3. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Prevention and Treatment of Eye， Ear， Nose and Throat Diseases in Hunan Province， Changsha， Hunan 410208， China）

〔Abstract〕 Objective To evaluate the therapeutic effect and mechanism of action of grub extract on rabbits with retinal vein occlusion （RVO）. Methods Forty rabbits were randomly and equally divided into blank group， model group， compound Xueshuantong group， and grub group， with 20 eyes in each group. A rabbit model of RVO was established by a photochemical kinetic method in all groups except for the blank group. Fluorescein fundus angiography （FFA）， HE staining， and immunohistochemistry （for measuring endostatin expression） were performed at 1 and 3 weeks after treatment. Results According to the FFA results， at 1 week after treatment， central venous fluorescence leakage and hemorrhage were observed in the model group; the compound Xueshuantong group and grub group had less leakage and hemorrhage than the model group. At 3 weeks after treatment， areas of non-perfusion showed up around the vein with leakage and hemorrhage in the model group; the compound Xueshuantong group had substantially reduced leakage and hemorrhage; the leakage and hemorrhage were almost absorbed in the grub group. The results of optical microscopic examination of retinal sections showed that the grub group had less pathological changes in each retina layer than the model group and the compound Xueshuantong group. According to the immunohistochemistry results， the expression of endostatin was significantly reduced in all three model establishment groups; among the three groups， the grub group had the highest expression of endostatin， while the model group had the lowest expression （P<0.05）. Conclusion Grub extract can improve retinal ischemia and hypoxia and promote the expression of endostatin in the rabbit model of RVO.

〔Keywords〕 retinal vein occlusion; grub extract; endostatin

視網(wǎng)膜靜脈阻塞（retinal vein occlusion， RVO） 是臨床上常見的眼底血管病，其病因復(fù)雜，一般認為高血壓、高血脂、青光眼、糖尿病以及動脈硬化等都是高危因素[1]。RVO病程冗長，治療困難，尚無特效療法，RVO后視網(wǎng)膜組織會發(fā)生缺血缺氧，視網(wǎng)膜新生血管（retinal neovascularization， RNV）是RVO的常見并發(fā)癥。蠐螬可治療目疾，并有破血、行瘀、散結(jié)、明目之功效，前期研究發(fā)現(xiàn)蠐螬提取物可促進RVO出血的吸收、抑制RNV[2-3]，為明確其機制，本文通過建立RVO動物模型，探討蠐螬對RNV的作用機制，為研究RVO和RNV的治療提供方向。

1 材料

1.1? 實驗動物

選用40只健康實驗性兔，雌雄兼用，體質(zhì)量1.8～2.3 kg（合格證號：湘醫(yī)動字第30-015號）。

1.2? 主要藥品和試劑

蠐螬提取物，制備參考陽長明的方法[4]。復(fù)方血栓通片（揚州中惠制藥有限公司，規(guī)格：0.40 g×24片，批號090905）;25%烏拉坦（上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號：U0202）;20%熒光素鈉（沈陽晟達化工有限公司，批號：SS00050）;一抗為兔抗內(nèi)皮抑素多克隆抗體（武漢默沙克生物科技有限公司，批號：BA21646）。

1.3? 主要儀器

JY0001型電子秤（上海天平儀器廠）;ZDS-10型勒克斯照度計（上海嘉定學(xué)聯(lián)儀器廠）;YZZOT型顯微鏡（蘇州醫(yī)療器械設(shè)備廠）;PCR儀（德國Biometra）;GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;微量移液器（德國，eppendorf[1 mL/200 uL/10 uL）];臺式高速冷凍離心機（Thermo）;DYCZ-24D垂直板電泳槽、DYCP-40C水平電轉(zhuǎn)槽（北京六一儀器廠）;SP-752型紫外可見分光光度計（上海spectrum公司）。

2 方法

2.1? 動物分組

通過隨機數(shù)字表法將40只實驗性兔隨機分為空白組、模型組、復(fù)方血栓通組、蠐螬組，每組10只動物，20只眼。

2.2? 造模方法

應(yīng)用光化學(xué)動力法[5]制作實驗性RVO模型，模型組、復(fù)方血栓通組、蠐螬組雙眼散瞳后，麻醉動物，固定兔于裂隙燈前，安置三面鏡。激光器指示光斑定位于視盤邊緣的靜脈后，自耳緣靜脈緩慢推入20%熒光素鈉注射液（0.3 mL/kg），30 s內(nèi)推完。在注藥后，用倍頻Nd：YAG激光對雙側(cè)視網(wǎng)膜靜脈進行照射，同時避開伴行的動脈，看到有明顯的遠端靜脈擴張時停止。

2.3? 動物給藥方法

造模成功后第1天開始給藥，空白組、模型組生理鹽水5 mL/kg灌胃;復(fù)方血栓通組：復(fù)方血栓通0.1 g/kg溶于生理鹽水中制成混懸劑，5 mL/kg灌胃;蠐螬組：蠐螬水提取物1.5 mL/kg灌胃，其中1 mL水提物相當(dāng)于1 g生藥量。各組均為每日1次，持續(xù)3周，于給藥后1周、3周每組各隨機處死5只動物。

2.4? 取材方法

動物耳緣靜脈注射空氣處死后，立即摘除眼球（包括球后視神經(jīng)2 mm），于角膜緣后0.5 mm處剪開眼球壁，去除眼前節(jié)組織和玻璃體，將眼球壁在手術(shù)顯微鏡下剝離激光斑部位視網(wǎng)膜，逐級酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)視乳頭顏側(cè)旁開1 mm縱向做4 μm厚的切片，烘干備用。

2.5? 熒光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiograpny， FFA）

給藥后1周、3周對兔行FFA檢查，將1周和3周的FFA結(jié)果，應(yīng)用Mias-2000型顯微圖像分析系統(tǒng)自動測量無灌注區(qū)（non perfusion area， NPA）和視盤（optic disk， OD）的面積并求出比值（S=N/D）[6]。分為有無灌注區(qū)、無新生血管（甲類）和有無灌注區(qū)、有新生血管（乙類）。

2.6? 光鏡觀察

將取材的切片行蘇木精-伊紅染色，做免疫組化組織學(xué)檢測內(nèi)皮抑素表達：于40×目鏡下觀察，每張切片均選取免疫組化陽性染色最多的4個視野框，用Mias-2000圖形分析系統(tǒng)行視網(wǎng)膜色素上皮以上測量框內(nèi)染成棕黃色的ES的平均光密度，在光學(xué)顯微鏡下主要觀察視網(wǎng)膜組織變化。

2.7? 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進行分析。多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗（S-N-K法），組內(nèi)不同時間點比較采用重復(fù)測量資料的方差分析，相關(guān)性分析用Bivariate分析。各項指標(biāo)均以“x±s”表示。P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? FFA檢查結(jié)果

給藥后1周，模型組中央靜脈熒光滲漏、出血，復(fù)方血栓通組、蠐螬組滲漏、出血較模型組少（P<0.05）;給藥后3周，模型組滲漏、出血的靜脈周圍出現(xiàn)無灌注區(qū)，復(fù)方血栓通組滲漏、出血明顯減小，蠐螬組與模型組相比，滲漏、出血基本吸收，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3.2? HE染色結(jié)果

空白組：視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列正常。模型組：給藥后1周，視網(wǎng)膜組織水腫，細胞排列較亂，尚無新生血管索;給藥后3周，出現(xiàn)大量地新生血管索。復(fù)方血栓通組：給藥后1周，視網(wǎng)膜組織水腫，細胞排列紊亂;給藥后3周，視網(wǎng)膜組織水腫減輕，無新生血管索。蠐螬組：給藥后1周，視網(wǎng)膜組織細胞排列大致清晰;給藥后3周，視網(wǎng)膜組織水腫減輕，無新生血管索。見圖1。

3.3? 內(nèi)皮抑素的陽性表達結(jié)果

與空白組比較，模型組內(nèi)皮抑素表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。給藥后第1周：模型組、復(fù)方血栓通組、蠐螬組視網(wǎng)膜組織中均可見棕色顆粒狀染色，其中蠐螬組內(nèi)皮抑素表達最強，模型組內(nèi)皮抑素表達最弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;給藥后3周：蠐螬組視網(wǎng)膜組織中內(nèi)皮抑素表達最強;復(fù)方血栓通組內(nèi)皮抑素表達均較蠐螬組稍弱;蠐螬提取物組3周與1周比較，內(nèi)皮抑素表達明顯減弱（P<0.05）。見表2。

4 討論

RVO發(fā)病率高，是僅次于糖尿病視網(wǎng)膜病變的第二大致盲性視網(wǎng)膜血管病[7-9]，其發(fā)生機制目前尚不明了[10-13]。

蠐螬是金龜子的幼蟲，首次記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅滿痛，月閉，目中淫膚，青翳白膜?！薄侗静菥V目》中記載此藥味咸微溫，有破血、行瘀、散結(jié)、通乳、解毒、消瘡、明目的功能。現(xiàn)代藥理研究認為蠐螬對視網(wǎng)膜靜脈阻塞的缺血視網(wǎng)膜組織有保護作用[2-3]，能夠治療RVO所致的視網(wǎng)膜病理損傷。

內(nèi)皮抑素是內(nèi)源性血管生成抑制因子[14]，能夠特異性的抑制血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和凋亡。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可促進血管內(nèi)皮細胞分裂，通過與膜受體結(jié)合特異性調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖，促進新生血管生成[15]，視網(wǎng)膜新生血管是視網(wǎng)膜靜脈阻塞的主要并發(fā)癥之一，影響著視網(wǎng)膜靜脈阻塞的治療與預(yù)后。內(nèi)皮抑素可競爭性抑制VEGF與其膜受體的結(jié)合，阻斷VEGF受體活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制VEGF介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細胞遷移和新生血管的形成。

本研究結(jié)果顯示：模型組內(nèi)皮抑素陽性表達高于空白組，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。據(jù)此推斷，光化學(xué)法建立RVO模型產(chǎn)生的RNV，其發(fā)生機制與內(nèi)皮抑素密切相關(guān)，復(fù)方血栓通治療組、蠐螬提取物治療組的內(nèi)皮抑素較模型組均有增多，提示復(fù)方血栓通治療組、蠐螬提取物治療組是通過上調(diào)內(nèi)皮抑素的表達抑制血管內(nèi)皮生長因子在視網(wǎng)膜組織中的表達，從而抑制了RNV的發(fā)生。

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