咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析

閆林 黃麗芳 王曉陽(yáng) 孫燕 林興軍 董云萍 龍宇宙

摘要：【目的】對(duì)我國(guó)收集保存的咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，為咖啡種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定、創(chuàng)新及有效利用提供理論參考?！痉椒ā繌母鐐惐葋喆髮W(xué)（UBC Primer Set #9）公布的100個(gè)ISSR引物序列中篩選出多態(tài)性好、擴(kuò)增條帶清晰且重復(fù)性好的引物，利用其對(duì)72份咖啡種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)電泳圖譜進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并利用NTSYSpc 2.1計(jì)算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析，并進(jìn)行主坐標(biāo)分析。【結(jié)果】篩選出的19條引物共擴(kuò)增出153條條帶，其中多態(tài)性條帶數(shù)為128條，占總條帶數(shù)的83.7%;72份咖啡種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)為0.4531～0.9609，平均為0.6567;遺傳距離為0.0351～1.0951，平均為0.4081。其中，大粒種種內(nèi)遺傳相似系數(shù)最大（0.9297～0.9531），遺傳距離最小（0.0445～0.0669）;中粒種種內(nèi)遺傳相似系數(shù)最?。?.5781～0.8750），遺傳距離最大（0.1210～0.5363）。主坐標(biāo)分析與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，均顯示72份咖啡種質(zhì)材料可分為三大類(lèi)，其中3份大粒種、3份查理種及1份中粒種巴布亞新幾內(nèi)亞-2聚為Ⅰ類(lèi)群;32份小粒種聚為聚為Ⅱ類(lèi)群;除巴布亞新幾內(nèi)亞-2外的其他31份中粒種及1份中小粒雜交種Arabusta和1份福建咖啡共33份聚為Ⅲ類(lèi)群。聚類(lèi)分析結(jié)果與種質(zhì)地理來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)性?！窘Y(jié)論】咖啡種質(zhì)資源各種間存在較大的遺傳差異，以中粒種種內(nèi)遺傳多樣性較豐富，以大粒種種內(nèi)遺傳多樣性較低。利用ISSR分子標(biāo)記可準(zhǔn)確分析咖啡資源遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞： 咖啡;ISSR;遺傳多樣性;聚類(lèi)分析;主坐標(biāo)分析

中圖分類(lèi)號(hào)： S571.202.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）03-0491-09

0 引言

【研究意義】咖啡（Coffea spp.）主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，約有124種（Davis et al.，2006;Ceja-Navarro et al.，2015）。商業(yè)栽培主要有小粒種咖啡（C. arabica Linné）和中粒種咖啡（C. canephora Pierre）。小粒種咖啡為四倍體物種（2n=4x=44），由中粒種咖啡和C. eugenoedes或其他生態(tài)型相近的二倍體自然雜交而成（Anthony et al.，2002;Silvestrini et al.，2007;Cenci et al.，2012）。除小粒種咖啡外，其余咖啡屬物種均為二倍體（Stoffelen et al.，2009;Nowak et al.，2011）。我國(guó)云南和海南等省收集保存了大量咖啡種質(zhì)資源，并對(duì)其進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，但主要集中于形態(tài)學(xué)和抗銹性鑒定評(píng)價(jià)研究（周華等，2015;武瑞瑞等，2017），不利于后續(xù)的資源創(chuàng)新利用和優(yōu)良品種選育研究。利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行鑒定評(píng)價(jià)，明確其親緣關(guān)系，對(duì)咖啡種質(zhì)資源利用和優(yōu)良品種選育具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】ISSR分子標(biāo)記兼具RAPD和SSR分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物的品種鑒定（Culley and Wolfe，2001）、遺傳圖譜構(gòu)建（易克等，2003）、遺傳多樣性分析（朱巖芳等，2010;張盾等，2018）、基因定位（李冬梅，2016）等研究方面，其中在咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)方面也有廣泛應(yīng)用（Masumbuko and Bryngelsson，2006;Kassahun et al.，2014）。利用ISSR分子標(biāo)記不僅可評(píng)價(jià)小粒種咖啡種內(nèi)的遺傳差異，還能有效揭示來(lái)自剛果基因庫(kù)的中粒種咖啡存在遺傳變異（Masumbuko and Bryngelsson，2006;Tshilenge et al.，2009）。Ruas等（2003）研究表明不同產(chǎn)地的8種咖啡的遺傳多樣性豐富，遺傳相似系數(shù)為0.25～0.86。Aga等（2005）利用11個(gè)為ISSR分子標(biāo)記分析來(lái)自埃塞俄比亞4個(gè)地區(qū)的咖啡種質(zhì)遺傳變異，結(jié)果表明不同地區(qū)群體間遺傳差異較同一地區(qū)群體內(nèi)遺傳差異大。Kumar等（2008）利用RAPD和ISSR分子標(biāo)記分析咖啡屬與光花咖啡屬間的基因組相似性，結(jié)果表明二者存在明顯差異，且基因組相似性與地理分布存在緊密的關(guān)聯(lián)性。Kassahun等（2014）利用9個(gè)ISSR引物分析埃塞俄比亞125份咖啡野生種和地方品種的遺傳結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，地方品種起源于埃塞俄比亞的不同地理區(qū)域，且以Yayu和Bonga群體遺傳多樣性最高，其次是Berhane Kontir群體。Motta等（2014）應(yīng)用SSR和ISSR分子標(biāo)記分析10個(gè)小粒種和7個(gè)中粒種咖啡的基因型特征，結(jié)果表明在種間和種內(nèi)均存在明顯的基因型差異。黃麗芳等（2014，2017）利用RAPD分子標(biāo)記分析我國(guó)咖啡種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，結(jié)果表明種間和種內(nèi)均存在明顯的遺傳差異，遺傳多樣性豐富?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，鮮見(jiàn)有關(guān)利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】利用ISSR分子標(biāo)記對(duì)我國(guó)收集保存的72份咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，為咖啡種質(zhì)資源的分類(lèi)鑒定、有效利用及新品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1. 1 供試材料

72份供試咖啡種質(zhì)資源基本信息見(jiàn)表1，其中中粒種（C. canephora Pierre）資源32份（編號(hào)7～35、58、66、67），小粒種（C. arabica. Linné）資源32份（編號(hào)36～57、60～65、69～72），查理種（C. excelsa Chevalier）資源3份（編號(hào)4～6），大粒種（C. liberica Bull ex Hiern）資源3份（編號(hào)1～3），中小粒雜交種（C. canephora Pierre×C. arabica Linné）1份（編號(hào)59），來(lái)自福建的分類(lèi)不明確資源1份（編號(hào)68，下文簡(jiǎn)稱(chēng)福建咖啡）。編號(hào)1～67由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所提供，編號(hào)68～72采自海南省澄邁縣農(nóng)戶(hù)種植基地。ISSR引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、10×PCR Buffer和DNA Marker購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀（Bio-Rad，美國(guó)）、冷凍離心機(jī)（Hettich，德國(guó)）、超微量分光光度計(jì)（Nanodrop，美國(guó)）和全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（Tanon，中國(guó)）等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 基因組DNA提取 采摘健康植株上的無(wú)病蟲(chóng)害成熟葉片，液氮速凍后-80 ℃保存。利用CTAB改良法提取葉片總DNA（黃麗芳等，2011），并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量、微量分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度，用ddH2O稀釋至20 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 ISSR-PCR擴(kuò)增 參照閆林等（2012）的方法建立最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序。反應(yīng)體系20.00 μL：10×PCR Buffer 2.00 μL，5 ng/μL DNA模板4.00 μL，10 mmol/L dNTPs 0.60 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.25 μL，25 mmol/L MgCl2 1.20 μL，10 μmol/L引物1.20 μL，ddH2O補(bǔ)足至20.00 μL。ISSR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 15 s，35～50 ℃ 1 min，72 ℃ 78 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察拍照。

1. 2. 3 引物篩選 按照優(yōu)化后的最佳ISSR-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序，以4份遺傳背景差異較大的咖啡種質(zhì)（27號(hào)、臺(tái)灣小粒種、大粒種1和M10）基因組DNA為模板，利用哥倫比亞大學(xué)（UBC Primer Set #9）公布的100個(gè)ISSR引物，從中篩選出多態(tài)性好且擴(kuò)增條帶清晰的引物用于后續(xù)咖啡種質(zhì)資源遺傳多樣性分析。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)擴(kuò)增條帶在瓊脂糖凝膠中遷移率的不同，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品的擴(kuò)增電泳譜帶。在同一遷移位置上，有條帶賦值“1”，無(wú)條帶賦值“0”。采用NTSYSpc 2.1計(jì)算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，根據(jù)非加權(quán)算術(shù)平均法進(jìn)行聚類(lèi)分析，最后基于遺傳相似系數(shù)進(jìn)行主坐標(biāo)分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 多態(tài)性分析結(jié)果

從哥倫比亞大學(xué)公布的100條ISSR引物中篩選出19條擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的引物，部分引物的PCR擴(kuò)增結(jié)果。利用其對(duì)72份咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行ISSR多態(tài)性分析，結(jié)果（表2）顯示，共擴(kuò)增出153條條帶，大小為170～2100 bp，不同引物的擴(kuò)增帶數(shù)為3～14條，平均每條引物擴(kuò)增8.0條條帶，其中多態(tài)性條帶128條，占總條帶數(shù)的83.7%。

2. 2 遺傳相似系數(shù)分析結(jié)果

應(yīng)用NTSYSpc 2.1計(jì)算咖啡種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)，得到相似性矩陣。72份咖啡種質(zhì)材料間的遺傳相似系數(shù)為0.4531～0.9609，平均為0.6567。由表3可知，所有種質(zhì)間均有不同程度的遺傳差異，其中綠頂M11與福建咖啡品種遺傳相似系數(shù)最小，為0.4531，表明二者遺傳差異最大;CTM3（CIFC7962）與CTM19遺傳相似系數(shù)最大，為0.9609，遺傳差異最小，二者在形態(tài)上較相近。

不同的種內(nèi)遺傳相似系數(shù)差異也較大。中粒種種內(nèi)遺傳相似系數(shù)為0.5781～0.8750，平均為0.7250;小粒種種內(nèi)遺傳相似系數(shù)為0.5234～0.9609，平均為0.7961;大粒種種內(nèi)遺傳相似系數(shù)為0.9297～0.9531，平均為0.9427;查理種種內(nèi)遺傳相似系數(shù)為0.7188～0.8672，平均為0.7813?？梢?jiàn)，中粒種遺傳多樣性較豐富，大粒種遺傳多樣性較低。

2. 3 遺傳距離分析結(jié)果

應(yīng)用NTSYSpc 2.1計(jì)算咖啡種質(zhì)材料間的遺傳距離。由表4可知，72份咖啡種質(zhì)材料的遺傳距離為0.0351～1.0951，平均為0.4081。其中，CTM3（CIFC7962）與CTM19的遺傳距離最小，為0.0351，興2與CTM19遺傳距離為0.0413，南頂與石壟坡遺傳距離為0.0445，表明二者間遺傳差異較小;綠頂M11與福建咖啡遺傳距離最大，為1.0951，表明二者間遺傳差異較大。

中粒種種內(nèi)遺傳距離為0.1210～0.5363，平均為0.3029;小粒種種內(nèi)遺傳距離為0.0351～0.8129，平均為0.2229;大粒種種內(nèi)遺傳距離為0.0445～0.0669，平均為0.0543;查理種種內(nèi)遺傳距離為0.1387～0.3345，平均為0.2543?？梢?jiàn)，中粒種種內(nèi)遺傳距離最大，遺傳多樣性最豐富;其次為查理種，遺傳多樣性也較豐富;大粒種種內(nèi)遺傳距離最小，遺傳多樣性最低。

2. 4 聚類(lèi)分析結(jié)果

采用UPGMA對(duì)72份咖啡種質(zhì)材料進(jìn)行聚類(lèi)分析。在遺傳相似系數(shù)0.5927處，72份材料可分為三大類(lèi)，Ⅰ類(lèi)群包括來(lái)自海南文昌和興隆的3份查理種和3份大粒種及1份中粒種巴布亞新幾內(nèi)亞-2，遺傳相似系數(shù)為0.6484～0.9531;Ⅱ類(lèi)群包括32份小粒種咖啡，遺傳相似系數(shù)為0.5234～0.9609;Ⅲ類(lèi)群包括31份中粒種及1份福建咖啡和1份中小粒種雜交種Arabusta，共33份資源，遺傳相似系數(shù)為0.6641～0.8750。

Ⅰ類(lèi)群在遺傳相似系數(shù)0.7592處，南頂、石壟坡、查理小果、查理大果、大粒種1和查理中果聚為一分支，并在遺傳相似系數(shù)0.6700處與巴布亞新幾內(nèi)亞-2聚類(lèi)為一類(lèi)。

Ⅱ類(lèi)群在遺傳相似系數(shù)0.5928處，分為2個(gè)分支，其中一支為綠頂M11，另一支為來(lái)自巴西、喀麥隆及我國(guó)臺(tái)灣、云南、廣西等地的32份種質(zhì)。

Ⅲ類(lèi)群在遺傳相似系數(shù)0.6823處，越南-3種質(zhì)單獨(dú)成為一分支，其他32份種質(zhì)在遺傳相似系數(shù)0.6913外又分為兩個(gè)分支，中小粒雜交種Arabusta咖啡單獨(dú)為一個(gè)分支，其他來(lái)自我國(guó)海南興隆、越南、馬來(lái)西亞、泰國(guó)、印度尼西亞及巴布亞新幾內(nèi)亞等地的咖啡資源聚為一個(gè)分支。

綜上所述，72份咖啡材料間有較高的遺傳變異率，種間的差異比較明顯，說(shuō)明ISSR分子標(biāo)記可為咖啡種質(zhì)的分類(lèi)研究提供更多信息。

2. 5 主坐標(biāo)分析結(jié)果

基于72份咖啡種質(zhì)材料的遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析。以排名前3位的矩陣特征值的貢獻(xiàn)指數(shù)分別占49.47%、19.38%和10.01%，占總貢獻(xiàn)的78.86%。72份咖啡種質(zhì)材料分為三大簇，其中3份大粒種、3份查理種及1份中粒種（巴布亞新幾內(nèi)亞-2）聚為一簇;32份小粒種聚為一簇;除巴布亞新幾內(nèi)亞-2外的其他31份中粒種及1份中小粒雜交種Arabusta和1份福建咖啡共33份聚為一簇。主坐標(biāo)分析與聚類(lèi)分析結(jié)果一致，但主坐標(biāo)分析比聚類(lèi)分析更直觀地反映各咖啡種質(zhì)間的親緣關(guān)系。

3 討論

遺傳多樣性是生物多樣性的基礎(chǔ)，是重要的遺傳資源。生物遺傳變異均發(fā)生在分子水平，在不斷進(jìn)化過(guò)程中形成了豐富的遺傳多樣性（馬克平，1993;時(shí)圣明等，2016）。我國(guó)咖啡種質(zhì)大多數(shù)是從國(guó)外引進(jìn)，亟需對(duì)其種質(zhì)資源進(jìn)行創(chuàng)新改良，從而選育出適合我國(guó)種植的優(yōu)良品種。雖然目前我國(guó)云南和海南等地對(duì)咖啡種質(zhì)資源進(jìn)行收集保存，但對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系等方面的研究相對(duì)較少，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)咖啡遺傳育種進(jìn)程，進(jìn)而限制咖啡產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究利用ISSR分子標(biāo)記分析咖啡種質(zhì)資源的遺傳多樣性，結(jié)果表明72份咖啡種質(zhì)材料可分為三大類(lèi)，遺傳相似系數(shù)0.4531～0.9609，說(shuō)明這些材料遺傳背景相對(duì)較寬，存在較高的遺傳多樣性，與黃麗芳等（2014）的研究結(jié)果一致。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類(lèi)群親緣關(guān)系清晰，聚類(lèi)分析結(jié)果與表型分類(lèi)結(jié)果較一致，說(shuō)明各種間存在較大的遺傳差異，其中Ⅲ類(lèi)群主要為中粒種，遺傳相似系數(shù)0.6641～0.8750，說(shuō)明種內(nèi)遺傳差異較大。這可能與中粒種咖啡是異花授粉有關(guān)，在長(zhǎng)期的繁殖過(guò)程中形成了大量遺傳變異。Hamrick和God（1990）也研究發(fā)現(xiàn)，多年生異花授粉植物具有較高遺傳多樣性，尤其在種內(nèi)這種現(xiàn)象尤為明顯。本研究還發(fā)現(xiàn)，Ⅱ類(lèi)群的小粒種咖啡親緣關(guān)系較緊密，遺傳相似系數(shù)為0.5234～0.9609，遺傳多樣性較低，推測(cè)與小粒種咖啡為自花授粉有關(guān)，還可能與我國(guó)現(xiàn)有小粒種咖啡種質(zhì)資源大多為國(guó)外引進(jìn)的栽培種，而野生種質(zhì)引進(jìn)較少有關(guān)。Anthony等（2002）利用AFLP和SSR分子標(biāo)記對(duì)26份栽培種和半野生小粒種進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明兩種標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果相似，半野生小粒種的遺傳多態(tài)性比栽培種高，但總體遺傳差異較小?？梢?jiàn)，我國(guó)引進(jìn)的小粒種咖啡育種親本范圍較狹窄，遺傳背景相似。

前人研究發(fā)現(xiàn)，種質(zhì)資源的遺傳關(guān)系不僅與其地理來(lái)源有關(guān)，還與植物分類(lèi)學(xué)特性、生長(zhǎng)環(huán)境、功能用途等具有一定的相關(guān)性（Rotondi et al.，2003;陳海云等，2013;席春奕等，2013）。本研究的聚類(lèi)分析結(jié)果表明，部分咖啡種質(zhì)材料與地理來(lái)源相同或相近的種質(zhì)材料聚在一起，但也有部分咖啡種質(zhì)材料與地理來(lái)源不同的種質(zhì)材料聚在一起，如Ⅱ類(lèi)群的小粒種中，來(lái)自墨西哥的綠頂M11單獨(dú)聚為一個(gè)分支，而其他來(lái)自墨西哥的小粒種材料與來(lái)自巴西、喀麥隆及我國(guó)臺(tái)灣、云南、廣西等小粒種材料聚為另一個(gè)分支，且該分支中臺(tái)灣中部和云南貢山-2聚為一個(gè)分支，而臺(tái)灣小粒種、臺(tái)灣南部和云南貢山-1聚為另一個(gè)分支，說(shuō)明同一產(chǎn)地的種質(zhì)間也存在較大遺傳差異，導(dǎo)致聚類(lèi)分析結(jié)果與來(lái)源地的相關(guān)性不明顯，推測(cè)是咖啡種質(zhì)起源廣泛、進(jìn)化過(guò)程漫長(zhǎng)及人工選育栽培共同作用的結(jié)果（Martins et al.，2007）。

4 結(jié)論

咖啡種質(zhì)資源各種間存在較大的遺傳差異，以中粒種種內(nèi)遺傳多樣性較豐富，以小粒種種內(nèi)遺傳多樣性較低。利用ISSR分子標(biāo)記可準(zhǔn)確分析咖啡資源遺傳多樣性。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）