印楝種子粗提物誘導(dǎo)煙草炭疽病抗性的生理效應(yīng)

胡亞杰 韋建玉 王麗晶 陳吉榮 張紀(jì)利 江定心

摘要：【目的】研究印楝誘抗煙草炭疽病的機(jī)理，為煙草炭疽病的生物防治提供理論依據(jù)?！痉椒ā繙y(cè)定根施印楝種子粉末對(duì)煙草炭疽病的防效，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)印楝種子粉末處理后煙草的NTF6、NtLox、NtSGT1、NtPAL、NtPDF、NPR1、NtRar1和PR1a等8個(gè)相關(guān)抗病基因的表達(dá)變化;對(duì)比葉面噴施不同印楝種子提取物（甲醇、乙酸乙酯和石油醚）溶液對(duì)煙草抗氧化酶活性的影響，并測(cè)定葉面噴施印楝種子甲醇提取物不同分離流分處理的煙葉總酚含量及抗炭疽病效果?！窘Y(jié)果】根施印楝種子粉末可使煙草炭疽病的病情指數(shù)（26.67%）較對(duì)照（74.17%）顯著降低（P<0.05，下同）。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等4個(gè)抗病基因的相對(duì)表達(dá)量與印楝誘導(dǎo)煙草抗炭疽病相關(guān)。印楝種子甲醇提取物對(duì)煙草抗氧化酶活性的影響最大，其丙酮流分段在處理后6和96 h誘導(dǎo)煙草的總酚含量較對(duì)照明顯提高，分別為對(duì)照的2.52和3.34倍，且其誘導(dǎo)煙草抗炭疽病的能力最強(qiáng)，病情指數(shù)（25.00%）顯著低于對(duì)照（69.17%）。【結(jié)論】印楝種子提取物通過誘導(dǎo)提高PPO和POD抗病相關(guān)酶活性及誘導(dǎo)NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等抗病相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生抗炭疽病作用，且誘導(dǎo)活性成分主要存在于甲醇提取物的丙酮流分，其可作為煙草炭疽病的誘抗劑推廣應(yīng)用于煙草生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞： 煙草;炭疽病;印楝種子粗提物;誘導(dǎo)抗性;抗性機(jī)理

中圖分類號(hào)： S572.01? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）03-0524-09

0 引言

【研究意義】煙草炭疽?。–olletotrichum nicotia-nae Av. Sacca）是煙草的主要病害之一（孔凡彬等，2006）。目前防治煙草炭疽病仍以化學(xué)防治為主，由于缺乏對(duì)炭疽病抗藥性狀況的了解，一味增加用藥量及用藥次數(shù)，極易對(duì)環(huán)境造成污染，并引起病菌抗藥性，特別是煙葉農(nóng)藥殘留偏高，給煙葉出口和卷煙安全性帶來不利影響（董志堅(jiān)等，2004）。植物誘抗劑能誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，且具有系統(tǒng)性、廣譜性、安全性和持續(xù)性等特點(diǎn)，近年來已逐漸成為綠色農(nóng)藥開發(fā)的重要方向（劉勇鵬等，2017）。印楝（Azadirachta indica A. Juss）是世界上公認(rèn)的最優(yōu)秀生物農(nóng)藥之一。印楝可殺蟲、抗菌和治病，在農(nóng)業(yè)、園藝、花卉栽培、化妝品和醫(yī)藥等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值（Amadioha，1998），且其活性成分在自然界中無(wú)累積，對(duì)環(huán)境安全，對(duì)作物不產(chǎn)生藥害，特別適用于蔬菜、水果、煙草和茶葉等直接食用的作物（徐漢虹等，2017）。因此，探究印楝誘導(dǎo)煙草抗炭疽病的機(jī)理具有重要理論意義和應(yīng)用價(jià)值，并為印楝在防治煙草炭疽病中的應(yīng)用提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】吳鉅文和陳建峰（2002）研究表明，印楝制劑Tril-ogy[?]和Triac[?] 90% EC可用于防治果樹和作物的斑點(diǎn)落葉病、炭疽病及早疫病等真菌病害。趙淑英等（2004）比較了印楝素和苦楝素對(duì)4種常見植物病原菌的抑制效果，結(jié)果表明印楝素和苦楝素均具有較好的抑菌活性，且印楝素的抑菌活性明顯高于苦楝素，其中以甲醇提取物的活性最高。林靖凌等（2008）發(fā)現(xiàn)印楝的甲醇提取物對(duì)番木瓜炭疽病病原菌的抑制率可達(dá)39.72%。葉敏等（2009）研究表明，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，印楝素對(duì)植物病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，但各供試病原菌抑制率隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加的速率存在差異。江厚龍等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，誘抗劑處理后的煙草葉片，其抗性相關(guān)酶[過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）]活性均有所提高。賴多等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，印楝渣生物藥肥可有效控制香蕉枯萎病，且可促進(jìn)香蕉的生長(zhǎng)。楊鑫等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，植物誘抗劑可通過增強(qiáng)抗氧化酶的活性及降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化[丙二醛（MDA）含量]來激活植株的系統(tǒng)抗病性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】印楝種子提取獲得的印楝素一直是農(nóng)藥學(xué)的研究熱點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外有關(guān)印楝素和印楝的文獻(xiàn)報(bào)道已有2000多篇（徐漢虹等，2017），但針對(duì)印楝提取物在煙草炭疽病防治方面的研究尚未見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以煙草品種K326為試驗(yàn)材料，研究印楝對(duì)煙草炭疽病的誘抗作用，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)探究8個(gè)相關(guān)抗病基因的誘導(dǎo)表達(dá)，并測(cè)定印楝粗提物對(duì)煙草抗氧化酶活性和總酚含量變化的影響及煙草炭疽病誘導(dǎo)抗病效果，為利用印楝進(jìn)行煙草炭疽病的生物防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試煙草品種K326由廣東煙草南雄科學(xué)研究所提供。印楝種仁采集自四川，低溫干燥，粉碎過20目篩。煙草炭疽病菌（C. nicotianae）由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理研究室提供。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 印楝誘導(dǎo)煙草炭疽病抗性測(cè)定

1. 2. 1. 1 煙苗培育 參照李海賓和于嘉（2012）的方法在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行煙苗培育，以大田土壤裝缽，每缽1000 g，在14～24 ℃、光照12 h/d、濕度30%條件下育苗，每周施一次營(yíng)養(yǎng)液，每缽約50 mL。

1. 2. 1. 2 接種菌液制備 參照李東升（2010）的方法，將炭疽病病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上（200 g/L馬鈴薯，20 g/L葡萄糖，15 g/L瓊脂）28 ℃培養(yǎng)7 d，待充分產(chǎn)孢后，加入含0.02%（v/v）吐溫-20的無(wú)菌水10 mL浸泡15 min，用無(wú)菌棉簽洗下孢子和菌絲體，經(jīng)無(wú)菌脫脂棉過濾，除去菌絲體，稀釋成1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液。

1. 2. 1. 3 接種方法 煙苗培養(yǎng)至5～6片葉時(shí)，以每株煙草根施60 g印楝種子粉末為處理，以不施用印楝種子粉末為對(duì)照。在溫度25～26 ℃、濕度55%～60%條件下保濕3 d后接種。接種方法參照賓金華等（2000）方法，煙草葉片表面用無(wú)菌水擦拭干凈，將少量細(xì)金剛砂（600目）撒在待接種的煙草葉面上，手指在葉面上輕輕摩擦，然后用1×107個(gè)/mL的炭疽病孢子懸浮液涂抹于葉片表面直至形成一層水膜，接種后放置在溫度25～26 ℃、濕度55%～60%的恒溫箱中黑暗培育12 h，黑暗處理后放回溫室中培育，溫室中提供穩(wěn)定光源，光照時(shí)間為12 h/d，溫度控制在25～26 ℃，濕度為55%～60%。每處理接種30株煙苗，發(fā)病后逐株調(diào)查病情指數(shù)。

1. 2. 1. 4 植株病情調(diào)查 參照王金華（2005）的方法，以病斑擴(kuò)展垂直兩個(gè)方向的平均寬度計(jì)算單個(gè)病斑的直徑（d），進(jìn)而計(jì)算每個(gè)接種斑點(diǎn)的面積，病斑面積（mm2）=3.14×（d/2）2。

炭疽病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（陳瑞泰等，1997）：0級(jí)，全葉無(wú)病;1級(jí)，病斑面積占整片葉的5%以下;2級(jí)，病斑面積占整片葉的5%～10%;3級(jí)，病斑面積占整片葉的10%～25%;4級(jí)，病斑面積占整片葉的25% 以上。

病性指數(shù)=[（病株數(shù)×發(fā)病級(jí)數(shù)）總株數(shù)×最高發(fā)病級(jí)別數(shù)]×100

1. 2. 2 印楝誘導(dǎo)煙草抗性相關(guān)基因表達(dá)測(cè)定

1. 2. 2. 1 樣品處理 溫室培養(yǎng)至5～6片葉的K326煙苗，以每株根施60 g印楝種子粉末為處理，以不施用印楝種子粉末為對(duì)照。在溫度25～26 ℃、濕度55%～60%條件下保濕3 d后接種，在接種后1、3、5、7和9 d各取樣1次，炭疽病接種試驗(yàn)和煙草的培養(yǎng)參考1.2.1。

1. 2. 2. 2 總RNA提取及cRNA合成 采用RNAiso Plus試劑盒（TaKaRa）提取處理后的煙草RNA，以RNA為模板利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA鏈，再利用DNA聚合酶合成第二條cDNA鏈。

1. 2. 2. 3 qRT-PCR檢測(cè) 利用SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）在TP900 Thermal Cycler DiceTM Real Time System（TaKaRa）上進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，利用Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物（表1），由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系25.0 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，10.0 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃ 預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。在每一個(gè)循環(huán)的退火階段收集熒光進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，反應(yīng)結(jié)束后，得到含有所有標(biāo)本的記錄點(diǎn)曲線。最終顯示的數(shù)據(jù)通過2-ΔΔCt方法，以β-actin為內(nèi)參基因。對(duì)于每個(gè)樣品，將兩個(gè)相對(duì)獨(dú)立的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合并在一起，所有的qRT-PCR檢測(cè)均依據(jù)相同的合成cDNA。每次試驗(yàn)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。

1. 2. 3 印楝種子粗提物對(duì)煙草POD、PPO和PAL活性的影響

1. 2. 3. 1 印楝種子有效成分提取 將印楝種仁低溫干燥，粉碎過20目篩，取20 g粉末置于三角瓶中，分別用甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取濃縮濾液。甲醇提取物處理后為淺黃色粉末，乙酸乙酯提取物為褐色膏狀物，石油醚提取物為油狀物。將3種不同的印楝提取物分別置于冰箱內(nèi)冷藏備用。

1. 2. 3. 2 煙草處理 煙草培養(yǎng)至5～6片葉時(shí)，分別噴施3種印楝萃取物配制成的溶液，以噴施清水為對(duì)照。每處理重復(fù)3次。在溫度25～26 ℃、濕度55%～60%下保濕3 d后接種。在接種后1、3、5、7、9和11 d分別取樣1次，測(cè)定PLA、PPO和POD活性。

1. 2. 3. 3 粗酶液制備 PPO和POD粗酶液：取煙葉0.5 g，放入預(yù)冷研缽中液氮速凍，加入0.1 mol/L、 pH 6.8的磷酸緩沖液1.5 mL和少量石英砂，冰浴中研磨成勻漿。將勻漿液全部轉(zhuǎn)入離心管中，于4 ℃、12000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液，轉(zhuǎn)入 5 mL試管待用。PAL粗酶液制備參照Gonzalez-Aguilar等（2004）的方法：取煙葉0.5 g，放入預(yù)冷的研缽中液氮速凍，加入0.1 mol/L pH 8.8的硼酸緩沖液（含5 mmol/L巰基乙醇、1 mmol/L EDTA及1% PVP）1.5 mL，在冰浴中研磨成勻漿，然后于4 ℃下12000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液，轉(zhuǎn)入5 mL試管待用。

1. 2. 3. 4 酶活性測(cè)定 PPO活性測(cè)定參照Tan和Harris（1995）的方法，反應(yīng)體系：0.1 mL粗酶液、0.02 mol/L鄰苯二酚溶液1.4 mL（用pH 6.8緩沖液配制）、1.5 mL磷酸緩沖液。對(duì)照組中以磷酸緩沖液代替粗酶液，其他同反應(yīng)體系。室溫下測(cè)定410 nm處吸光值，每30 s記錄1次，連續(xù)測(cè)定3 min，以每分鐘吸光值變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U），每處理重復(fù)3次。

POD活性測(cè)定參照李易興（2016）的方法，反應(yīng)體系：2.9 mL pH 6.0磷酸緩沖液、0.1 mL粗酶液、0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚30 μL（用pH 6.0磷酸緩沖液配制后于30 ℃水浴中保溫10 min）、30%過氧化氫50 μL。對(duì)照組中以磷酸緩沖液代替粗酶液，其他同反應(yīng)體系。室溫下測(cè)定470 nm處吸光值，每30 s記錄1次，連續(xù)測(cè)定3 min，以每分鐘吸光值變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U），每處理重復(fù)3次。

PAL活性測(cè)定參照楊光道等（2007）的方法，反應(yīng)體系：0.2 mL酶液、1.0 mL硼酸緩沖液和0.02 mol/L L-苯丙氨酸1.0 mL。對(duì)照組中不加粗酶液而用0.2 mL硼酸緩沖液代替，其余同反應(yīng)體系。反應(yīng)體系于40 ℃水浴60 min，加入0.2 mL 6 mol/L HCI終止反應(yīng)，隨后測(cè)定OD290值，以O(shè)D值變化0.01為1個(gè)酶活性單位（U），每處理重復(fù)3次。

1. 2. 4 印楝種子甲醇提取物粗分離 取少量100～200目硅膠，置于研缽內(nèi)，用少量丙酮溶解甲醇提取的印楝素干粉，并用滴管滴加到硅膠上，玻棒攪散，待丙酮揮發(fā)后將樣品碾勻備用。

將200～300目硅膠G加到氯仿中，充分?jǐn)噭蚝筠D(zhuǎn)入玻璃層析柱中，靜置過夜，檢查柱中氣泡情況，若狀態(tài)良好，將拌入硅膠中的樣品上柱，再加入2～3 cm厚的石英砂。流動(dòng)相為氯仿、氯仿∶丙酮（體積比分別為95∶5、90∶10、1∶1）和丙酮，每次收集100 mL。以TLC點(diǎn)板顯色比較，分別合并相近的流分，將合并溶液減壓蒸干備用。

1. 2. 5 總酚含量測(cè)定 采用福林—酚比色法測(cè)定多酚含量（田桂芝等，2015）。

1. 2. 6 印楝種子甲醇提取物各流分產(chǎn)物對(duì)煙草炭疽病抗性測(cè)定 將氯仿∶丙酮（體積比分別為95∶5、1∶1）和丙酮流分物質(zhì)配成適宜濃度噴施在煙草上，12 h后用1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液接種供試煙草葉片。接種方法和炭疽病發(fā)病情況統(tǒng)計(jì)參照1.2.1。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 印楝誘導(dǎo)煙草炭疽病抗性測(cè)定結(jié)果

印楝誘導(dǎo)煙草炭疽病抗性試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，印楝處理的煙草炭疽病病情指數(shù)為26.67%，而對(duì)照的病情指數(shù)達(dá)74.17%，二者差異顯著（P<0.05，下同）。這可能是由于印楝處理后的煙草具有誘導(dǎo)抗性，使得其病情指數(shù)顯著低于對(duì)照，說明根施印楝種子粉末可有效提高煙草對(duì)炭疽病的抗性。

2. 2 印楝誘導(dǎo)煙草抗性基因的表達(dá)結(jié)果

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，接種煙草炭疽病菌后，對(duì)照煙葉中抗病相關(guān)基因NPR1、NTF6、Ntlox1、NtRar1、NtSGT1、PAL、PDF1.2和PR1a的表達(dá)變化均不明顯。印楝處理的煙草葉片中，接種后第1 d NPR1基因的相對(duì)表達(dá)水平很低，接種后第3～5 d急劇升高，第3 d升至對(duì)照的2562倍，第5 d升至對(duì)照的10789倍，第7 d急劇降至接種后第1 d的水平，隨后略有升高;NtRar1基因的表達(dá)水平在接種后第1 d略高于對(duì)照，第3 d時(shí)低于對(duì)照，至第5 d達(dá)峰值，為對(duì)照的10.15倍，接種后第7～9 d降至對(duì)照水平;NtSGT1基因的相對(duì)表達(dá)量在接種后第1～5 d變化不明顯，且均低于對(duì)照，至第7 d時(shí)達(dá)峰值，為對(duì)照的12.76倍，接種后第9 d降低至對(duì)照水平;PR1a基因的表達(dá)水平在接種后第1 d達(dá)峰值，為對(duì)照的6872倍，第3 d時(shí)急劇降低，第5 d又略有升高，第7～9 d再次降低至對(duì)照水平;其他4個(gè)基因的表達(dá)水平在接種后9 d內(nèi)略有波動(dòng)，但整體變化不明顯。

2. 3 印楝種子粗提物對(duì)煙草PPO、POD和PAL活性的影響

噴施不同溶劑萃取的印楝種子提取物溶液后，煙葉中PPO、POD和PAL活性表現(xiàn)各異。不同處理的PPO活性在接種后第1 d無(wú)明顯差異;接種后第3 d，甲醇提取物處理的PPO活性達(dá)峰值，為對(duì)照的11.75倍，活性增加明顯，其次為乙酸乙酯提取物處理，PPO活性也較對(duì)照明顯增加，而石油醚提取物處理的PPO活性略高于對(duì)照;接種后第5～11 d，不同處理的PPO活性變化趨勢(shì)不同，但整體上以甲醇提取物的PPO活性相對(duì)較高。不同處理的POD活性整體上呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)，其中甲醇提取物的POD活性在接種后第3 d達(dá)峰值，為對(duì)照的2.98倍，且明顯高于其他處理;接種后第7～11 d也以甲醇提取物處理的POD活性整體較高。不同處理的PAL活性在接種后第1～11 d整體上呈升高—降低—升高—降低的變化趨勢(shì)，各處理均在接種后第3 d達(dá)峰值，但同一接種時(shí)間下不同處理間無(wú)明顯差異。綜上所述，以甲醇提取物對(duì)煙草PPO和POD活性的提升效果較優(yōu)。

2. 4 印楝種子甲醇提取物不同流分對(duì)煙草總酚含量的影響

酚類化合物是許多植物體本身的固有成分，也是植物的次生代謝產(chǎn)物，在植物的抗病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。通過測(cè)定印楝種子甲醇提取物各流分對(duì)煙葉總酚含量的影響，發(fā)現(xiàn)3組流分處理均可使煙葉總酚含量提高，均呈先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)。如圖3所示，氯仿∶丙酮（95∶5）處理后2 h總酚含量達(dá)峰值（44.70 mg/gFW），為對(duì)照的2.63倍;氯仿∶丙酮（1∶1）處理后96 h總酚含量達(dá)峰值（123.77 mg/gFW），為對(duì)照的4.13倍;丙酮流分處理后第6和96 h煙葉總酚含量出現(xiàn)兩個(gè)高峰（81.15和90.45 mg/gFW），分別為對(duì)照的2.52和3.34倍。

2. 5 印楝種子甲醇提取物不同流分對(duì)煙草炭疽病抗性的影響

印楝種子甲醇提取物不同流分對(duì)煙草炭疽病抗性的測(cè)定結(jié)果（表3）表明，3個(gè)處理的病情指數(shù)排序?yàn)楸?lt;氯仿：丙酮（1：1）<氯仿：丙酮（95：5），抗性均顯著高于對(duì)照，尤其以丙酮流分處理的誘導(dǎo)抗性能力最強(qiáng)。

3 討論

本研究采用印楝種子粉末進(jìn)行煙苗根施處理，發(fā)現(xiàn)其可降低煙草炭疽病病情指數(shù);進(jìn)一步采用柱層析分離法，確定印楝種子粗提物誘導(dǎo)活性成分主要在印楝種子甲醇提取物的丙酮流分中。前人已有研究表明，印楝提取物可激活植物的抗病能力。本研究中，根施印楝種子粉末使煙草炭疽病的發(fā)病指數(shù)由74.17%降至26.67%，且qRT-PCR測(cè)定結(jié)果表明，在不同時(shí)間段可明顯提高抗病基因NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a的表達(dá)量，其原因可能與印楝種子粉末可誘導(dǎo)煙草抗病相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)印楝種子的甲醇提取物、乙酸乙酯提取物和石油醚提取物誘導(dǎo)煙草的PPO、POD和PAL活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)印楝種子提取物不同有機(jī)溶劑浸提物對(duì)誘導(dǎo)煙草抗炭疽菌的活性有所差異，其中對(duì)煙草PPO和POD活性提升明顯且效果最佳的是甲醇提取物。由此也可衡量不同溶劑的提取效果，以便于誘導(dǎo)活性物質(zhì)的分離、提純及檢測(cè)，同時(shí)為下一步研究打下基礎(chǔ)。鑒于印楝種子甲醇提取物良好的酶誘導(dǎo)效果，對(duì)其進(jìn)行柱層析粗分離，綜合煙葉總酚含量測(cè)定及對(duì)煙草炭疽病的病情指數(shù)測(cè)定，確定印楝種子甲醇提取物的丙酮流分誘導(dǎo)煙草抗炭疽病的效果最好。因此，推測(cè)印楝誘導(dǎo)活性物質(zhì)可能存在于印楝種子甲醇提取物的丙酮流分段中。

誘導(dǎo)抗性是指由于外源生物或非生物因子的作用，激活植物自身防御體系，從而產(chǎn)生對(duì)病原物系統(tǒng)抗性的現(xiàn)象，其中研究較多的是系統(tǒng)獲得抗性（Systemic acquired resistance，SAR）和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性（Induced systemic resistance，ISR）。水楊酸（Salicylic acid，SA）是誘發(fā)SAR產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)分子之一，而茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和乙烯是誘發(fā)ISR產(chǎn)生的關(guān)鍵信號(hào)分子。NPR1蛋白還原成單體及其在細(xì)胞核內(nèi)的積累是誘導(dǎo)水楊酸介導(dǎo)PR基因表達(dá)和SAR表現(xiàn)的必要條件（張紅志和蔡新忠，2005）;NtRar1基因上調(diào)，可誘導(dǎo)植物體內(nèi)H2O2含量升高（Ramegowda et al.，2013）;NtSGT1和PR1a分別通過激活半乳糖苷酶和葡萄糖醛酸酶誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生抗性（Saito et al.，2014）。本研究中，NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a 4個(gè)基因在處理后第1～7 d分別出現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，表明印楝誘導(dǎo)煙草抗炭疽病通過此4條通路激活植物的抗性，此階段是植株多種抗性表達(dá)的活躍時(shí)期。

在模式植物中通過基因沉默、突變體和轉(zhuǎn)基因等試驗(yàn)證明，SGT1與植物的抗病基因功能表達(dá)、超敏反應(yīng)和非宿主抗性有密切關(guān)系，SGT1基因沉默或突變會(huì)導(dǎo)致一些抗病基因介導(dǎo)抗性的喪失，而 SGT1基因超表達(dá)會(huì)增強(qiáng)植株的某些抗病能力（Austin et al.，2002;Muskett and Parker，2003）。NTF6基因是調(diào)控SAR的關(guān)鍵基因，當(dāng)煙草中NTF6基因沉默表達(dá)時(shí)煙草對(duì)煙草花葉病毒和假單胞桿菌的抗性減弱。當(dāng)寄主被病毒、細(xì)菌和真菌等病原菌侵染時(shí)均會(huì)激發(fā)MAP激酶產(chǎn)生（Wilson et al.，1995）。Yang等（2001）在發(fā)現(xiàn)一種NtMEK2-SIPK/WIPK級(jí)聯(lián)能控制PAL的表達(dá)，而這個(gè)基因所編碼的酶在水楊酸生物合成途徑中發(fā)揮重要作用，說明MAPK級(jí)聯(lián)參與了防御反應(yīng)，且在其中控制多條反應(yīng)途徑（肖文娟等，2004）。病菌侵染或激發(fā)子處理可明顯增強(qiáng)PAL基因的轉(zhuǎn)錄水平（Weaver and Herrmann，1997）。有些植物在病原菌侵染時(shí)能產(chǎn)生兩類富含脫氨酸的小分子抗菌多肽——植物防御素（Plant defensins，PDF）。PDF對(duì)許多真菌的生長(zhǎng)有抑制作用，病原真菌Alternaria brassicicola侵染或茉莉酸甲酯處理擬南芥，能強(qiáng)烈誘導(dǎo)PDF基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)（Thomma et al.，1998）?？刂浦狙趸负铣傻腖OX-1基因通過控制茉莉酸及其甲酯和前體物質(zhì)合成而調(diào)節(jié)植物的誘導(dǎo)抗病性，是植物抗病性相關(guān)的抗病基因，LOX-1代謝產(chǎn)物可以作為抗菌或抗蟲性物質(zhì)。周延清等（2012）通過對(duì)不同品種的花生抗性研究發(fā)現(xiàn)脂肪氧化酶基因LOX-1的表達(dá)量也可作為鑒定花生品種抗性的一項(xiàng)指標(biāo)。本研究中，施用印楝種子粉末對(duì)煙草的NTF6、PAL、NtLox1和PDF基因的表達(dá)量增加均不明顯，表明印楝誘導(dǎo)煙草抗炭疽病可能不作用在此4條通路。

綜上所述，印楝誘導(dǎo)的煙草抗煙草炭疽病是通過水楊酸信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)通路所完成。本研究發(fā)現(xiàn)印楝種子甲醇提取物的丙酮流分段可激活煙草的水楊酸信號(hào)抗病途徑，但印楝種子粉末中的誘抗化合物有待進(jìn)一步分離純化。

4 結(jié)論

印楝種子提取物通過誘導(dǎo)提高PPO和POD抗病相關(guān)酶活性及誘導(dǎo)NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等抗病相關(guān)基因的表達(dá)而產(chǎn)生抗炭疽病作用，且誘導(dǎo)活性成分主要存在于甲醇提取物中。因此，印楝種子甲醇提取物丙酮流分可作為煙草炭疽病的誘抗劑推廣應(yīng)用于煙草生產(chǎn)。

參考文獻(xiàn)：

賓金華，姜?jiǎng)?，黃勝琴. 2000. 茉莉酸甲酯誘導(dǎo)煙草幼苗抗炭疽病與PAL活性及細(xì)胞壁物質(zhì)的關(guān)系[J]. 植物生理學(xué)報(bào)，26（1）：2-7. [Bing J H，Jiang S，Huang S Q. 2000. The relationship between methyl jasmonate induced anthracnose resistance of tobacco seedlings and phenylalanine ammonia-lyase activity and cell wall substances[J]. Acta Photophysiologica Sinica，26（1）：2-7.]

陳瑞泰，朱賢朝，王智發(fā)，郭振業(yè)，董漢松，王蘭珍，劉延榮，石金開. 1997. 全國(guó)16個(gè)主產(chǎn)煙?。▍^(qū)）煙草侵染性病害調(diào)研報(bào)告[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，（4）：3-9. [Chen R T， Zhu X C，Wang Z F，Guo Z Y，Dong H S， Wang L Z， Liu Y R， Shi J K. 1997. A report of investigating and studying tobacco infectious diseases of 16 main tobacco producing provinces（regions） in China[J]. Chinese Tobacco Science，（4）：3-9.]

董志堅(jiān)，程道全，董順德. 2004. 植物源農(nóng)藥在煙草病蟲害防治上的研究與應(yīng)用[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，10（4）：42-47. [Dong Z J，Cheng D Q，Dong S D. 2004. Research and application of plant-derived pesticides in tobacco pest control[J]. Acta Tabacaria Sinica，10（4）：42-47.]

江厚龍，李鵬，李鈉鉀，催偉偉，張艷，耿麗娜，丁偉. 2014. 外源誘抗劑對(duì)煙草青枯病的誘抗效果研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，30（28）：286-290. [Jiang H L，Li P，Li N J，Cui W W，Zhang Y，Geng L N，Ding W. 2014. Inhibition effects of induced resistance on tobacco resistance to ralstonia solanacearum[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，30（28）：286-290.]

孔凡彬，謝國(guó)紅，崔乘幸. 2006. 煙草和茶葉上炭疽病的發(fā)生規(guī)律及其防治[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，34（16）：3920-3921. [Kong F B，Xie G H，Cui C X. 2006. The occurrence and prevention of anthrax on tobacco and tea[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，34（16）：3920-3921.]

賴多，康向輝，邵雪花，匡石滋，田世堯，徐漢虹. 2017. 印楝渣生物藥肥對(duì)香蕉生長(zhǎng)和香蕉枯萎病的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，38（4）：30-36. [Lai D，Kang X H，Shao X H，Kuang S Z，Tian S Y，Xu H H. 2017. Effects of neem bioorganic fertilizer on banana growth and fusarium wilt[J]. Journal of South China Agricultural University，38（4）：30-36.]

李東升. 2010. 湖南省煙草炭疽病的形態(tài)和致病性及防治研究[D]. 長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué). [Li D S. 2010. Studies on tobacco anthrax strains of the pathogenic form，pathogenicity and prevention[D]. Changsha：Hunan Agricultural University.]

李海賓，于嘉. 2012. 煙草的種植技術(shù)與田間管理研究[J]. 科技創(chuàng)新與應(yīng)用，（1）：189. [Li H B，Yu? J. 2012. Study on tobacco planting technology and field management[J]. Technology Innovation and Application，（1）：189.]

李易興. 2016. 外源NO供體SNP對(duì)鹽脅迫下苜蓿葉片POD活性的影響[J]. 甘肅畜牧獸醫(yī)，46（21）：100-102. [Li Y X. 2016. Effect of NO donor SNP on POD activity of alfalfa leaves under salt stress[J]. Gansu Animal Husbandry and Veterinary，46（21）：100-102.]

林靖凌，蔡春茂，周凱博，姜欣，彭黎旭. 2008. 印楝6種活性成分的抑菌效果[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，（7）：10-12. [Lin J L，Cai C M，Zhou K B，Jiang X，Peng L X. 2008. Inhibition efficiency of six formulations of neem seed extracts on pathogens[J]. Gansu Agricultural Science and Technology，（7）：10-12.]

劉勇鵬，趙群法，張濤，王瑞嬌，馮臣飛，孫治強(qiáng). 2017. 生物殺線蟲劑對(duì)日光溫室番茄根結(jié)線蟲病防效研究[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，51（6）：815-821. [Liu Y P，Zhao Q F，Zhang T，Wang R J，F(xiàn)eng C F，Sun Z Q. 2017. Study on the control effect of biological nematocide on tomato root-knot nematode disease in solar greenhouse[J]. Journal of Henan Agricultural University，51（6）：815-821.]

田桂芝，李紹明，王大超，侯立白. 2015. Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定板栗總苞提取液中總多酚的含量[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，43（6）：289-291. [Tian G Z，Li S M，Wang D C，Hou L B. 2015. Determination of total polyphenols in chestnut shell by Folin-Ciocalteu method[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，43（6）：289-291.]

王金華. 2005. BTH防治香蕉采后炭疽病及其系統(tǒng)獲得抗性（SAR）機(jī)理[D]. 廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué). [Wang J H. 2005. Prevention and treatment of postharvest anthracnose of banana by BTH and its systemic resistance（SAR） mechanism[D]. Guangzhou：South China Agricultural University.]

吳鉅文，陳建峰. 2002. 植物源農(nóng)藥及其安全性[J]. 植物保護(hù)，（4）：39-41. [Wu J W，Chen J F. 2002. Botanical pesticides and their safety[J]. Plant Protection，（4）：39-41.]

肖文娟，賓金華，武波. 2004. 植物體中的MAPK[J]. 植物學(xué)通報(bào)，21（2）：205-215. [Xiao W J，Bing J H，Wu B. 2004. MAPK in plants[J]. Chinese Bulletin of Botany，21（2）：205-215.]

徐漢虹，賴多，張志祥. 2017. 植物源農(nóng)藥印楝素的研究與應(yīng)用[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，38（4）：1-11. [Xu H H，Lai D，Zhang Z X. 2017. Research and application of botanical pesticide azadirachtin[J]. Journal of South China A-gricultural University，38（4）：1-11.]

楊光道，段琳，束慶龍，黃長(zhǎng)春. 2007. 油茶果皮花青素、糖含量和PAL活性與炭疽病的關(guān)系[J]. 林業(yè)科學(xué)，43（6）：100-104. [Yang G D，Duang L，Shu Q L，Huang C C. 2007. Relationship of anthocyanidin content，sugar content，PAL activity and Colletotrichum gloeosporioides in peel of oil tea tree[J]. Scientia Silvae Sinicae，43（6）：100-104.]

楊鑫，李麗淑，樊吳靜，何虎翼，唐洲萍，譚冠寧. 2018. 誘抗劑對(duì)馬鈴薯瘡痂病抗性誘導(dǎo)的生理機(jī)制[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（6）：1111-1117. [Yang X，Li L S，F(xiàn)an W J，He H Y，Tang Z P，Tan G N. 2018. Physiological mechanism of inducers to resistance inducing of potato scab[J]. Journal of Southern Agriculture，49（6）：1111-1117.]

葉敏，李成云，肖春，李永明. 2009. 印楝素對(duì)植物病原菌抑菌作用初步研究[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，17（2）：402-404. [Ye M，Li C Y，Xiao C，Li Y M. 2009. Inhibitive bioactivity of azadirachtin on phytopathogens[J]. Chinese Journal of Eco-Agriculture，17（2）：402-404.]

張紅志，蔡新忠. 2005. 病程相關(guān)基因非表達(dá)子1（NPR1）：植物抗病信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[J]. 生物工程學(xué)報(bào)，21（4）：511-515. [Zhang H Z，Cai X Z. 2005. Nonexpressor of pathogenesis-related genes 1（NPR1）：A key node of plant disease resistance signalling network[J]. Chinese Journal of Biotechnology，21（4）：511-515.]

趙淑英，宋湛謙，慕衛(wèi)，馬玉翔. 2004. 印楝素和苦楝素對(duì)植物病原菌的抑制作用[J]. 林業(yè)實(shí)用技術(shù)，（9）：28-29. [Zhao S Y，Song Z Q，Mu W，Ma Y X. 2004. Inhibition of azadirachtin and azadirachtin against plant pathogens[J]. Fo-rest Science and Technology，（9）：28-29.]

周延清，陳艷梅，張永華. 2012. 花生種子的黃曲霉抗性物質(zhì)成分和基因研究進(jìn)展[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（1）：36-40. [Zhou Y Q，Chen Y M，Zhang Y H. 2012. Advances in Aspergi-llus flavus-resistant substances and genes in peanut seeds[J]. Guizhou Agricultural Sciences，40（1）：36-40.]

Amadioha C. 1998. Control of powdery mildew of pepper（Capsicum annum L.） by leaf extracts of papaya（Asiminatriloba）[J]. Journal of Herbs，Species and Medicinal Plants，6：41-47.

Austin M J，Muskett P，Kahn K，F(xiàn)eys B J，Jones J D G，Parker J E. 2002. Regulatory role of SGT1 in early R gene-mediated plant defenses[J]. Science，295（5562）：2077-2080.

Gonzalez-Aguilar G A，Tiznado-Hernandez M E，Zavaleta-Gatica R. 2004. Methyl jasmonate treatments reduce chi-lling injury and activate the defense response of guava fruits[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，313（3）：694-701.

Muskett P，Parker J. 2003. Role of SGT1 in the regulation of plant R gene signalling[J]. Microbes and Infection，5（11）：969-976.

Ramegowda V，Senthil-Kumar M，Udayakumar M，Mysore K S. 2013. A high-throughput virus-induced gene silencing protocol identifies genes involved in multi-stress toleran-ce[J]. BMC Plant Biology，13（1）：193.

Saito F，Suyama A，Oka T，Yoko-o T，Matsuoka K，Jigami Y，Shimma Y I. 2014. Identification of novel peptidyl serine α-galactosyltransferase gene family in plants[J]. Journal of Biological Chemistry，289：20405-20420.

Tan B K，Harris N D. 1995. Maillard reaction products inhibit apple polyphenoloxidase[J]. Food Chemistry，53（3）：267-273.

Thomma B P H J，Eggermont K，Penninckx I A M A. 1998. Separate jasmonate-dependent and salicylate-dependent defense-response pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens[J]. Procee-dings of the National Academy of Sciences of the United States of America，95（25）：15107-15111.

Weaver L M， Herrmann K M. 1997. Dynamics of the shikimate pathway in plants[J]. Trends in Plant Science，2（9）：346-351.

Wilson C，Anglmayer R，Vicente O. 1995. Molecular cloning，functional expression in Escherichia coli，and characte-rization of multiple mitogen-activated-protein kinases from tobacco[J]. European Journal of Biochemistry，233（1）：249-257.

Yang K，Liu Y，Zhang S. 2001. Activation of a mitogen-activated protein kinase pathway is involved in disease resistance in tobacco[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，98（2）：741-746.

（責(zé)任編輯 王 暉）