屎腸球菌對哺乳期仔豬結(jié)腸微生物群落優(yōu)勢門屬的影響

向明 李媛媛 郭乾鵬 任亞雪 梁世忠 黃怡

摘要：【目的】分析屎腸球菌（Enterococcus faecium）活菌對哺乳期仔豬結(jié)腸微生物群落優(yōu)勢門屬的持續(xù)影響，為揭示益生菌調(diào)節(jié)仔豬腸道健康的作用機制及人為調(diào)控仔豬腸道微生物以促進其健康提供參考依據(jù)?！痉椒ā拷o健康新生仔豬灌服無菌脫脂乳（對照組）或屎腸球菌制劑（益生菌組），持續(xù)灌服6 d，分別采集7和21日齡仔豬結(jié)腸內(nèi)容物，提取總細(xì)菌DNA后進行PCR擴增，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)檢測16S rRNA序列的V3～V4可變區(qū)，分析腸道微生物群落α多樣性及其在門和屬分類水平上的結(jié)構(gòu)特點。【結(jié)果】給新生仔豬灌服屎腸球菌并不影響7和21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落α多樣性。與對照組相比，益生菌組7日齡仔豬結(jié)腸微生物群落優(yōu)勢門的相對豐度無顯著變化（P>0.05，下同），21日齡仔豬擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度也無顯著差異，但變形桿菌門（Proteobacteria）相對豐度呈顯著增加趨勢（P<0.05，下同）;在屬水平上，益生菌組7日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中相對豐度變化明顯的優(yōu)勢屬均隸屬于擬桿菌門，其中，普雷沃氏菌屬（Prevotella）相對豐度顯著增加，而擬桿菌屬（Bacteroides）相對豐度極顯著減少（P<0.01，下同），丁酸單胞菌屬（Butyricimonas）相對豐度顯著減少;21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中66.67%優(yōu)勢屬的相對豐度呈減少趨勢，其中以厚壁菌門4個屬的變化尤其明顯，即巨型球菌屬（Megasphaera）相對豐度極顯著減少，乳桿菌屬（Lactobacillus）、產(chǎn)琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）和糞桿菌屬（Faecalibacterium）相對豐度顯著減少?！窘Y(jié)論】新生仔豬口服屎腸球菌能對其結(jié)腸微生物群落優(yōu)勢門或?qū)俳M成產(chǎn)生持續(xù)影響，表現(xiàn)為促進有益于結(jié)腸健康菌屬的生長，而抑制具有潛在致病性菌屬的增殖，為今后定向研究調(diào)控仔豬腸道健康的腸道共生微生物提供明確范圍。

關(guān)鍵詞： 仔豬;屎腸球菌;結(jié)腸;微生物群落;α多樣性;高通量測序

中圖分類號：? S878.45? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0477-08

0 引言

【研究意義】健康哺乳動物大腸內(nèi)一般棲居著400～500種微生物，每克內(nèi)容物中的活菌數(shù)量達1013～1014個（Gill et al.，2006）。這些微生物互利共存，形成復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，即腸道微生物群落（腸道菌群）。腸道微生物群落對宿主起抵抗病原菌入侵、增強腸黏膜免疫力、促進養(yǎng)分消化吸收及調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞生長等重要生理功能作用（Hooper and Gordon，2001），表明腸道微生物群落組成與宿主健康密切相關(guān)（Mach et al.，2015）。因此，研究益生菌對機體腸道微生物群落的調(diào)節(jié)作用對闡明其益生作用機制具有重要意義。【前人研究進展】針對腸道微生物群落的研究方法主要有傳統(tǒng)的體外培養(yǎng)方法和不依賴于培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法，后者包括變性梯度凝膠電泳（DGGE）、實時熒光定量PCR及高通量測序技術(shù)等（曾燕等，2018）。目前，研究益生菌對仔豬腸道菌群的影響主要采用體外培養(yǎng)方法，并證實飼喂乳桿菌、雙歧桿菌或屎腸球菌等可增加仔豬腸道乳桿菌或雙歧桿菌等有益菌數(shù)量（Estrada et al.，2001;Huang et al.，2004;Chiang et al.，2015），同時減少大腸桿菌或梭菌等致病菌數(shù)量（黃怡等，2012;Liu et al.，2014）。也有學(xué)者應(yīng)用DGGE技術(shù)研究益生菌對仔豬腸道菌群的影響，如Pieper等（2009）借助DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌能增加哺乳期仔豬腸道某些有益菌的多樣性和豐度。無論是體外培養(yǎng)方法還是DGGE技術(shù)，都存在一定的局限性，只能研究腸道微生物群落中極少數(shù)可培養(yǎng)的微生物物種，或少數(shù)豐度較高的微生物類群（夏圍圍和賈仲君，2014），因而無法準(zhǔn)確評價益生菌對仔豬腸道整體微生物群落的影響。高通量測序技術(shù)可分析整體的微生物群落水平，包括豐度較低的微生物類群，因此能更全面和準(zhǔn)確地反映腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)變化。Aktas等（2016）通過Ion Torrent PGM高通量測序研究發(fā)現(xiàn)，不同乳桿菌菌株對小鼠盲腸菌群的影響在門或?qū)俜诸愃缴洗嬖诿黠@差異，說乳桿菌調(diào)節(jié)宿主菌群的能力存在因菌株而異的特點。陳曦等（2016）利用高通量測序技術(shù)研究屎腸球菌對斷奶仔豬糞便微生物群落的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)屎腸球菌能有效增加斷奶仔豬糞便菌群α多樣性及厚壁菌門、變形菌門、無壁菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門和放線菌門細(xì)菌的豐度，受屎腸球菌影響后豐度高于1%的優(yōu)勢屬主要有乳桿菌屬、瘤胃球菌屬、顫螺旋菌屬和羅斯氏菌屬等。【本研究切入點】腸道微生物群落組成因動物的種類、生理階段及消化道部位不同而異（方磊涵等，2017;茹文紅等，2018;佟延南等，2018）。有關(guān)益生菌對仔豬腸道微生物群落的影響目前已有較多報道（Estrada et al.，2001;Huang et al.，2004;黃怡等，2012;Liu et al.，2014;Chiang et al.，2015），但鮮見針對哺乳期仔豬結(jié)腸整體微生物群落影響的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】應(yīng)用Illumina Miseq高通量測序技術(shù)對腸道微生物16S rRNA文庫進行測序，分析屎腸球菌（Enterococcus faecium）活菌對哺乳期仔豬結(jié)腸微生物群落優(yōu)勢門屬的持續(xù)影響，為揭示益生菌調(diào)節(jié)仔豬腸道健康的作用機制及人為調(diào)控仔豬腸道菌群促進其健康提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

屎腸球菌分離自健康仔豬空腸黏膜，由浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院微生物與基因工程實驗室提供。新生健康杜長大仔豬6窩，共62頭，平均體重1.51±0.03 kg/頭，由廣西貴港市西江千秋種豬場提供。主要試劑：MRS培養(yǎng)基購自杭州奕成生物科技有限公司;TLANamp Stool DNA試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司;Nextera XT Index Kit v2購自美國Illumina公司。主要儀器設(shè)備有超低溫冰箱、高速冷凍離心機、高壓蒸汽滅菌器、實體顯微鏡和紫外可見分光光度計等。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 屎腸球菌制劑制備 培養(yǎng)至對數(shù)生長期的屎腸球菌在4 ℃下4000 r/min離心15 min，棄上清液，沉淀用磷酸緩沖鹽溶液（pH 7.4）洗滌3次，再以無菌10%脫脂乳溶液調(diào)整活菌細(xì)胞數(shù)至1×108 CFU/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 2 試驗仔豬分組及樣本采集 將6窩仔豬隨機分為對照組和益生菌組，每組3窩，每窩10～11頭。從出生當(dāng)天起，對照組新生仔豬每天灌服10%滅菌脫脂乳液10 mL/頭，益生菌組新生仔豬灌服屎腸球菌制劑10 mL/頭，持續(xù)灌服6 d。以常規(guī)方法飼養(yǎng)管理仔豬，自7日齡起飼喂教槽料，21日齡斷奶。于停止灌服屎腸球菌制劑第2 d（7日齡）和第14 d（21日齡）清晨，分別從每窩試驗仔豬中選出中等體重的仔豬各1頭，放血屠宰，無菌剖解取出腸道，剪取結(jié)腸并收集結(jié)腸內(nèi)容物，放入無菌冷凍試管內(nèi)，暫存于液氮罐中。采樣結(jié)束后迅速轉(zhuǎn)存至-80 ℃冰箱，備用。

1. 2. 3 仔豬結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌基因組DNA提取 參照TLANamp Stool DNA試劑盒說明提取試驗仔豬結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌基因組DNA，采用紫外可見分光光度計檢測DNA濃度和純度，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1. 2. 4 菌群結(jié)構(gòu)高通量測序 以細(xì)菌通用引物341f（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805r（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）擴增仔豬結(jié)腸內(nèi)容物細(xì)菌16S rRNA全序列（Herlemann et al.，2011）。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Phanta Max Master Mix 25.0 μL，DNA模板1.0 μL，341f/805r引物各2.0 μL，ddH2O 20.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行25個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，再次進行PCR擴增以添加特異性標(biāo)簽序列。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：2×Phanta Max Master Mix 25.0 μL，DNA模板5.0 μL，Nextera XT Index上、下游引物各2.0 μL，ddH2O 16.0 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進行8個循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應(yīng)。將構(gòu)建好的腸道微生物16S rRNA文庫送至杭州晶佰生物技術(shù)有限公司，在Illumina Miseq測序平臺上對V3～V4可變區(qū)域進行測序。

1. 2. 5 測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析 測序原始數(shù)據(jù)以雙端FASTQ格式保存（http：//en.wikipedia.org/wiki/Fastq），使用FLASH v1.2.7（http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）進行數(shù)據(jù)拼接，要求讀長序列1和讀長序列2的重疊不小于10 bp，不允許堿基錯配，并利用特異性引物信息去除測序產(chǎn)物中的非特異性擴增片段;然后采用拼接軟件PANDAseq v2.9和去嵌合體軟件USEARCH對有效序列進行過濾，去除不含引物、不可拼接（pandaseq overlap≥10 bp）、平均Q值小于Q20、含有模糊堿基N及長度≤300 bp的序列。最后，使用QIIME中“addqiimelabels.py”命令對所有樣品序列進行整合，根據(jù)97%的序列相似度對運算分類單位（OTU）進行聚類分析;同時采用“pick open referenceotus.py”命令在Greengenes v13.08數(shù)據(jù)庫中提取OTU，并進行分類（最小分類至屬）。采用QIIME中的“alphararefaction.py”分析菌群α多樣性，以評價試驗仔豬腸道微生物群落物種的豐富度、多樣性及樣品中序列被測出的概率。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，并采用t檢驗進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 仔豬結(jié)腸內(nèi)容物樣本測序及聚類分析結(jié)果

仔豬結(jié)腸內(nèi)容物樣本經(jīng)高通量測序獲得長度大于300 bp的高質(zhì)量序列共658679條，平均每個樣本36593條。根據(jù)97%的序列相似度進行聚類分析，結(jié)果得到219個OTUs，其中，99.54%的OTUs可準(zhǔn)確分類到19個門，58.45%的OTUs可準(zhǔn)確分類到128個屬。

2. 2 屎腸球菌對哺乳期仔豬結(jié)腸微生物群落α多樣性的影響

采用QIIME計算菌群豐富度指數(shù)（Chao1）、菌群多樣性指數(shù)（Simpson）、觀察物種數(shù)（Observed- species）和菌群覆蓋指數(shù)（Goods_coverage），分別對7和21日齡仔豬結(jié)腸微生物α多樣性進行分析。與對照組相比，益生菌組仔豬結(jié)腸微生物群落的Chao1、Simpson和Observed-species指數(shù)均呈增加趨勢，但未達顯著差異水平（P>0.05，下同），說明屎腸球菌不影響哺乳期仔豬結(jié)腸微生物群落α多樣性。此外，對照組和益生菌組仔豬結(jié)腸微生物群落Goods_coverage指數(shù)均達0.98，非常接近于1.00，表明樣本序列被測出的概率很高，即測序結(jié)果能反映樣本的真實情況。

2. 3 屎腸球菌對哺乳期仔豬結(jié)腸微生物門水平群落組成及其豐度的影響

哺乳期仔豬結(jié)腸微生物群落由19個門組成，且7和21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落均以擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）占絕對優(yōu)勢，二者的相對豐度之和分別超過80%（7日齡）和90%（21日齡）。相對豐度在1%以上的還有變形桿菌門（Proteobacteria）和疣微菌門（Verrucomicrobia），但疣微菌門僅在7日齡對照組仔豬結(jié)腸微生物群落中占較大比例。本研究重點分析屎腸球菌對相對豐度大于1%各優(yōu)勢門的影響，結(jié)果（表1）顯示，與對照組相比，益生菌組7日齡仔豬結(jié)腸微生物群落各優(yōu)勢門的相對豐度均有不同程度變化，但差異不顯著（P>0.05，下同）;益生菌組21日齡仔豬擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度與對照組相比也無顯著差異，但變形桿菌門相對豐度呈顯著增加趨勢。說明屎腸球菌對哺乳期仔豬結(jié)腸菌群優(yōu)勢門豐度的影響需在21日齡后才明顯表現(xiàn)。

2. 4 屎腸球菌對哺乳期仔豬結(jié)腸微生物屬水平群落組成及其豐度的影響

哺乳期仔豬結(jié)腸微生物群落由128個屬組成，相對豐度超過1%的優(yōu)勢屬在7日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中有14個（表2）、21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中有12個（表3）。本研究主要分析屎腸球菌對仔豬結(jié)腸微生物群落優(yōu)勢屬相對豐度的影響，結(jié)果（表2）表明，在7日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中相對豐度較高的前10個屬依次為擬桿菌屬（Bacteroides）、阿克曼菌屬（Akkermansia）、乳桿菌屬（Lactobaci-llus）、普雷沃氏菌屬（Prevotella）、顫螺旋菌屬（Osci-llospira）、羅斯氏菌屬（Roseburia）、韋榮氏菌屬（Vei-llonella）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、梭菌屬（毛螺菌科）[Clostridium（Lachnospiraceae）]和丁酸單胞菌屬（Butyricimonas），其中90%屬于擬桿菌門和厚壁菌門，進一步證實擬桿菌門和厚壁菌門在仔豬結(jié)腸微生物群落組成中的絕對優(yōu)勢地位。與對照組相比，益生菌組7日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中相對豐度變化明顯的優(yōu)勢屬均隸屬于擬桿菌門，其中，普雷沃氏菌屬相對豐度顯著增加，而擬桿菌屬相對豐度極顯著減少（P<0.01，下同），丁酸單胞菌屬相對豐度顯著減少。此外，厚壁菌門、變形桿菌門和疣微菌門絕大部分優(yōu)勢屬的相對豐度呈減少變化趨勢。可見，屎腸球菌對仔豬結(jié)腸微生物群落產(chǎn)生的直接影響是調(diào)節(jié)擬桿菌門相對豐度。

由表3可知，在21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中豐度較高的前10個屬依次為普雷沃氏菌屬、普雷沃氏菌屬#、巨型球菌屬（Megasphaera）、顫螺旋菌屬、乳桿菌屬、p-75-a5、擬桿菌屬、產(chǎn)琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、糞桿菌屬（Faecalibacterium）和考拉桿菌屬。這些優(yōu)勢屬75%隸屬于厚壁菌門、25%隸屬于擬桿菌門，進而決定這兩個門在21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中的絕對優(yōu)勢地位。與對照組比較，益生菌組仔豬結(jié)腸微生物群落66.67%優(yōu)勢屬的相對豐度呈減少趨勢，其中以厚壁菌門4個屬的變化尤其明顯，即巨型球菌屬相對豐度極顯著減少，乳桿菌屬、產(chǎn)琥珀酸菌屬和糞桿菌屬相對豐度顯著減少。可見，21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中受明顯影響的菌屬及其所屬門類與7日齡仔豬完全不同，但也說明屎腸球菌對哺乳期仔豬結(jié)腸微生物群落組成的影響存在持續(xù)性。

3 討論

厚壁菌門和擬桿菌門是哺乳動物正常腸道菌群的主要成員，在哺乳期仔豬糞便菌群中其占比分別為54.0%和38.7%，占據(jù)絕對優(yōu)勢（Alain et al.，2014）。本研究結(jié)果表明，7和21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落均以擬桿菌門和厚壁菌門占絕對優(yōu)勢，二者的相對豐度之和分別超過80%（7日齡）和90%（21日齡），且屎腸球菌對這兩個門類的相對豐度無顯著影響，說明試驗仔豬結(jié)腸微生物群落結(jié)構(gòu)正常。在屬分類水平上，斷奶前仔豬腸道以乳桿菌屬、擬桿菌屬、普雷沃氏菌屬和瘤胃球菌屬占優(yōu)勢（Eyeraert et al.，2017），在本研究中再次得到證實。擬桿菌屬和普雷沃氏菌屬是擬桿菌門最主要的兩個屬，但其在腸道微生物群落中的數(shù)量極易受膳食成分變化的影響，且二者相互拮抗（Gorvitovskaia et al.，2016）。擬桿菌屬細(xì)菌可在母體分娩時傳遞，因此是哺乳期腸道微生物群落的最初成員（Reid，2004），且與動物蛋白及飽和脂肪的飲食有關(guān)，具有特定的碳水化合物酶;但該屬中某些菌種是毒力很強的致病菌，如脆弱擬桿菌（B. fragilis）、多形擬桿菌（B. thetaiotaomicron）和吉氏擬桿菌（B. distasonis）能引發(fā)炎癥性腸炎腹瀉或菌血癥等疾病（Boquet et al.，1998）。丁酸單胞菌屬的部分菌株也是致病菌，如綠色丁酸單胞菌（B. virosa）可引起菌血癥（Ulger Toprak et al.，2015）;而普雷沃氏菌屬細(xì)菌能分解纖維素產(chǎn)生短鏈脂肪酸，保護結(jié)腸而有益于宿主健康（De Filippo et al.，2010）。綜上所述，盡管本研究得到的OTU分類僅準(zhǔn)確到屬，未能確定其菌種，但由研究結(jié)果可知新生仔豬灌服屎腸球菌后能促進有益于結(jié)腸健康菌屬的生長，而抑制具有潛在致病性菌屬的增殖。該結(jié)論為今后定向研究調(diào)控仔豬腸道健康的腸道共生微生物提供明確范圍。

本研究結(jié)果與陳曦等（2016）的研究結(jié)果存在明顯差異，究其原因可能是研究對象的生理階段、飼養(yǎng)條件、樣本采集部位及菌株不同所致。屎腸球菌在停止灌服2周后仍能顯著影響仔豬結(jié)腸微生物群落，說明其對仔豬結(jié)腸微生物群落呈持續(xù)影響，可能與屎腸球菌活菌可在仔豬腸道中定殖生長有關(guān)（黃怡等，2016）。此外，7和21日齡仔豬結(jié)腸微生物群落中受屎腸球菌調(diào)節(jié)的門和屬不同，推測與仔豬日齡對腸道微生物群落的影響有關(guān)。因為隨著仔豬日齡的增長，其腸道微生物群落結(jié)構(gòu)包括優(yōu)勢門和屬的相對豐度均會發(fā)生改變（Kim et al.，2011;Alain et al.，2014;Eyeraert et al.，2017）。本課題組前期研究證實屎腸球菌能有效減少哺乳期仔豬的腹瀉率（黃怡等，2012;李媛媛等，2018），但受屎腸球菌調(diào)節(jié)的菌屬與仔豬腹瀉率下降是否關(guān)聯(lián)有待進一步探究。

4 結(jié)論

新生仔豬口服屎腸球菌能對其結(jié)腸微生物群落優(yōu)勢門或?qū)俳M成產(chǎn)生持續(xù)影響，表現(xiàn)為促進有益于結(jié)腸健康菌屬的生長，而抑制具有潛在致病性菌屬的增殖，為今后定向研究調(diào)控仔豬腸道健康的腸道共生微生物提供明確范圍。

參考文獻：

陳曦，李英英，宋鐵英. 2016. 單一益生菌（屎腸球菌）介導(dǎo)的斷奶仔豬腸道菌群變化規(guī)律[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，31（10）：1091-1097. [Chen X，Li Y Y，Song T Y. 2016. Changes induced by probiotic，Endterococcus faecium，in gut microbiota of post-weaning piglet[J]. Fujian Journal of A-gricultural Sciences，31（10）：1091-1097.]

方磊涵，畢玉霞，王振，賈悟松. 2017. 絞股藍(lán)多糖對斷奶仔豬腸道微生物區(qū)系的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，46（12）：122-125. [Fang L H，Bi Y X，Wang Z，Jia W S. 2017. Effects of gynostemma pentaphyllum polysaccharides on intestinal microflora in weaned piglet[J]. Journal of Henan A-gricultural Sciences，46（12）：122-125.]

黃怡，郭乾鵬，梁世忠，秦津，李衛(wèi)芬. 2016. 屎腸球菌對仔豬腸道健康的影響[J]. 動物營養(yǎng)學(xué)報，28（4）：968-973. [Huang Y，Guo Q P，Liang S Z，Qin J，Li W F. 2016. Influence of Enterococcus faecium on gut health of piglets[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition，28（4）：968-973.]

黃怡，黃琴，崔志文，李衛(wèi)芬，余東游. 2012. 新生仔豬口服屎腸球菌對其腸道菌群組成及化學(xué)屏障的影響[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，32（7）：1007-1010. [Huang Y，Huang Q，Cui Z W，Li W F，Yu D Y. 2012. Roles of Enterococcus faecium in composition of the intestinal microflora and chemistry barrier in newborn piglets by oral administration[J]. Chinese Journal of Veterinary Science，32（7）：1007-1010.]

李媛媛，郭乾鵬，梁世忠，向明，黃怡. 2018. 熱滅活屎腸球菌及其活菌對仔豬腹瀉率、消化酶活性和臟器指數(shù)的影響[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，（15）：1-5. [Li Y Y，Guo Q P，Liang S Z，Xiang M，Huang Y. 2018. Effect of heat-killed Enterococcus faecium and its viable bacteria on diarrhea rate，digestive enzyme activity and visceral index in piglets[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（15）：1-5.]

茹文紅，段亞飛，鄭曉婷，董宏標(biāo)，劉青松，張家松. 2018. 室內(nèi)培育不同產(chǎn)地鹵蟲的成蟲腸道菌群結(jié)構(gòu)分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（9）：1841-1848. [Ru W H，Duan Y F，Zheng X T，Dong H B，Liu Q S，Zhang J S. 2018. Structure of intestinal tract bacterial communities of adult Artemia parthenogenetica from different producing areas under indoor culture[J]. Journal of Southern Agriculture，49（9）：1841-1848.]

佟延南，李芳遠(yuǎn)，李忠琴，趙光軍，李高俊，王德強. 2018. 不同養(yǎng)殖階段羅非魚腸道微生物多樣性的動態(tài)分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，49（7）：1415-1422. [Tong Y N，Li F Y，Li Z Q，Zhao G J，Li G J，Wang D Q. 2018. Dynamic analysis of intestinal microbial diversity in tilapia at different culture stages[J]. Journal of Southern Agriculture，49（7）：1415-1422.]

夏圍圍，賈仲君. 2014. 高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術(shù)評價[J]. 微生物學(xué)報，54（12）： 1489-1499. [Xia W W，Jia Z J. 2014. Comparative analysis of soil microbial communities by pyrosequencing and DGGE[J]. Acta Microbiologica Sinica，54（12）：1489-1499.]

曾燕，鄧家波，牛李麗，蒲陽，李楊，勾堃，曾東，倪學(xué)勤. 2018. 采用實時熒光定量PCR法分析小熊貓胃腸道菌群[J]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），44（6）：638-644. [Zeng Y，Deng J B，Niu L L，Pu Y，Li Y，Gou K，Zeng D，Ni X Q. 2018. Analysis of the bacteria communities along the gastrointestinal tract of a red panda using real-time fluorescence quantitative PCR[J]. Journal of Hunan Agricultural University（Natural Sciences），44（6）：638-644.]

Aktas B，De Wolfe T J，Safdar N，Darien B J，Steele J L. 2016. The impact of Lactobacillus casei on the composition of the cecal microbiota and innate immune system is strain specific[J]. PLoS One，11（5）：e0156374.

Alain B P E，Chae J P，Balolong M P，Bum K H，Kang D K. 2014. Assessment of fecal bacterial diversity among heal-thy piglets during the weaning transition[J]. Journal of General and Applied Microbiology，60（4）：140-146.

Boquet P，Munro P，F(xiàn)iorentini C，Just I. 1998. Toxins from anaerobic bacteria：Specificity and molecular mechanisms of action[J]. Current Opinion in Microbiology，1（1）：66-74.

Chiang M L，Chen H C，Chen K N，Lin Y C，Lin Y T，Chen M J. 2015. Optimizing production of two potential probio-tic Lactobacilli strains isolated from piglet feces as feed additives for weaned piglets[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Science，28（8）：1163-1170.

De Filippo C，Cavalieri D，Di Paola M，Ramazzotti M，Poullet J B，Massart S，Collini S，Pieraccini G，Lionetti P. 2010. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，107（33）：14691-14696.

Estrada A，Drew M D，van Kessel A G. 2001. Effect of the die-tary supplementation of fructo-oligosaccharides and Bifidobacteria longum to early weaned pigs on performance and fecal bacterial populations[J]. The Canadian Veterinary Journal，81（1）：141-148.

Eyeraert N，van Cruchten S，Westr?m B，Bailey M，van Ginneken C，Thymann T，Pieper R. 2017. A review on early gut maturation and colonization in pigs，including biological and dietary factors affecting gut homeostasis[J]. Animal Feed Science and Technology，233：89-103.

Gill S R，Pop M，DeBoy R T，Eckburg P B，Turnbaugh P J，Samuel B S，Gordon J I，Relman D A，F(xiàn)raser-Liggett C M，Nelson K E. 2006. Metagenomic analysis of the human distal gut microbiome[J]. Science，312（5778）：1355-1359.

Gorvitovskaia A，Holmes S P，Huse S M. 2016. Interpreting prevotella and Bacteroides as biomarkers of diet and lifestyle[J]. Microbiome，4：15. doi：10.1186/s40168-016-0160-7.

Herlemann D P R，Labrenz M，Jürgens K，Bertilsson S，Waniek J J，Andersson A F. 2011. Transitions in bacterial communities along the 2000 km salinity gradient of the Baltic Sea[J]. The ISME Journal，5（10）：1571-1579.

Hooper L V，Gordon J I. 2001. Commensal host-bacterial relationship[J]. Science，292（5519）：1115-1118.

Huang C H，Qiao S Y，Li D F，Piao X S，Ren J P. 2004. Effects of Lactobacilli on the performance，diarrhea incidence，VFA concentration and gastrointestinal microbial flora of weaning pigs[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Science，17（3）：401-409.

Kim H B，Borewicz K，White B A，Singer R S，Sreevatsan S，Tu Z J，Isaacson R E. 2011. Longitudinal investigation of the age-related bacterial diversity in the feces of commercial pigs[J]. Veterinary Microbiology，153（1-2）：124-133.

Liu H，Zhang J，Zhang S H，Yang F J，Thacker P A，Zhang G L，Qiao S Y，Ma X. 2014. Oral administration of Lactobacillus fermentum I5007 favors intestinal development and alters the intestinal microbiota in formula-fed piglets[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，62（4）：860-866.

Mach N，Berri M，Estellé J，Levenez F，Lemonnier G，Denis C，Leplat J，Chevaleyre C，Billon Y，Doré J，Rogel-Gaillard C，Lepage P. 2015. Early-life establishment of the swine gut microbiome and impact on host phenotypes[J]. Environmental Microbiology Reports，7（3）：554-569.

Pieper R，Janczyk P，Urubschurov V，Korn U，Pieper B，Souffrant W B. 2009. Effect of a single oral administration of Lactobacillus plantarum DSMZ 8862/8866 before and at the time point of weaning on intestinal microbial communities in piglets[J]. International Journal of Food Microbiology，130（3）：227-232.

Reid G. 2004. When microbe meets human[J]. Clinical Infectious Diseases，39（6）：827-830.

Ulger Toprak N，Bozan T，Birkan Y，Isbir S，Soyletir G. 2015. Butyricimonas virosa：The first clinical case of bacteraemia[J]. New Microbes and New Infections，4：7-8.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）