硝普鈉對鉛脅迫娃娃菜種子萌發(fā)及其幼苗生理特性的影響

余沛東 陳銀萍 閆志強(qiáng) 師小平 丁浚剛 頡海帆

摘要：【目的】研究外源一氧化氮（NO）供體硝普鈉（SNP）對鉛（Pb）脅迫娃娃菜種子萌發(fā)及其幼苗生理特性的影響，為探索Pb毒害娃娃菜的緩解途徑提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā糠謩e對Pb脅迫[500.0 mg/L Pb（NO3）2]娃娃菜種子及其幼苗施加不同濃度（50.0、100.0、200.0、500.0和1000.0 μmol/L）的SNP溶液，觀察各處理種子萌發(fā)及其幼苗生長狀況，測定分析幼苗的相對電導(dǎo)率（REC）和葉綠素、丙二醛（MDA）、脯氨酸（Pro）含量及超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）活性等指標(biāo)。【結(jié)果】在Pb脅迫下，娃娃菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)降低，幼苗鮮、干重和葉綠素含量減少，抗氧化酶活性升高，REC提高，MDA含量增加。適宜濃度的SNP處理能提高Pb脅迫娃娃菜種子的萌發(fā)效果;100.0 μmol/L SNP可顯著提高幼苗的CAT活性（P<0.05，下同），明顯提高SOD活性，顯著減緩葉片REC升高;200.0 μmol/L SNP處理可顯著增加Pb脅迫娃娃菜幼苗的葉綠素a（Chla）和葉綠素b（Chlb）含量，使根和芽的鮮、干重顯著增加，顯著減緩MDA含量增加;50.0 μmol/L SNP處理能顯著增強(qiáng)幼苗的SOD活性和促進(jìn)Pro合成。【結(jié)論】低濃度（50.0～200.0 μmol/L）外源SNP能通過增強(qiáng)娃娃菜的抗氧化酶活性和促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)生成以減輕膜脂過氧化作用，使娃娃菜的生理代謝趨于穩(wěn)定，從而提高娃娃菜的耐Pb脅迫能力。

關(guān)鍵詞： 娃娃菜;Pb脅迫;硝普鈉（SNP）;種子萌發(fā);幼苗生理

中圖分類號： S634.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0607-08

0 引言

【研究意義】鉛（Pb）是重金屬“五毒”之一，對植物具有積累性傷害（Kopyra and Gwó?d?，2003;張茜等，2017），會通過食物鏈危害人體健康（任安芝等，2000;Müller-Moulé et al.，2003;楊翠鳳等，2017）。娃娃菜（Brassica pekinensis）屬于十字花科蕓苔屬白菜，是廣泛種植的高原夏菜，高海拔灌區(qū)需求量大，種植前景廣闊。已有研究表明，甘肅省部分區(qū)域蔬菜鉛超標(biāo)近40%（羅永清等，2010），但目前對Pb污染娃娃菜的程度及毒害機(jī)理尚未明確。硝普鈉（So-dium nitroprusside，SNP）是一種常用外源一氧化氮（NO）供體，能緩解鎘（Cd）、Pb和六價(jià)鉻（Cr6+）等脅迫對農(nóng)作物生長的抑制效應(yīng)（Kopyra and Gwó?d?，2003;孫天國和孫玉斌，2015;劉強(qiáng)等，2016;呂文靜等，2016）。因此，研究外源SNP對Pb脅迫娃娃菜種子萌發(fā)及其幼苗生理特性的影響，對緩解Pb污染娃娃菜的毒害作用及探索解決Pb毒害其他蔬菜的途徑具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】關(guān)于Pb脅迫的研究，魏學(xué)玲等（2011）研究認(rèn)為，Pb脅迫使小麥種子發(fā)芽率降低，幼苗葉綠素含量下降;肖旭峰等（2015）研究表明，60.0 mg/L Pb脅迫對芹菜生物量、根系活力及抗氧化酶活性具有顯著抑制效應(yīng);楊志娟等（2015）研究表明，Pb脅迫導(dǎo)致三葉鬼針草幼苗葉和根的活性氧產(chǎn)生速率顯著升高，造成幼苗嚴(yán)重膜脂過氧化損傷;劉俊華等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，黃瓜種子發(fā)芽率、根長及生物量隨Pb脅迫濃度增加而降低，且對幼苗根的影響大于對芽的影響。關(guān)于NO和SNP作用的研究，Kopyra和Gwó?d?（2003）研究認(rèn)為，SNP可誘導(dǎo)玉米幼苗增強(qiáng)抗逆性，減輕和緩解Cr6+脅迫的傷害;Yi和Kao（2004）、Corpas等（2011）、Mittal等（2012）研究表明，NO參與調(diào)控鹽、重金屬等脅迫下植物的逆境防御反應(yīng);于肇端等（2009）、Molassiotis等（2010）、Siddiqui等（2011）研究發(fā)現(xiàn)，NO作為一種新的信號調(diào)節(jié)分子廣泛分布在植物體內(nèi)，參與種子萌發(fā)、植物光合及呼吸等生理過程;孫天國和孫玉斌（2015）研究顯示，SNP能緩解Cd和Pb對白羽扇豆幼苗及根生長的抑制作用;馬光（2015）研究發(fā)現(xiàn)，SNP能減輕鹽脅迫對大豆幼苗的傷害;劉強(qiáng)等（2016）研究認(rèn)為，適宜濃度SNP能提高鋁脅迫下煙草葉片的光化學(xué)反應(yīng)能力;呂文靜等（2016）研究表明，SNP能顯著緩解Cd脅迫對青菜根生長的抑制效應(yīng)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，關(guān)于娃娃菜的研究多集中于栽培技術(shù)（Kim et al.，2014;周志龍和代惠芳，2015），針對重金屬脅迫下娃娃菜種子萌發(fā)及其幼苗生理特性的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究外源NO供體SNP對Pb脅迫下娃娃菜種子萌發(fā)、幼苗生長及生理特性的影響，為緩解Pb污染娃娃菜的毒害作用及探索解決Pb毒害其他蔬菜的途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試娃娃菜品種為韓國2號，種子購自甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。NO供體SNP（Na2[Fe（CN）5NO]·2H2O）購自Sigma公司，用蒸餾水配成1000.0 μmol/L母液，4 ℃冷藏保存，參照陳銀萍等（2015）的方法，使用時(shí)按SNP濃度0、50.0、100.0、200.0、500.0和1000.0 μmol/L稀釋。Pb脅迫處理使用Pb（NO3）2（國藥試劑），經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定其使用濃度為500.0 mg/L。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 挑選大小一致、籽粒飽滿的娃娃菜種子，以0.1% HgC12浸泡殺菌10 min后用蒸餾水沖洗干凈，整齊擺放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿用1/4濃度Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)，共設(shè)7個處理，分別為蒸餾水對照（CK）、500.0 mg/L Pb（處理1）、500.0 mg/L Pb+50.0 μmol/L SNP（處理2）、500.0 mg/L Pb+100.0 μmol/L SNP（處理3）、500.0 mg/L Pb+200.0 μmol/L SNP（處理4）、500.0 mg/L Pb+500.0 μmol/L SNP（處理5）和500.0 mg/L Pb+1000.0 μmol/L SNP（處理6） ，每處理6個重復(fù)。將培養(yǎng)皿放入人工培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件：溫度25 ℃，光照14 h（6：00—20：00），黑暗10 h（20：00—次日6：00）。播種時(shí)每皿加相應(yīng)濃度處理液10 mL，隨后每天定時(shí)更換處理液，并觀察記錄發(fā)芽數(shù)1次。

1. 2. 2 測定指標(biāo)及方法 娃娃菜種子的發(fā)芽勢于處理后3 d測定，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)[發(fā)芽指數(shù)=Σ（逐日發(fā)芽種子數(shù)/對應(yīng)發(fā)芽日數(shù)）]，發(fā)芽率于處理后6 d統(tǒng)計(jì);處理后第8 d測量種子的芽長、根長、根干重、芽干重、根鮮重和芽鮮重。處理7 d后，將根和芽長勢一致、用于幼苗生理指標(biāo)測定3個重復(fù)的種子移植于口徑15 cm且裝有珍珠巖的花盆中，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天用相應(yīng)的處理液淋施，待幼苗展平3片真葉時(shí)測定其生理指標(biāo)。采用丙酮提取液法測定葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Car）含量，參照李合生（2000）的方法測定脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）含量和相對電導(dǎo)率（REC），參照李忠光等（2002）的方法測定過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析，采用Excel 2016制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SNP對Pb脅迫娃娃菜種子萌發(fā)及其幼苗生長的影響

受Pb脅迫各處理（處理1～處理6）娃娃菜種子的發(fā)芽率均低于CK;處理后第2 d，處理1娃娃菜種子的發(fā)芽率明顯低于CK，處理后第3～5 d均顯著低于CK（P<0.05，下同），分別較CK降低9.54%、10.42%、8.90%和4.11%，說明500.0 mg/L Pb脅迫會明顯抑制娃娃菜種子發(fā)芽;在不同濃度SNP處理（處理2～處理6）中，處理3娃娃菜種子的發(fā)芽率在處理后第2和3 d均較高，與CK差異不顯著（P>0.05，下同），其中處理后第2 d的發(fā)芽率明顯高于其他濃度SNP處理，處理后第3 d明顯高于除500.0 μmol/L SNP處理外的其他濃度SNP處理，至處理后第4和5 d發(fā)芽率仍較高，但與其他濃度SNP處理差異不明顯，說明200.0 μmol/L SNP對緩解Pb脅迫抑制娃娃菜種子發(fā)芽的效果較優(yōu)。

各處理娃娃菜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的變化趨勢與發(fā)芽率相似。其中，處理1的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)較CK分別顯著下降8.99%和14.47%;不同濃度SNP處理（處理2～處理6）中，處理2的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著低于CK，明顯高于處理1，但差異不顯著，處理3～處理6的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均顯著高于處理1，且維持在較高水平，但彼此間差異不顯著。說明100.0～1000.0 μmol/L SNP對緩解Pb脅迫抑制娃娃菜種子發(fā)芽的作用較佳。

由表1可知，處理1娃娃菜幼苗根的鮮重明顯輕于CK，芽鮮重及根和芽干重顯著輕于CK，說明500.0 mg/L Pb脅迫能明顯抑制娃娃菜幼苗根和芽生長;處理2～處理5根和芽的鮮、干重均較處理1有一定程度增加，其中處理3和處理4根和芽的鮮、干重顯著重于處理1，而明顯重于處理5和處理6。說明100.0和200.0 μmol/L SNP對緩解Pb脅迫抑制娃娃菜幼苗根和芽的鮮、干重增加的作用較佳。

2. 2 SNP對Pb脅迫娃娃菜幼苗葉片葉綠素含量的影響

處理1娃娃菜幼苗葉片的Chla、Chlb和Chl（a+b）含量顯著低于CK，Car含量明顯低于CK，說明500.0 mg/L Pb脅迫能顯著抑制娃娃菜幼苗的光合作用。處理2～處理6的Chla、Chlb、Chl（a+b）和Car含量均呈先上升后下降的變化趨勢，其中Chla、Chl（a+b）和Car含量均以處理4最高、處理3次之，與CK差異均不顯著，Chla和Chl（a+b）含量顯著高于處理1，Car含量與處理1差異不顯著。Chlb含量以處理3最高、處理4次之，與CK差異也不顯著，但較處理1顯著增加;處理5和處理6的Chla和Car含量明顯低于處理3和處理4（尤其以處理6的最低），Chlb和Chl（a+b）含量顯著低于處理3和處理4。說明200.0 μmol/L SNP對緩解Pb脅迫抑制娃娃菜幼苗葉片的光合作用效果最佳。

2. 3 SNP對Pb脅迫娃娃菜幼苗葉片REC和MDA含量的影響

處理1娃娃菜葉片的REC和MDA含量均顯著高于CK，說明500.0 mg/L Pb脅迫能顯著促使娃娃菜的膜脂過氧化，電解質(zhì)外滲嚴(yán)重;處理2～處理6的REC和MDA含量雖顯著高于CK，但處理2～處理6的REC及處理2～處理4的MDA含量顯著低于處理1，其中處理3的REC最低，處理4的MDA含量最低。說明100.0 μmol/L SNP對減緩Pb脅迫娃娃菜葉片REC提高的效果最佳，而200.0 μmol/L SNP對減緩Pb脅迫娃娃菜葉片MDA含量增加的效果最佳。

2. 4 SNP對Pb脅迫娃娃菜幼苗葉片抗氧化系統(tǒng)的影響

處理1娃娃菜的SOD活性顯著高于CK，說明500.0 mg/L Pb脅迫促使娃娃菜的活性氧含量增加，其抗氧化酶系統(tǒng)中的SOD被有效激活;處理2～處理4的SOD活性較CK有不同程度升高，其中處理2的SOD活性最高，顯著高于CK和處理1，處理3的SOD活性次之，顯著高于CK，但與處理1差異不顯著，處理4的SOD活性與CK和處理1均無顯著差異;處理5和處理6的SOD活性明顯低于CK，顯著低于處理1。說明高濃度（500.0～1000.0 μmol/L）SNP對娃娃菜的SOD活性具有抑制作用，而低濃度（50.0～200.0 μmol/L）SNP對提高Pb脅迫娃娃菜SOD活性的效果較優(yōu)，其中以50.0 μmol/L SNP處理的效果最佳，100.0 μmol/L處理的效果次之。

娃娃菜的CAT活性變化與SOD活性變化趨勢相似，處理1娃娃菜的CAT活性顯著高于CK，說明500.0 mg/L Pb脅迫促使娃娃菜的活性氧含量增加，其抗氧化酶系統(tǒng)中的CAT被有效激活;處理2～處理6的CAT活性較CK有不同程度升高，其中處理3的CAT活性最高，顯著高于CK和其他處理，處理2的CAT活性次之，顯著高于CK和除處理3外的其他SNP處理，處理4和處理5的CAT活性顯著高于CK，但與處理1無顯著差異，處理6的CAT活性顯著低于處理1，但與CK無顯著差異。說明100.0 μmol/L SNP對提高Pb脅迫娃娃菜葉片CAT活性的效果最佳，50.0 μmol/L SNP處理的效果次之。

處理1娃娃菜的Pro含量高于CK，但差異不顯著;處理2～處理5的Pro含量均高于CK和處理1，其中處理2與CK和其他處理間差異顯著，處理3和處理4與CK和處理1無顯著差異，處理5顯著高于CK，但與處理1無顯著差異;處理6的Pro含量低于CK和處理1，但差異均不顯著。說明50.0 μmol/L SNP對提高Pb脅迫娃娃菜葉片Pro含量的效果最佳，100.0 μmol/L SNP處理的效果次之。

3 討論

Pb是植物體生長的非必需元素，但屬于毒性較大的誘變劑（鄭世英和商學(xué)芳，2006）。NO是調(diào)節(jié)植物對生物與非生物脅迫應(yīng)答的信號分子，也是一種活性氧清除劑（湯紹虎等，2007），但當(dāng)外源NO濃度過高（>10-3 mol/L）時(shí)對生物體具有毒害作用（Zhang et al.，2003）。種子萌發(fā)狀況對植物的生長和生物量積累具有重要影響，因此研究外源NO對重金屬Pb脅迫種子萌發(fā)的影響具有重要意義（張義賢，2004）。本研究結(jié)果表明，Pb脅迫明顯抑制娃娃菜種子萌發(fā)，外源NO供體SNP可不同程度提高Pb脅迫娃娃菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)，特別是當(dāng)SNP濃度為200.0 μmol/L時(shí)尤其明顯，說明適宜濃度SNP能促進(jìn)Pb脅迫娃娃菜種子萌發(fā)，與湯紹虎等（2007）對黃瓜種子的研究結(jié)果一致。

葉綠素和Car作為植物主要的光合色素，其含量變化直接影響植物葉片的光合能力（趙鴻彬等，2007）。根是植物吸收與運(yùn)輸水分和礦質(zhì)元素的重要器官，其生物量變化是植株生長健康與否的重要外在指標(biāo)。張遠(yuǎn)兵等（2009）研究表明，外源NO可顯著提高Pb脅迫下高羊茅根的生物量。王芳等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mmol/L SNP可顯著增加Pb脅迫下玉米幼苗葉片的Chl含量。本研究結(jié)果表明，在500.0 mg/L Pb脅迫下娃娃菜葉片的葉綠素含量較CK顯著下降，Car含量明顯下降，幼苗的根、芽鮮重與干重均較CK明顯下降，而200.0 μmol/L SNP可促使Pb脅迫下娃娃菜葉片的Chla、Chlb和Chl（a+b）含量及幼苗根和芽的鮮、干重顯著增加，且其葉綠素含量及鮮、干重均達(dá)最大值，表明適宜濃度SNP能促進(jìn)Pb脅迫娃娃菜葉片葉綠素合成，提高娃娃菜葉片光合能力，從而促進(jìn)幼苗生長，與張遠(yuǎn)兵等（2009）、王芳等（2014）的研究結(jié)果相似。

在重金屬脅迫下，植物細(xì)胞質(zhì)膜的通透性會發(fā)生不同程度提高，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)功能遭到破壞，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)大量外滲（王芳等，2014），組織液中電解質(zhì)增加引起電導(dǎo)率發(fā)生變化，因此膜的傷害程度可通過測定外滲電導(dǎo)率的變化來反映（陳銀萍等，2015）。膜脂過氧化的最終分解產(chǎn)物是MDA，MDA含量直接反映植物細(xì)胞膜脂過氧化程度，其含量越高膜脂過氧化程度越高，細(xì)胞膜受到的損傷越嚴(yán)重（朱涵毅等，2013）。本研究結(jié)果表明，娃娃菜幼苗在500.0 mg/L Pb脅迫下其MDA含量顯著增加，REC顯著提高，說明Pb脅迫對娃娃菜葉片細(xì)胞膜產(chǎn)生了顯著傷害，而經(jīng)不同濃度SNP處理后，Pb脅迫處理娃娃菜的MDA含量明顯減少，REC顯著降低，說明SNP能有效緩解Pb脅迫對娃娃菜細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)造成的損傷。

在植物生長代謝過程中會產(chǎn)生大量有害活性氧，加速植株衰亡，而植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)（包括POD、CAT和SOD系統(tǒng)）具有清除活性氧的作用。在重金屬脅迫下，植物細(xì)胞膜受損，發(fā)生膜脂過氧化，此時(shí)植物體抗氧化酶系統(tǒng)可將活性氧清除以維持植物體內(nèi)環(huán)境平衡（陳銀萍等，2015）。SOD是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶，可將超氧自由基歧化為H2O2，CAT則將H2O2進(jìn)一步降解成H2O，在維持H2O2動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用（于肇端等，2009）。在重金屬脅迫下，活性氧含量顯著增加，抗氧化酶系統(tǒng)出現(xiàn)失調(diào)，而SNP釋放NO促進(jìn)抗氧化酶活性增強(qiáng)。本研究結(jié)果表明，娃娃菜幼苗在Pb脅迫下，其抗氧化酶SOD和CAT被顯著激活，而施加50.0和100.0 μmol/L SNP后SOD和CAT活性分別達(dá)最大值，但隨SNP濃度的增加SOD活性大幅降低，表明適宜濃度SNP能促進(jìn)Pb脅迫娃娃菜SOD和CAT活性升高，從而提高植株抗氧化能力，與劉建新等（2009）對黑麥草、劉柿良等（2014）對長春花的研究結(jié)果相似。Pro是具有滲透調(diào)節(jié)和抗氧化能力的植物蛋白，逆境脅迫時(shí)Pro在植物體細(xì)胞中發(fā)生累積（樊懷福和郭世榮，2007），維持細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，保護(hù)酶和膜系統(tǒng)免受毒害。于肇端等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，Pro能提高黃瓜幼苗的抗氧化能力，外源NO能促進(jìn)Cd脅迫下黃瓜幼苗Pro積累。谷文英等（2013）研究發(fā)現(xiàn)，SNP能促進(jìn)鹽脅迫下菊苣葉片Pro生成與積累。本研究結(jié)果表明，500.0 mg/L Pb脅迫下娃娃菜幼苗的Pro含量明顯增加，而50.0 μmol/L SNP能顯著提高Pb脅迫娃娃菜幼苗的Pro含量，但高濃度（500.0～1000.0 μmol/L）SNP對Pb脅迫娃娃菜幼苗的Pro合成與積累產(chǎn)生抑制作用，與于肇端等（2009）、谷文英等（2013）的研究結(jié)果吻合。

本研究中，經(jīng)低濃度（50.0～200.0 μmol/L）SNP處理后娃娃菜幼苗的REC降低，MDA含量減少，SOD和CAT活性升高，可促進(jìn)Pro積累，從而緩解Pb脅迫對娃娃菜幼苗的氧化損傷;但經(jīng)高濃度（500.0和1000.0 μmol/L）SNP處理后幼苗的MDA含量增加，REC升高，SOD和CAT活性及Pro含量降低，娃娃菜幼苗損傷加劇，與劉柿良等（2014）對長春花、陳銀萍等（2015）對紫花苜蓿的研究結(jié)果相似。因此，只有適宜濃度的SNP才能有效緩解Pb脅迫對娃娃菜幼苗的毒害作用，高濃度SNP對Pb脅迫娃娃菜幼苗無緩解甚至加劇氧化損傷，可能與高濃度NO會與活性氧族（ROS）反應(yīng)，并最終生成對植物具有毒性的過氧亞硝酸（HOONO）有關(guān)（楊志娟等，2015）。

4 結(jié)論

在500.0 mg/L Pb脅迫下，娃娃菜種子萌發(fā)受到抑制，其根與芽的鮮、干重下降，幼苗的REC升高，MDA和Pro含量增加，抗氧化酶活性和葉綠素含量降低。低濃度（50.0～200.0 μmol/L）外源SNP能通過增強(qiáng)娃娃菜的抗氧化酶活性和促進(jìn)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)生成以減輕膜脂過氧化作用，使娃娃菜的生理代謝趨于穩(wěn)定，從而提高娃娃菜的耐Pb脅迫能力。

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（責(zé)任編輯 思利華）