楊樹(shù)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因家族鑒定及表達(dá)分析

王宇晨 曲春浦 劉關(guān)君

摘要：【目的】鑒定楊樹(shù)天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT）基因家族成員，并檢測(cè)其組織表達(dá)特異性，為研究ASPAT在楊樹(shù)初級(jí)氮素同化中的生物學(xué)功能提供參考依據(jù)?！痉椒ā繌臈顦?shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選鑒定ASPAT基因家族成員，利用生物信息學(xué)軟件分析各基因家族成員序列和基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位和保守基序等，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常施氮處理（1 mmol/L NH4NO3）下其在楊樹(shù)根、莖和葉中的組織表達(dá)特異性?！窘Y(jié)果】從楊樹(shù)基因組中共鑒定出9個(gè)ASPAT基因家族成員，包括7個(gè)真核型ASPAT（AAT）基因（PtASPAT1～PtASPAT7）和2個(gè)原核型ASPAT（PAT）基因（PtASPAT8～PtASPAT9），編碼區(qū)（CDS）序列長(zhǎng)度1215～1791 bp，編碼的氨基酸數(shù)目304～480個(gè)，外顯子數(shù)7～14個(gè)，編碼蛋白的等電點(diǎn)5.66～8.99，相對(duì)分子質(zhì)量33.11～53.31 kD，脂融指數(shù)76.36～93.54，分別定位于葉綠體、線(xiàn)粒體和胞質(zhì)中，除PtASPAT6和PtASPAT7為不穩(wěn)定蛋白，其他均為穩(wěn)定蛋白。擬南芥和楊樹(shù)的ASPAT蛋白可聚為兩大類(lèi)，Ⅰ類(lèi)為AAT蛋白，包括PtASPAT1～PtASPAT7和AtASPAT1～AtASPAT5;Ⅱ類(lèi)為PAT蛋白，包括PtASPAT8、PtASPAT9和擬南芥PAT（AtPAT）。PtASPAT1～PtASPAT6均含有5個(gè)保守基序，PtASPAT7缺少2個(gè)保守基序，PtASPAT8和PtASPAT9均僅含有1個(gè)與AtPAT相同的保守基序。9個(gè)楊樹(shù)ASPAT蛋白均含有磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)（SGTHNYSSK）、同源二聚體多肽結(jié)合位點(diǎn)（GAVAER）和催化殘留活性位點(diǎn)（K）。正常氮素處理下，PtASPAT1基因在楊樹(shù)根、莖和葉中表達(dá)量無(wú)明顯差異;PtASPAT2～PtASPAT9基因在根部的表達(dá)量較在莖和葉中的高，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因表達(dá)量較高?！窘Y(jié)論】楊樹(shù)ASPAT基因家族成員主要在根部表達(dá)，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因在楊樹(shù)根部的初級(jí)氮素同化中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞： 楊樹(shù);天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT）;基因家族;生物信息學(xué);基因表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)： S792.119? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）03-0506-09

0 引言

【研究意義】氮素是植物生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的元素之一，是生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸及生長(zhǎng)激素等的重要組分（于妍等，2008;趙會(huì)杰等，2017;杜亞琳等，2018）。我國(guó)北方土地干旱、貧瘠，影響著當(dāng)?shù)亓帜炯稗r(nóng)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重制約著生態(tài)重建和木材供求，目前多采用增施氮肥的方法促進(jìn)其生長(zhǎng)，但易對(duì)環(huán)境造成不利影響（馬文奇等，2006;劉寶林等，2017;李源等，2019）。因此，如何平衡二者關(guān)系一直是土壤肥料學(xué)科的研究熱點(diǎn)。與合理施加氮肥相比，采用分子手段改造植物的氮素利用效率，更加省時(shí)省力。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASPAT）作為初級(jí)氮素同化的關(guān)鍵酶，可提高植物氮素利用效率（劉瑞響等，2012;梁成剛等，2013;劉紅江等，2017）。本研究對(duì)楊樹(shù)（Populus tomentosa）ASPAT基因家族進(jìn)行鑒定，明確其生物學(xué)功能及表達(dá)特性，對(duì)提高楊樹(shù)乃至我國(guó)北方林木的氮素利用率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】天冬氨酸是多種氨基酸及衍生代謝物生物合成的前體，是生命有機(jī)體重要的組成成分，由ASPAT催化轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)而合成（Wilkie et al.，1996）。植物質(zhì)體中包含兩種ASPAT，即真核型ASPAT（AAT）和原核型ASPAT（PAT）（Robinson et al.，1994;Schultz and Coruzzi，1995）。與AAT相比，PAT不僅具有ASPAT活性，還具有預(yù)苯酸轉(zhuǎn)氨酶活性（de la Torre et al.，2014）。擬南芥（Arabidopsis thaliana）作為模式植物，其ASPAT基因家族較小，僅含有5種AAT和1種PAT（de la Torre et al.，2006）。其中，ASPAT2和ASPAT4基因在細(xì)胞溶質(zhì)中發(fā)揮功能;ASPAT3和ASPAT5基因在葉綠體中行使功能;ASPAT1則在線(xiàn)粒體行使功能（Schultz and Coruzzi，1995）;擬南芥PAT基因與上述5種AAT基因的序列相似度較低，但與藍(lán)細(xì)菌PAT基因序列相似度較高（de la Torre et al.，2006）。有研究表明，PAT與發(fā)育中的葉綠體蛋白積累密切相關(guān)（Graindorge et al.，2014），已從高等植物如發(fā)豆、番茄和羽扇豆等中成功克隆并鑒定（Martins et al.，2002;Miesak and Coruzzi，2002;Silvente et al.，2003）。Sentoku等（2000）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)ASPAT基因煙草的線(xiàn)粒體或胞質(zhì)中ASPAT基因過(guò)表達(dá)，其ASPAT活性比野生型煙草高3倍，且磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因（PEPC）轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)。Miesak和Coruzzi（2002）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥胞質(zhì)ASPAT2基因參與種子天冬氨酸和天冬酰胺的合成。Zhou等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，水稻葉綠體或胞質(zhì)過(guò)表達(dá)ASPAT基因時(shí)其種子中的總游離氨基酸含量明顯增加。【本研究切入點(diǎn)】目前，在擬南芥、煙草和水稻等植物中ASPAT基因已被深入研究。與這些材料相比，楊樹(shù)具有生長(zhǎng)迅速、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、易無(wú)性繁殖和多年生長(zhǎng)等特點(diǎn)，可用于長(zhǎng)期研究目的基因在不同生長(zhǎng)周期或不同環(huán)境條件下的生物學(xué)功能，但至今鮮見(jiàn)有關(guān)楊樹(shù)ASPAT基因家族鑒定及表達(dá)分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】根據(jù)擬南芥ASPAT蛋白氨基酸序列，在楊樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（Phytozome 13.0）進(jìn)行同源蛋白BLASTp比對(duì)分析，獲得楊樹(shù)ASPAT基因家族候選成員。利用生物信息學(xué)軟件分析各成員序列和基因結(jié)構(gòu)及編碼蛋白的理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位和保守基序等，并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常施氮處理下各基因的組織表達(dá)特異性，為深入研究ASPAT在楊樹(shù)初級(jí)氮素同化中的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試材料為1年生小黑楊（P. simonii Carr.×P. nigra L.）莖段插穗，來(lái)源于東北林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。主要試劑：植物總RNA提取試劑盒購(gòu)自上海恪敏生物科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）購(gòu)自TaKaRa公司;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。主要設(shè)備儀器：7500型熒光定量PCR儀（ABI，美國(guó)）。

1. 2 樣品處理

將冷凍保存的1年生小黑楊莖段插穗（莖粗0.8～1.0 cm）進(jìn)行扦插。1個(gè)月后對(duì)扦插苗進(jìn)行截頂，長(zhǎng)度為4～5個(gè)節(jié)間，約15 cm。每個(gè)幼苗保留2～3片嫩葉，清水培養(yǎng)至生根，移栽至蛭石中，以1 mmol/L硝酸銨（NH4NO3）作為唯一氮源，添加至不含氮素的LA營(yíng)養(yǎng)液，每3 d澆200 mL LA營(yíng)養(yǎng)液。處理至16 d，采集幼苗的根、莖和葉，每3株按組織混樣，用錫紙進(jìn)行包裹，液氮冷凍于-80 ℃保存。

1. 3 楊樹(shù)ASPAT基因家族成員搜索及鑒定

從擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（TAIR）下載獲得6個(gè)擬南芥ASPAT蛋白氨基酸序列，并在Phytozome 13.0數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp比對(duì)，獲得楊樹(shù)ASPAT基因家族候選成員。利用Pfam和SMART對(duì)候選基因進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，以獲得楊樹(shù)ASPAT基因家族的染色體位置、編碼區(qū)序列（CDS）及編碼蛋白的氨基酸序列等信息。

1. 4 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam分析楊樹(shù)ASPAT的分子量和等電點(diǎn);運(yùn)用Plant-mPloc對(duì)楊樹(shù)ASPAT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);利用GSDS繪制楊樹(shù)ASPAT基因結(jié)構(gòu)圖，分析其外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu);利用MEME對(duì)楊樹(shù)ASPAT蛋白的保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)，參數(shù)預(yù)測(cè)數(shù)目設(shè)為5，長(zhǎng)度設(shè)為6～50，其他參數(shù)均為默認(rèn)設(shè)置。利用ClustalX 1.83將6個(gè)擬南芥ASPAT蛋白與楊樹(shù)ASPAT蛋白進(jìn)行同源比對(duì)，并采用MEGA 5.0的相鄰連接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，校驗(yàn)參數(shù)BootStrap重復(fù)為1000次，其他參數(shù)均為默認(rèn)值。運(yùn)用SOPMA預(yù)測(cè)楊樹(shù)ASPAT蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu);對(duì)楊樹(shù)AAT與擬南芥AAT進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并從NCBI上下載多個(gè)物種的PAT蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1. 5 組織表達(dá)特異性檢測(cè)

采用植物總RNA提取試劑盒提取楊樹(shù)樣品的總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Primer 5.0設(shè)計(jì)定量引物（表1），由哈爾濱市新?；蛴邢薰竞铣伞?shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)楊樹(shù)ASPAT基因家族成員在楊樹(shù)根、莖和葉的表達(dá)情況，以PtActin2為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系20.0 μL：SYBR Mixture 10.0 μL，cDNA模板2.0 μL，上、下游游引物各0.8 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)，重復(fù)數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2017進(jìn)行整理及制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 楊樹(shù)ASPAT基因家族鑒定及編碼蛋白的氨基酸序列分析結(jié)果

由表2和表3可知，從楊樹(shù)基因組中共鑒定到9個(gè)ASPAT基因家族成員，CDS序列長(zhǎng)度為1215～1791 bp，編碼的氨基酸數(shù)目304～480個(gè)，理論等電點(diǎn)5.66～8.99，相對(duì)分子質(zhì)量33.11～53.31 kD，脂融指數(shù)76.36～93.54。除了PtASPAT6和PtASPAT7蛋白為不穩(wěn)定蛋白，其他均為穩(wěn)定蛋白。9個(gè)ASPAT基因家族成員分布于第5、6、7、14、16和18號(hào)染色體，其中，PtASPAT9位于第5號(hào)染色體，PtASPAT1、PtASPAT2和PtASPAT5位于第6號(hào)染色體，PtASPAT8位于第7號(hào)染色體，PtASPAT6位于第14號(hào)染色體，PtASPAT7位于第16號(hào)染色體，PtASPAT3和PtASPAT4位于第18號(hào)染色體。PtASPAT1和PtASPAT3定位于葉綠體和線(xiàn)粒體，PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT8和PtASPAT9定位于葉綠體，PtASPAT2和PtASPAT6定位于線(xiàn)粒體，PtASPAT7定位于細(xì)胞質(zhì)?？缒そY(jié)構(gòu)域數(shù)目為1～13，其中，PtASPAT9只有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，PtASPAT3有13個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。PtASPAT3和PtASPAT7疏水性分值（GARVY）分別為0.050和0.053，推測(cè)為疏水性蛋白，其余蛋白為親水性蛋白。

由表4可知，9個(gè)楊樹(shù)ASPAT蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈結(jié)構(gòu)為主，β-轉(zhuǎn)角所占比例均較小。其中PtASPAT1、PtASPAT2、PtASPAT3、PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT6和PtASPAT7均以α-螺旋結(jié)構(gòu)所占比例最大，為37.59%～46.78%，其次為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，占30.26%～35.82%;PtASPAT8和PtASPAT9則以無(wú)規(guī)則卷曲所占比例最大，分別為37.80%和38.75%，其次為α-螺旋結(jié)構(gòu)，分別為35.39%和38.12%。

2. 2 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果

采用MEGA5.0的相鄰連接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。擬南芥和楊樹(shù)的ASPAT蛋白可聚為兩大類(lèi)，Ⅰ類(lèi)為AAT蛋白，包括PtASPAT1～PtASPAT7和AtASPAT1～AtASPAT5;Ⅱ類(lèi)為PAT蛋白，包括PtASPAT8、PtASPAT9和擬南芥PAT（AtPAT），PtASPAT8與PtASPAT9氨基酸序列相似度高達(dá)90%。由此推測(cè)，PtASPAT8和PtASPAT9為PAT，其他7個(gè)PtASPAT為AAT。

2. 3 楊樹(shù)ASPAT基因家族成員基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

PtASPAT1和PtASPAT3均含10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子，PtASPAT2、PtASPAT6和PtASPAT9均含9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子，PATSPAT5含13個(gè)內(nèi)含子和14個(gè)外顯子，PtASPAT4含11個(gè)內(nèi)含子和12個(gè)外顯子，PtASPAT7含8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子;PtASPAT8含7個(gè)內(nèi)含子和7個(gè)外顯子。

2. 4 楊樹(shù)ASPAT蛋白的保守基序及序列比對(duì)分析結(jié)果

楊樹(shù)ASPAT蛋白共有5個(gè)保守基序，其中PtASPAT1～PtASPAT6與AtASPAT1～AtASPAT5一致，均含有5個(gè)保守基序，PtASPAT7缺少2個(gè)保守基序。PtASPAT8和PtASPAT9與AtPAT一致，僅含有1個(gè)相同的保守基序，進(jìn)一步證實(shí)PtASPAT8和PtASPAT9為PAT。

楊樹(shù)AAT蛋白（PtASPAT1、PtASPAT2、PtASPAT3、PtASPAT4、PtASPAT5、PtASPAT6和PtASPAT7）含有磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)（SGTHNYSSK）、同源二聚體多肽結(jié)合位點(diǎn)（GAVAER）及催化殘留活性位點(diǎn)（K）。從NCBI下載多個(gè)物種的PAT蛋白氨基酸序列，并與楊樹(shù)PAT蛋白（PtASPAT8和PtASPAT9）進(jìn)行比對(duì)分析。PtASPAT8和PtASPAT9含有磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)（SGTHNYSSK）、同源二聚體多肽結(jié)合位點(diǎn)（GAVAER）及催化殘留活性位點(diǎn)（K），與植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）、大腸桿菌（Escherichia coli str. K-12 sub）、短藥野生稻（Oryza brachyantha）和擬南芥（A. thaliana）的PAT蛋白氨基酸序列的相似度為36%～77%，其中與AtPAT相似度最高，為77%，與植物乳酸桿菌PAT蛋白相似度最低，為36%。

2. 5 楊樹(shù)ASPAT基因家族的組織表達(dá)特異性檢測(cè)結(jié)果

正常氮素處理下，PtASPAT1基因在楊樹(shù)根、莖和葉中的相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異;PtASPAT2～PtASPAT9在根部的相對(duì)表達(dá)量較在莖和葉中的高，其中PtASPAT4基因在根部的相對(duì)表達(dá)量最高，是其他基因的3～23倍，其次是PtASPAT8基因，推測(cè)在楊樹(shù)根部主要由PtASPAT4和PtASPAT8催化合成天冬氨酸。

3 討論

植物氮利用效率可從兩方面得到提高：一是增加土壤的施氮肥量，精準(zhǔn)施肥;二是提高植物本身吸收和利用氮的能力。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，不同物種或品種間總吸氮量及在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)氮的吸收、轉(zhuǎn)化和同化能力均存在明顯差異，因此，提高氮利用效率關(guān)鍵在于提高植物本身吸收和利用氮的能力（Krouk et al.，2010;Teng et al.，2017）。Murooka等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥過(guò)表達(dá)天冬酰胺合成酶基因（AS2）可增強(qiáng)植株谷氨酰胺的積累量。Cai等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)谷氨酰胺合成酶基因（GS1.1）使水稻產(chǎn)量明顯增加，過(guò)表達(dá)GS1.2基因使水稻的氮素利用效率明顯提高，且蛋白含量也有所增加。Sentoku等（2000）、Igarashi等（2009）研究表明，擬南芥和煙草過(guò)表達(dá)ASPAT基因時(shí)植株中的天冬氨酸含量均有所增加。周瑩（2009）研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)ASPAT1、ASPAT2和PAT基因的水稻植株過(guò)表達(dá)這3個(gè)基因時(shí)均可提高種子的氨基酸和蛋白含量。

本研究從楊樹(shù)基因組庫(kù)中共鑒定出9個(gè)PtASPAT基因，其中7個(gè)編碼AAT蛋白，2個(gè)編碼PAT蛋白，分別定位于葉綠體、線(xiàn)粒體和胞質(zhì)中。但I(xiàn)reland和Joy（1983）研究發(fā)現(xiàn)，植物中僅存在一種PAT。本研究結(jié)果顯示，楊樹(shù)的7個(gè)AAT蛋白和2個(gè)PAT蛋白均含有磷酸吡哆醛結(jié)合位點(diǎn)（SGTHNYSSK）、同源二聚體多肽結(jié)合位點(diǎn)（GAVAER）及催化殘留活性位點(diǎn)（K），但數(shù)量和位置存在明顯差異，其原因可能是AAT和PAT單體均包含質(zhì)體靶向的N-末端信號(hào)肽，但二者對(duì)磷酸酯底物的識(shí)別、結(jié)合底物的穩(wěn)定性及最佳結(jié)合方向均不同（Morino et al.，2004）。目前，對(duì)所結(jié)合底物的研究還不是很全面（Wilkie et al.，1996;de la Torre et al.，2009）。本研究的組織特異性表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，除PtASPAT1基因在楊樹(shù)根、莖和葉中的表達(dá)量無(wú)明顯差異外，其他8個(gè)PtASPAT基因在根部的表達(dá)量均高于在葉和莖中的表達(dá)量，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因，其原因是植物NH4+的同化過(guò)程主要發(fā)生在根部，谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）循環(huán)將NH4+同化成谷氨酰胺和谷氨酸，再經(jīng)由ASPAT催化轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，最終合成天冬氨酸，推測(cè)PtASPAT4和PtASPAT8基因在該過(guò)程發(fā)揮重要作用。今后應(yīng)深入研究PtASPAT4和PtASPAT8基因在氮素同化機(jī)制的調(diào)控機(jī)制，以提高楊樹(shù)根部氮素利用效率。

4 結(jié)論

楊樹(shù)ASPAT基因家族成員主要在根部表達(dá)，尤其是PtASPAT4和PtASPAT8基因在楊樹(shù)根部的初級(jí)氮素同化中發(fā)揮重要作用。

參考文獻(xiàn)：

杜亞琳，陳海燕，徐麗琳，王琛，范蓮雪. 2018. 黃瓜氮素脅迫相關(guān)基因CsAHP1的克隆及功能分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，47（6）：92-97. [Du Y L，Chen H Y，Xu L L，Wang C，F(xiàn)an L X. 2018. Cloning and function analysis of cucumber CsAHP1 gene involved in nitrogen tolerance[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，47（6）：92-97.]

李源，張炎，哈麗哈什·依巴提，李青軍. 2019. 新型尿素對(duì)膜下滴灌棉花產(chǎn)量及氮肥利用率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，35（1）：85-90. [Li Y， Zhang Y，Halihashi·Yibat，Li Q J. 2019. Effects of new-type urea on yield and nitrogen use efficiency of drip irrigated cotton under plastic film mulching[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Scien-ces，35（1）：85-90.]

梁成剛，張青，李敬，熊丹，許光利，汪燕，劉泉，黃鵬，李天. 2013. 水稻灌漿期高溫對(duì)天冬氨酸代謝酶活性及其家族氨基酸含量的影響[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，27（1）：71-76. [Liang C G，Zhang Q，Li J，Xiong D，Xu G L，Wang Y，Liu Q，Huang P，Li T. 2013. Effects of high temperature on aspartate metabolic enzyme activity and its family amino acid content during rice filling period[J]. Chinese Rice Science，27（1）：71-76.]

劉寶林，鄒小云，宋來(lái)強(qiáng)，官春云. 2017. 氮肥追施時(shí)期對(duì)油菜產(chǎn)量、效益及氮素吸收利用的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，29（11）：29-32. [Liu B L，Zou X Yun，Song L Q，Guan C Y. 2017. Effects of nitrogen fertilizer topdressing period on yield，benefit and nitrogen absorption and utilization of rapeseed[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，29（11）：29-32.]

劉紅江，肖敏，張麗萍，陳留根，張?jiān)婪?，郭智，鄭建? 2017. 前氮后移對(duì)水稻氮素吸收和利用效率的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，33（3）：550-554. [Liu H J，Xiao M，Zhang L P，Chen L G，Zhang Y F，Guo Z，Zheng J C. 2017. Nitrogen uptake and use efficiency of rice in response to postponed nitrogen application[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，33（3）：550-554.]

劉瑞響，曹曉良，陶勇生，張祖新. 2012. 不同氮素水平下玉米產(chǎn)量與zmAspAT基因表達(dá)分析[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，28（24）：22-26. [Liu R X，Cao X L，Tao Y S，Zhang Z X. 2012. Analysis of maize yield and zmAspAT gene expre-ssion under different nitrogen levels[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，28（24）： 22-26.]

馬文奇，張福鎖，陳新平. 2006. 中國(guó)養(yǎng)分資源綜合管理研究的意義與重點(diǎn)[J]. 科技導(dǎo)報(bào)，24（10）：64-67. [Ma W Q，Zhang F S，Chen X P. 2006. Significance and focus of research on integrated management of nutrient resources in China[J]. Science and Technology Review，24（10）：64-67.]

于妍，宋萬(wàn)坤，劉春燕，高運(yùn)來(lái)，李文福，孫殿君，陳慶山，胡國(guó)華. 2008. 植物天冬氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)，（S1）：7-11. [Yu Y，Song W K，Liu C Y，Gao Y L，Li W F，Sun D J，Chen Q S，Hu G H. 2008. Research progress on key enzyme genes in plant aspartate metabolic pathways[J]. Biotechnology Bulletin，（S1）：7-11.]

趙會(huì)杰，周穎，李華，王斯琪，許海良，蒲文宣，張錦韜，易克，汪耀富. 2017. 施氮量對(duì)烤煙葉片碳同化能力及同化產(chǎn)物分配的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，51（5）：603-608. [Zhao H J，Zhou Y，Li H，Wang S Q，Xu H L，Pu W X，Zhang J T，Yi K，Wang Y F. 2017. Effect of nitrogen app-lication rate on carbon assimilation capability and assimilation product distribution of flue-cured tobacco leaves[J]. Journal of Henan Agricultural University，51（5）：603-608.]

周瑩. 2009. 水稻中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶的分子生物學(xué)研究和轉(zhuǎn)基因應(yīng)用[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué). [Zhou Y. 2009. The reseach of molecular biology and application of aspartate aminotransferase in rice[D]. Wuhan：Huazhong Agricultural University.]

Cai H，Zhou Y，Xiao J，Li X，Zhang Q，Lian X. 2009. Overexpressed glutamine synthetase gene modifies nitrogen metabolism and abiotic stress responses in rice[J]. Plant Cell Reports，28（3）：527-537.

de la Torre F，Ca?as R A，Pascual M B，Avila C F，Cánovas M. 2014. Plastidic aspartate aminotransferases and the biosynthesis of essential amino acids in plants[J]. Journal of Experimental Botany，65（19）：5527-5534.

de la Torre F，Moya-García A，Suárez M F，Rodríguez-Caso C，Ca?as R A，Sánchez-Jiménez F，Cánovas F M. 2009. Molecular modelling and site-directed mutagenesis reveal essential residues for catalysis in a prokaryote-type aspartate aminotransferase[J]. Plant Physiology，149（4）：1648-1660.

de la Torre F，Santis L D，Crespillo R，F(xiàn)rancisco M C. 2006. Identification and functional analysis of a prokaryotic-type aspartate aminotransferase：Implications for plant amino acid metabolism[J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，46（3）：414-431.

Graindorge M，Giustini C，Kraut A，Moyet L，Curien G，Matringe M. 2014. Three different classes of aminotransfera-ses evolved prephenate aminotransferase functionality in arogenate-competent microorganisms[J]. Journal of Biological Chemistry，289（6）：3198-3208.

Igarashi D，Ishizaki T，Totsuka K，Ohsumi C. 2009. ASN2 is a key enzyme in asparagine biosynthesis under ammo-nium sufficient conditions[J]. Plant Tissue Culture Letters，26（1）：153-159.

Ireland R J，Joy K W. 1983. Subcellular localisation of asparaginase and asparagine aminotransferase in Pisum sativum leaves[J]. Plant Physiology，72（4）：1127-1129.

Krouk G，Crawford N M，Coruzzi G M，Yifang T，Sonnewald U，F(xiàn)rommer W B. 2010. Nitrate signaling：Adaptation to fluctuating environments[J]. Current Opinion in Plant Bio-logy，13（3）：265-272.

Martins M L L，Mourato M P de F B，Mendon?a A P A de V e. 2002. Characterization of aspartate aminotransferase isoenzymes from leaves of Lupinus albus L. cv Estoril[J]. Journal of Biochemistry and Molecular Biology，35（2）：220-227.

Miesak B H，Coruzzi G M. 2002. Molecular and physiological analysis of arabidopsis mutants defective in cytosolic or chloroplastic aspartate aminotransferase[J]. Plant Physio-logy，129（2）：650-660.

Morino K，Olsen O A，Shimamoto K. 2004. Silencing of the aleurone-specific Ltp2-gus gene in transgenic rice is reversed by transgene rearrangements and loss of aberrant transcripts[J]. Plant & Cell Physiology，45（10）：1500.

Murooka Y，Mori Y，Hayashi M. 2002. Variation of the amino acid content of Arabidopsis seeds by expressing soybean aspartate aminotransferase gene[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering，94（3）：225-230.

Robinson D L，Kahn M L，Vance C P. 1994. Cellular localisation of nodule-enhanced aspartate aminotransferase in Medicago sativa L.[J]. Planta，192（2）：202-210.

Schultz C J ，Coruzzi G M. 1995. The aspartate aminotransferase gene family of Arabidopsis encodes isoenzymes loca-lized to three distinct subcellular compartments[J]. The Plant Journal，7（1）：61-75.

Sentoku N，Taniguchi M，Sugiyama T，Ishimaru K，Ohsugi R，Takaiwa F，Toki S. 2000. Analysis of the transgenic tobacco plants expressing Panicum miliaceum aspartate aminotransferase genes[J]. Plant Cell Reports，19（6）：598-603.

Silvente S，Camas A，Lara M. 2003. Molecular cloning of the cDNA encoding aspartate aminotransferase from bean root nodules and determination of its role in nodule nitrogen metabolism[J]. Journal of Experimental Botany，54（387）：1545-1551.

Teng W，He X，Tong Y P. 2017. Transgenic approaches for improving use efficiency of nitrogen，phosphorus and potassium in crops[J]. Journal of Integrative Agriculture，16（12）：2657-2673.

Wilkie S E，Lambert R，Warren M J. 1996. Chloroplastic aspartate aminotransferase from Arabidopsis thaliana：An examination of the relationship between the structure of the gene and the spatial structure of the protein[J]. The Biochemical Journal，319（3），969-976.

Zhou Y，Cai H，Xiao J，Li X，Lian X. 2009. Overexpression of aspartate aminotransfer ase genes in rice resulted in altered nitrogen metabolism and increased amino acid content in seeds[J]. Theoretical and Applied Genetics，118（7）：1381-1390.

（責(zé)任編輯 陳 燕）