不同品種桑樹根際土壤細(xì)菌多樣性的高通量測序分析

邱潔 侯怡鈴 徐麗麗 錢葉 丁祥

摘要：【目的】探究不同品種桑樹根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其分布規(guī)律，為促進(jìn)桑樹的生長發(fā)育、提高其經(jīng)濟(jì)利用價值和培育更高品質(zhì)的桑樹品種提供參考?！痉椒ā繉?個品種桑樹（粵椹大10、嘉陵30號和紅果1號）根際土壤細(xì)菌的16S rDNA序列V3～V5高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，分析土壤中細(xì)菌群落多樣性及分布規(guī)律?！窘Y(jié)果】3個土壤樣品中共檢測出細(xì)菌26門76綱88目149科370屬。不同品種桑樹根際土壤樣品中的細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)存在一定差異，豐富度方面表現(xiàn)為嘉陵30號>粵椹大10>紅果1號;多樣性方面表現(xiàn)為紅果1號>嘉陵30號>粵椹大10。3個品種桑樹的根際土壤細(xì)菌在門綱目科屬水平上的優(yōu)勢菌群及所占比例分別為變形菌門（Proteobacteria，37.2%）、α-變形菌綱（Alphaproteobacteria，24.3%）、擬桿菌目（Bacteroidales，24.3%）、擬桿菌科（Bacteroidaceae，14.2%）、擬桿菌屬（Bacteroides，14.2%）;隨著分類的細(xì)化，不同桑樹品種對土壤細(xì)菌群落組成和分布的影響越大?！窘Y(jié)論】變形菌門在3種桑樹根際土壤中均是最優(yōu)勢細(xì)菌類群，嘉陵30號桑樹品種根際土壤細(xì)菌種類最多，紅果1號桑樹品種土壤細(xì)菌分布最均勻。根際土壤細(xì)菌群落種類和均勻度可作為桑樹差異規(guī)模化種植的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞： 桑樹;根際土壤;細(xì)菌;多樣性;高通量測序

中圖分類號： S888.5? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?   文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0585-08

0 引言

【研究意義】土壤細(xì)菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，參與養(yǎng)分元素循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解及能量轉(zhuǎn)換，在保持生態(tài)系統(tǒng)的功能、穩(wěn)定性及生產(chǎn)力等方面均發(fā)揮關(guān)鍵作用，是衡量土壤生產(chǎn)力和質(zhì)量的重要指標(biāo)（王衛(wèi)霞等，2013;馮丹妮等，2014;張文元等，2015;尹玉玲等，2017）。在土地覆被過程中，土壤特性、氣候因子和植被群落等均會影響土壤的細(xì)菌群落（Li et al.，2014;Tkacz and Poole，2015）。土壤有機(jī)質(zhì)含量與細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)間一般具有很好的線性關(guān)系（王傳杰等，2018）。土壤細(xì)菌不僅推動了土壤的物質(zhì)循環(huán)和生化反應(yīng)（劉銀銀等，2013），土壤細(xì)菌群落的變化還會影響土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化和吸收，從而影響植物生長代謝（孫波等，2017）。不同植物類型根系分泌物和凋落物的質(zhì)量又反作用于土壤細(xì)菌群落的生長發(fā)育，造成某些細(xì)菌群落的出現(xiàn)或消亡（陳心想等，2014;潘彥碩等，2018;王美溪等，2018）。桑（Morus alba L.）為?？粕僦参?，其葉是家蠶重要的飼料，是蠶絲產(chǎn)業(yè)發(fā)展的必須物質(zhì)基礎(chǔ)（Jia et al.，2014;向仲懷等，2017），因此，了解桑樹根標(biāo)土壤細(xì)菌組成多樣性對保障桑葉生產(chǎn)和促進(jìn)蠶絲產(chǎn)業(yè)發(fā)展均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Carvalhais等（2013）通過擬南芥在無菌土壤和非無菌土壤中生長對比試驗(yàn)，證明擬南芥在整個細(xì)菌群落存在條件下比細(xì)菌貧乏時表現(xiàn)出更強(qiáng)的生長力。Muehe等（2015）通過對鼠耳芥根際細(xì)菌組成與植物對鎘和鋅的吸收研究，證明土壤細(xì)菌可直接或間接影響植物對金屬元素的吸收。崔佩佩等（2018）采用Biolog微平板法研究不同施肥條件下高粱根際土壤細(xì)菌功能多樣性的變化，結(jié)果證明施肥能改善土壤細(xì)菌的功能多樣性。蔣景龍等（2018）采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對西洋參根腐病病株和健株根際土壤細(xì)菌的組成及多樣性變化進(jìn)行研究，結(jié)果顯示鞘脂菌屬（Sphingobium）和紅游動菌屬（Rhodoplanes）可能是引起西洋參根腐病的重要菌群。對于桑樹根際土壤細(xì)菌的研究，目前主要采用傳統(tǒng)方法探究不同施肥方案、作物間作等對根際土壤細(xì)菌種類變化、重金屬含量、酶活性差異的影響（楊統(tǒng)一等，2015;張萌萌等，2015）。鄧文等（2016）采用Biolog微生態(tài)技術(shù)研究偏施氮肥桑樹根際土壤細(xì)菌對碳源利用的能力變化，證明4年偏施氮肥桑樹根際土壤細(xì)菌多樣性及活性均高于其他方法處理的土壤。樊芳玲等（2016）利用磷脂脂肪酸（PLFA）法分析不同模式的坡耕地—桑樹系統(tǒng)對旱坡地紫色土壤中細(xì)菌群落的影響，證明種植桑樹能顯著提高土壤中PLFA含量，改善細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】高通量測序技術(shù)能產(chǎn)生測序覆蓋深度更高的基因數(shù)據(jù)，在細(xì)菌群落組成研究中能真實(shí)地揭示環(huán)境中細(xì)菌群落的多樣性和復(fù)雜性。目前針對不同品種桑樹根際土壤細(xì)菌多樣性的高通量測序分析研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對不同品種桑樹根際土壤細(xì)菌的16S rDNA序列V3～V5高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，分析土壤中細(xì)菌群落多樣性及分布規(guī)律，了解不同品種桑樹根際土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、物種組成和差異，探究根際土壤細(xì)菌與桑樹的相互關(guān)系，為促進(jìn)桑樹的生長發(fā)育、提高其經(jīng)濟(jì)利用價值及培育出更高品質(zhì)的桑樹品種提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

土壤樣品采自四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所瀠溪桑園，分別以粵椹大10（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所選育）、嘉陵30號和紅果1號（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所選育）3種果桑根際土壤作為采樣區(qū)，隨機(jī)在每個采樣區(qū)設(shè)4個采樣點(diǎn)，每個采樣點(diǎn)采集10份土壤樣品（0～10 cm），使用S形采樣法，剔除石塊和植物根系，混合均勻并過2 mm篩，以四分法篩取所得土樣為同一樣品，再裝入已滅菌的采樣袋，分別編號為LCF20、LCF21和LCF22，于冰盒中保存。

1. 2 總DNA提取、16S rDNA序列擴(kuò)增及高通量測序

根據(jù)Fast DNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedical，USA）的使用說明，加入溶菌酶（上海源葉生物科技有限公司）60 mg/mL輔助提取土壤細(xì)菌的總DNA。用1%瓊脂糖凝膠對總DNA進(jìn)行電泳檢測，電泳條件為120 V、45 min，總DNA條帶單一清晰，無嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，可用于后續(xù)體外擴(kuò)增。用引物515F/907R擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列的V3～V5區(qū)域。反應(yīng)體系25.0 μL：Dream Taq PCR Master Mix（2×）12.5 μL，DNA模板1.0 μL，515F/907R引物各0.5 μL，去離子水補(bǔ)足至25.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行10個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.5 ℃;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行25個循環(huán);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，將單一清晰沒有拖尾現(xiàn)象條帶對應(yīng)的樣本送至北京金諾銳杰基因科技有限公司測序，并采用MiSeq測序儀完成測序工作（Lu et al.，2015;Navarrete et al.，2015;Lossius et al.，2016）。

1. 3 高通量測序數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過低質(zhì)量過濾、去接頭等后得到高質(zhì)量的基因序列Reads，然后合并正反向Reads，獲得16S rDNA序列V3～V5區(qū)擴(kuò)增子。利用Flash 8.0合并正方向Reads，合并后序列輸出，并使用FastQC進(jìn)行質(zhì)控分析。采用Usearch61檢查嵌合體，De novo方式去除嵌合體序列，再對小片段文庫進(jìn)行組裝，獲得該物種的基因組序列圖譜。對所有分離的高質(zhì)量樣本序列進(jìn)行聚類分析，即一個OTU（同源性為97%），再劃分操作分類單元（OTUs），并構(gòu)建稀釋曲線及進(jìn)行聚類分析。

Chao1指數(shù)計(jì)算公式：Schao1=Sobs+n1（n1-1）/2（n2+1），其中，Schao1為估計(jì)的OUT數(shù)，Sobs為觀測到的OTU數(shù)，n1為只有一條序列的OUT數(shù)目，n2為只有兩條序列的OUT數(shù)目。

Shannon指數(shù)計(jì)算公式：H'=-∑（Pi）（lnPi），其中，Pi為此細(xì)菌個體數(shù)占總個體數(shù)比例。

相對豐度計(jì)算公式：D=（S-1）/lnN，其中，S為群落中的特定細(xì)菌總數(shù)目，N為群落中所有細(xì)菌的總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同品種桑樹根際土壤細(xì)菌多樣性分析結(jié)果

用Chao1指數(shù)表示細(xì)菌群落的豐富度，其值越高反映細(xì)菌群落物種豐富度越高，細(xì)菌種類越多。顯示3個樣品的細(xì)菌群落豐富度均隨測序深度的增加而增加，隨后逐漸趨于平緩，此時嘉陵30號的細(xì)菌群落豐富度最高，粵椹大10次之，紅果1號最低。用Shannon指數(shù)表示樣品的細(xì)菌多樣性程度，其值越高反映細(xì)菌群落的物種多樣性越高，分布也越均勻。當(dāng)3個樣品的Shannon指數(shù)曲線最終趨于平緩時，紅果1號的細(xì)菌多樣性程度最高，粵椹大10最低。

2. 2 在門水平上的細(xì)菌群落豐度分析結(jié)果

從門水平來看，細(xì)菌種類最多的品種是嘉陵30號（26門），最少的是粵椹大10（24門）。變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度較高，分別為37.2%、25.4%和14.1%，在3個土壤混合樣品中3種細(xì)菌門的相對豐度之和占土壤細(xì)菌總量的76.7%。將群落相對豐度水平位于前10的細(xì)菌（相對豐度>0.4%）按照樣品和分類進(jìn)行聚類后繪制熱圖，結(jié)果顯示，3個樣品中的細(xì)菌大致分為兩簇，梭桿菌門（Fusobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimona-detes）和厚壁菌門等親緣關(guān)系較近的聚為一簇，硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）等聚為另一簇。不同品種桑樹根際土壤中細(xì)菌的相對豐度有一定差異，其中，酸桿菌門在紅果1號和嘉陵30號中的相對豐度較高，在粵椹大10中的相對豐度較低;硝化螺旋菌門和綠彎菌門在紅果1號中的相對豐度較高，在嘉陵30號和粵椹大10中的相對豐度較低。

2. 3 在綱水平上的細(xì)菌群落豐度分析結(jié)果

3個土壤樣品中的細(xì)菌在綱水平上群落組成最多的是粵椹大10和嘉陵30號（76綱），最少的是紅果1號（74綱）。α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）、β-變形菌綱（Betaproteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、擬桿菌綱（Bacteroidia）和梭狀芽胞桿菌綱（Clostridia）等5個細(xì)菌綱的相對豐度較高，分別為24.3%、16.0%、12.3%、11.2%和7.7%，在3個土壤混合樣品中5個細(xì)菌綱的相對豐度之和占土壤細(xì)菌總豐度的71.5%。將群落相對豐度水平位于前20的細(xì)菌（相對豐度>0.4%）按照樣品和分類進(jìn)行聚類后繪制熱圖，結(jié)果顯示，嘉陵30號與粵椹大10細(xì)菌種類的組成相比紅果1號而言更相似;3個樣品中的細(xì)菌大致分為兩簇，α-變形菌綱和擬桿菌綱等7個綱親緣關(guān)系較的近聚為一簇，γ-變形菌綱和β-變形菌綱等13個綱聚為另一簇。

2. 4 在目水平上的細(xì)菌群落豐度分析結(jié)果

3個土壤樣品中的細(xì)菌在目水平上的群落組成分別是紅果1號88目、嘉陵30號71目和粵椹大10 78目。擬桿菌目（Bacteroidales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）、梭菌目（Clostridiales）、酸桿菌目（Acidobacteriales）和伯克氏菌目（Burkholderiales）等5個細(xì)菌目的相對豐度較高，分別為24.3%、12.3%、10.6%、4.1%和3.8%，在3個土壤混合樣品中5個細(xì)菌目的相對豐度之和占土壤細(xì)菌總豐度的55.1%。將相對豐度位于前30的細(xì)菌（相對豐度>0.4%）按照樣品和分類進(jìn)行聚類后繪制熱圖，3個樣品中的細(xì)菌大致分為兩簇，擬桿菌目和梭菌目等14個目親緣關(guān)系較近的聚為一簇，酸桿菌目和伯克氏菌目等16個目聚為另一簇。在目水平上，3個樣品中的細(xì)菌組成存在差異，如黃單胞桿菌目（Xanthomonadales）和紅螺菌目（Rhodospirales）在紅果1號中的相對豐度較高，在嘉陵30號和粵椹大10中的相對豐度較低。

2. 5 在科水平上的細(xì)菌群落豐度分析結(jié)果

3個土壤樣品中的細(xì)菌在科水平上的群落組成最多的是紅果1號（149科），嘉陵30號（116科）和粵椹大10（118科）相對較少。擬桿菌科（Bacteroidaceae，14.2%）、腸桿菌科（Enterobacteriaceae，10.6%）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae，8.3%）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae，5.6%）、酸桿菌科（Acidobacteriaceae，3.2%）、毛螺菌科（Lachnospiraceae，2.6%）和韋榮氏菌科（Veillonellaceae，3.2%）等7個細(xì)菌的相對豐度較高，在3個土壤混合樣品中7個細(xì)菌科的相對豐度之和占土壤細(xì)菌總豐度的47.7%。將相對豐度位于前40的細(xì)菌（相對豐度>0.2%）按照樣品和分類進(jìn)行聚類后繪制熱圖，3個樣品中的細(xì)菌大致分為兩簇，梭桿菌科（Fusobacteriaceae）和黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）等26個科聚為一簇，瘤胃菌科和韋榮氏菌科等14個科聚為另一簇。在科水平上，隨著分類的細(xì)化，桑樹品種對細(xì)菌群落組成的影響越大。如鞘酯菌科（Sphingomonadaceae）在嘉陵30號中的相對豐度較高，在粵椹大10和紅果1號中的相對豐度較低。

2. 6 在屬水平上的細(xì)菌群落豐度分析結(jié)果

3個土壤樣品中共有細(xì)菌屬370個，其中單個樣品最多的是嘉陵30號（370屬），紅果1號（354屬）和粵椹大10（351屬）相對較少。擬桿菌屬（Bacteroides，14.2%）、普氏菌屬（Prevotella，8.3%）、棲糞桿菌屬（Faecalibacterium，3.1%）、奈瑟氏球菌屬（Neisseria，2.1%）、鏈球菌屬（Streptococcus，1.2%）、薩特氏菌屬（Sutterella，1.2%）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium，1.1%）、不動桿菌屬（Acinetobacter，1.1%）和巨單胞菌屬（Megamonas，1.0%）等9個細(xì)菌屬相對豐度較高，在3個土壤混合樣品中9個細(xì)菌屬的相對豐度之和占土壤細(xì)菌總豐度的33.3%。將相對豐度位于前50的細(xì)菌（相對豐度>0.1%）分別按照樣品和分類進(jìn)行聚類后繪制熱圖，3個樣品中的細(xì)菌大致分為兩簇，羅氏菌屬（Roseburla）和薩特氏菌屬等37個屬聚為一簇，硝化螺菌屬（Nitrospira）和黃桿菌屬（Flavobacterium）等13個屬聚為另一簇。各樣品屬級分類聚類分析結(jié)果顯示，在屬的水平上，莫拉氏菌（Kaistobacter）在嘉陵30號中的相對豐度較高，在粵椹大10和紅果1號中則相對較低;艾克曼菌屬（Akkermansia）在紅果1號中未檢測出;分枝桿菌屬（Ramlibacter）在粵椹大10中未檢測出。

3 討論

土壤作為細(xì)菌的天然培養(yǎng)基，含有大量且豐富的細(xì)菌種類。相比于傳統(tǒng)測序技術(shù)，使用高通量測序技術(shù)對土壤細(xì)菌多樣性的研究鮮見報道，且高通量測序產(chǎn)出的數(shù)據(jù)量是傳統(tǒng)測序技術(shù)無法比擬（明磊等，2018）。本研究采用高通量測序技術(shù)對3個不同品種的桑樹根際土壤細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，分析了3個不同品種桑樹根際土壤細(xì)菌在門、綱、目、科、屬不同分類水平上的優(yōu)勢類群，共檢測出包括擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門等優(yōu)勢菌門在內(nèi)的26門，其中變形菌門是最豐富的細(xì)菌類群，與Constancias等（2015）、Docherty等（2015）的研究結(jié)果一致。但Heiko等（2016）發(fā)現(xiàn)酸桿菌門是歐洲山毛櫸和挪威云杉根際土壤中含量最豐富的細(xì)菌類群;而Kristin等（2016）在溫帶草原和森林土壤中發(fā)現(xiàn)放線菌門（Actinobacteria）是占主導(dǎo)地位的細(xì)菌類群，說明不同植物根際土壤中存在不同的優(yōu)勢細(xì)菌類群。

本研究共測出包括α-變形菌綱和β-變形菌綱等優(yōu)勢菌綱在內(nèi)的76綱;擬桿菌目和腸桿菌目等優(yōu)勢菌目在內(nèi)的88目，擬桿菌科和腸桿菌科等優(yōu)勢菌科在內(nèi)的149科，擬桿菌屬和普氏菌屬等優(yōu)勢菌屬在內(nèi)的370屬。3種不同品種桑樹根際間土壤細(xì)菌在門綱目科屬水平上的優(yōu)勢菌群及所占總比例分別為變形菌門（37.2%）、α-變形菌綱（24.3%）、擬桿菌目（24.3%）、擬桿菌科（14.2%）、擬桿菌屬（14.2%）。但隨著分類的細(xì)化，不同的桑樹品種對細(xì)菌群落組成和分布的影響越大，在目科屬水平上差異更明顯。如黃單胞桿菌目和紅螺菌目在紅果1號中的相對豐度較高，鞘酯菌科在嘉陵30號中的相對豐度較高，而分枝桿菌屬在粵椹大10中未檢測出。土壤細(xì)菌群落多樣性不僅與植物種類有關(guān)，還與土壤落葉層、腐殖質(zhì)及理化性質(zhì)有關(guān);同時，桑樹根系的生理活動能改善土壤理化性質(zhì)，使之適應(yīng)土壤中細(xì)菌的生長（Tkacz et al.，2015）。實(shí)際應(yīng)用中可根據(jù)桑樹品種的不同，選擇合適的栽培土壤，改善土壤理化性質(zhì)并施用高效細(xì)菌肥料，以促進(jìn)桑樹根際間土壤優(yōu)勢細(xì)菌群落的形成，從而促進(jìn)桑樹生長。

4 結(jié)論

變形菌門在供試3種桑樹品種根際土壤中均是最優(yōu)勢細(xì)菌類群，嘉陵30號桑樹品種根際土壤細(xì)菌種類最多，紅果1號桑樹品種土壤細(xì)菌分布最均勻。根際土壤細(xì)菌群落種類和均勻度可作為桑樹差異規(guī)模化種植的指標(biāo)。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）