廣西巴馬小型豬CTGF基因真核表達載體構(gòu)建及其相關(guān)生物信息學分析

黃葉 吳延軍 朱思燃 奉玲麗 瞿秋紅 江雨航 夏琴 崔悅悅 莫家遠 蘭干球

摘要：【目的】構(gòu)建廣西巴馬小型豬結(jié)締組織生長因子（CTGF）基因真核表達載體并鑒定其活性，為深入研究CTGF在癌癥發(fā)生中的作用及其分子機制提供參考，也為構(gòu)建CTGF轉(zhuǎn)基因廣西巴馬小型豬及研發(fā)基于CTGF的癌癥基因治療策略提供理論依據(jù)。【方法】利用RT-PCR從廣西巴馬小型豬肝臟組織中克隆CTGF基因，并將CTGF基因亞克隆到pDsRed-N1載體上，然后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞，轉(zhuǎn)染48 h后于熒光顯微鏡下觀察細胞是否表達紅色熒光蛋白，同時利用在線生物信息學軟件對其理化性質(zhì)進行分析?！窘Y(jié)果】成功克隆獲得廣西巴馬小型豬CTGF基因編碼區(qū)（CDS）序列，序列全長1050 bp，共編碼349個氨基酸，與NCBI上已公布普通豬參考序列的同源性為99.5%，有5處堿基突變，且均為同義突變。將廣西巴馬小型豬CTGF基因亞克隆到pDsRed-N1載體上成功構(gòu)建了閱讀框架正確的廣西巴馬小型豬CTGF基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞48 h后有紅色熒光蛋白表達。廣西巴馬小型豬CTGF蛋白具有較強的親水性，其二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%?！窘Y(jié)論】廣西巴馬小型豬CTGF基因在進化過程中的保守性非常穩(wěn)定，通過構(gòu)建的真核表達載體能轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞并成功表達，可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因廣西巴馬小型豬及研發(fā)與CTGF基因有關(guān)的疾病模型。

關(guān)鍵詞： 廣西巴馬小型豬;CTGF基因;小鼠Hep3B細胞;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染;生物信息學

中圖分類號： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）03-0468-09

0 引言

【研究意義】結(jié)締組織生長因子（Connective ti-ssue growth factor，CTGF）是一種新發(fā)現(xiàn)可刺激成纖維細胞增殖和膠原沉積的生長因子，是CCN家族的成員之一（包晶晶等，2013）。CTGF合成蛋白為肝素結(jié)合型，可分泌含有高水平半胱氨酸的多功能蛋白，其分子量為36～38 kD。CTGF也被認為是TGF-β的下游介質(zhì)，在人類多種組織器官中廣泛表達，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)（Gorlov et al.，2010;Volkomorov et al.，2013）。CTGF的主要作用是刺激成纖維細胞增殖，且是分泌膠原的生長因子（佟仲生等，2010）。近年來的研究結(jié)果顯示，CTGF除了在慢性炎癥、血管和纖維化生成方面發(fā)揮重要作用外（柏秀玉等，2016），其在調(diào)節(jié)細胞增殖、腫瘤發(fā)生發(fā)展等方面也扮演重要角色（Finger et al.，2014;Zhu et al.，2015）。因此，加強CTGF基因研究對研發(fā)治療由CTGF引發(fā)的癌癥藥物及揭示其治療機制均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】CTGF對信號傳導的調(diào)節(jié)是通過抑制或促進其他生長因子活性來完成（Inoki et al.，2002）。Deng等（2007）研究表明，CTGF高表達可促進裸鼠食管癌細胞的生長和腫瘤的形成、增長及浸潤。Kwon等（2007）研究證實，CTGF在不同細胞類型中均由TGF-β誘導，且發(fā)現(xiàn)在胰腺癌和細胞系中會造成CTGF表達受損。Bennewith等（2009）研究表明，CTGF可保護細胞免受缺氧介導的細胞凋亡，為表達高水平CTGF的腫瘤細胞提供體內(nèi)選擇。Cawthorn等（2009）研究證實，CTGF在骨骼的發(fā)育、塑形、重塑及軟骨的發(fā)生過程中也發(fā)揮一定作用，并通過旁分泌機制刺激MDA2231癌巢的血管形成，而有助于乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。Ren等（2013）研究表明，CTGF能促進尤文肉瘤細胞的增殖、遷移和轉(zhuǎn)移。Tai等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，CTGF在黑色素瘤和前列腺癌細胞的發(fā)育過程中具有抑制功能;賀小玉和田應選（2015）也研究表明CTGF在非小細胞肺癌中可能發(fā)揮抑制腫瘤作用;但Ma等（2018）研究顯示，CTGF可誘導腦膠質(zhì)瘤細胞增殖而發(fā)揮其促癌作用。纖維血管膜的形成與視網(wǎng)膜纖維化密切相關(guān)，而CTGF是與糖尿病視網(wǎng)膜病變纖維化密切相關(guān)的細胞因子（Ma et al.，2018）。Bartanusz和Sayre（2018）研究表明，通過慢病毒介導的CTGF基因沉默可抑制大鼠脊髓損傷模型中神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕組織的形成?！颈狙芯壳腥朦c】雖然目前已有大量研究證實CTGF基因?qū)Π┌Y的發(fā)生和發(fā)展具有促進或抑制作用，但CTGF在某些癌癥發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用及其分子機制尚不明確，仍需進一步探究闡明。近年來，以廣西巴馬小型豬為動物模型開展相關(guān)疾病基因的研究已有報道，其中，陳少梅等（2013）研究報道了廣西巴馬小型豬Tau基因存在可變剪接體并進行相關(guān)鑒定和功能研究，蘇秀珍等（2013）對廣西巴馬小型豬載脂蛋白E基因（ApoE）進行相關(guān)分析并成功構(gòu)建其真核表達載體。同理，也可充分利用廣西巴馬小型豬的物種優(yōu)勢對CTGF基因功能進行研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】擬構(gòu)建廣西巴馬小型豬CTGF基因真核表達載體并鑒定其活性，為深入研究CTGF在癌癥發(fā)生中的作用及其分子機制提供參考，也為構(gòu)建CTGF轉(zhuǎn)基因廣西巴馬小型豬及研發(fā)基于CTGF的癌癥基因治療策略提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

廣西巴馬小型豬由廣西大學巴馬小型豬封閉養(yǎng)殖場提供;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA膠回收試劑盒、pMD18-T載體、限制性內(nèi)切酶和Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pDsRed-N1載體（4700 bp）和小鼠Hep3B細胞由廣西大學動物科學技術(shù)學院動物遺傳育種實驗室保存提供;T4 DNA Ligase購自寶生物工程（大連）有限公司;卡那霉素購自上海華舜生物技術(shù)有限公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒（E.Z.N.A.? Endo-free plasmid Mini Kit II）購自OMEGA公司;Lipofectamine? LTX and Plus Rea-gent購自Life Technologies公司;DMEM、Opti-MEM及RPMI1640培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清（FBS）購自Hyclone公司;二甲基亞砜（DMSO）和0.25%胰蛋白酶購自Sigma公司。

1. 2 引物設計與合成

根據(jù)NCBI上已公布的普通豬CTGF基因序列（登錄號NM_213833.2），利用Oligo 7.6設計擴增引物（CTGF-F：5'-AAGCTTATGTCCGCCACCGGCC TG-3'和CTGF-R：5'-GGATCCTAGGCCATGTCTCC ATACATC-3'），酶切位點（下劃線部分）分別為Hind III和BamH I，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 CTGF基因擴增

采用TRIzol法提取廣西巴馬小型豬肝組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA。PCR反應體系15.0 μL：cDNA模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/mL）7.5 μL，上、下游引物（20 mmol/L）各0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性5 min;94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 50，進行32個循環(huán);72 ℃延伸7 min。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1. 4 pMD18-CTGF重組質(zhì)粒獲取

通過膠回收試劑盒回收PCR擴增產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，18 h后挑取菌落進行PCR鑒定，陽性菌落送至深圳華大基因公司測序。測序結(jié)果正確，即構(gòu)建獲得pMD18-CTGF重組質(zhì)粒。

1. 5 pDsRed-CTGF真核表達載體構(gòu)建

pMD18-CTGF重組質(zhì)粒與提純后的pDsRed-N1載體分別用Hind III和BamH I進行雙酶切，以1.5%瓊脂糖電泳檢測后回收酶切產(chǎn)物。經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，通過卡那霉素（Kna+）篩選，挑取陽性克隆進行測序鑒定。

1. 6 轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞及驗證

將小鼠Hep3B細胞成功復蘇后傳代至6孔板中，當細胞數(shù)量達60%～70%時按照Lipofectamine? LTX and Plus Reagent說明以構(gòu)建的pDsRed-CTGF真核表達載體對其進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后置于倒置顯微鏡上觀察熒光并拍照記錄。同時收集細胞，采用TRIzol法提取總RNA后進行實時熒光定量PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2. 1 廣西巴馬小型豬CTGF基因擴增結(jié)果

以廣西巴馬小型豬肝臟組織總RNA為模板進行RT-PCR擴增，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，約在1050 bp處出現(xiàn)單一明亮的目的條帶，與預期結(jié)果相符。

2. 2 pDsRed-CTGF真核表達載體構(gòu)建及驗證結(jié)果

將pMD18-CTGF重組質(zhì)粒與pDsRed-N1載體分別用Hind III和BamH I進行雙酶切，酶切產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果顯示目標條帶清晰，其條帶大小約為4700和1050 bp，與預期結(jié)果相符。分別回收酶切產(chǎn)物（載體骨架和目的片段），然后采用T4 DNA連接酶進行連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，挑選陽性克隆菌去內(nèi)毒提取pDsRed-CTGF真核表達載體。經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切后采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果獲得兩條清晰的目標條帶，與預期結(jié)果相符。其中一條條帶約4700 bp，與載體骨架大小一致，另外一條條帶為目的基因片段，約1050 bp。

2. 3 pDsRed-CTGF真核表達載體轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞的效果

分別以pDsRed-CTGF真核表達載體和pDsRed-N1載體轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者轉(zhuǎn)染的小鼠Hep3B細胞均能觀察到紅色熒光，表明pDsRed-CTGF真核表達載體構(gòu)建成功且能轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集小鼠Hep3B細胞進行CTGF基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測，結(jié)果表明，pDsRed-CTGF轉(zhuǎn)染組小鼠Hep3B細胞中的CTGF基因相對表達量顯著高于pDsRed-N1轉(zhuǎn)染組（P<0.05），說明廣西巴馬小型豬CTGF基因能在小鼠Hep3B細胞中成功表達。

2. 4 廣西巴馬小型豬CTGF基因測序結(jié)果

對陽性pDsRed-CTGF真核表達載體進行測序，結(jié)果表明構(gòu)建獲得的真核表達載體中包含廣西巴馬小型豬CTGF基因的完整編碼區(qū)（CDS），序列全長1050 bp，共編碼349個氨基酸。利用Nucleotide BLAST對測序得到的CTGF基因CDS序列與NCBI上已公布的普通豬CTGF基因CDS序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有5處堿基發(fā)生突變，分別是：第813位C→T，第816位C→T，第825位T→C，第990位C→G，第993位G→T。采用Protein BLAST對CTGF編碼氨基酸序列與NCBI上已公布的普通豬CTGF氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)5處堿基突變均為同義突變，并未引起氨基酸改變。

2. 5 廣西巴馬小型豬CTGF基因生物信息學分析結(jié)果

2. 5. 1 系統(tǒng)發(fā)育進化樹 采用Oligo 7.6中的MegAlign對測序獲得的廣西巴馬小型豬CTGF基因CDS序列與NCBI上已公布的其他物種CTGF基因CDS序列進行同源性比對分析，得知廣西巴馬小型豬與普通豬（Sus scrofa）、人類（Homo sapiens）、牛（Bos taurus）、褐家鼠（Rattus norvegicus）和雞（Gallus gallus）的同源性分別為99.5%、91.0%、91.7%、89.0%和84.3%。其中，廣西巴馬小型豬與普通豬的親緣關(guān)系最近，其次是牛，親緣關(guān)系最遠的是雞。

2. 5. 2 CTGF蛋白親/疏水性分析結(jié)果 借助ExPASy ProtScale預測CTGF蛋白的親/疏水性，CTGF蛋白具有較強的親水性，與ExPASy ProtParam預測得到的總平均疏水分值（GRAVY= -0.189）相符。

2. 5. 3 CTGF蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果 利用NPS@在線蛋白分析系統(tǒng)對廣西巴馬小型豬CTGF蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預測。在廣西巴馬小型豬CTGF蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（以h表示）、β-折疊（以t表示）、氨基酸殘基構(gòu)成的延伸鏈（以e表示）、無規(guī)則卷曲（以c表示）各占13.18%、5.73%、17.48%和63.61%。同時利用SWISS-MODEL分析預測廣西巴馬小型豬CTGF蛋白三級結(jié)構(gòu)，得知廣西巴馬小型豬CTGF蛋白可能存在的三級結(jié)構(gòu)有5種模型。

3 討論

CTGF屬于新的富含半胱氨酸生長因子家族成員之一，由349個氨基酸組成，在人類的心血管系統(tǒng)、腦組織、骨骼肌、消化道、腎臟和胰腺等組織器官中均有發(fā)現(xiàn)，其中含量最高的是腎臟（Wada et al.，2002）。CTGF在機體發(fā)育與分化、雌性生殖系統(tǒng)、血管生成（Kubota and Takigawa，2007）、傷口修復（de Winter et al.，2008;Liu et al.，2011）、纖維變性病變（Leask，2009）、炎性病變及腫瘤發(fā)生發(fā)展（包晶晶等，2013）等多種生物學過程中發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于CTGF在癌癥方面的研究報道較多。Liu等（2008）認為CTGF可作為胃癌前病變、早期診斷和預后判定的指標，而柏秀玉等（2016）認為CTGF可作為卵巢癌新的標志物。CTGF對不同腫瘤具有細胞特異性和環(huán)境特異性，在不同腫瘤組織中的表達也不同。此外，有研究報道CTGF有可能成為風濕性心臟病抗纖維化治療的潛在靶點（Wang et al.，2016）。如在增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變中，CTGF的靶向治療可能是預防增殖性糖尿病及其他與新血管形成和纖維化相關(guān)眼部疾病的新方法（Kuiper et al.，2008）。

本研究從廣西巴馬小型豬肝臟組織中成功克隆獲得CTGF基因CDS序列，通過與NCBI上已公布的普通豬CTGF基因CDS序列進行比對，發(fā)現(xiàn)共有5處堿基發(fā)生突變，且均為同義突變，說明CTGF基因在進化過程中的保守性非常穩(wěn)定。廣西巴馬小型豬CTGF基因CDS序列與NCBI上已公布其他物種CTGF基因CDS序列的同源性分析結(jié)果顯示，廣西巴馬小型豬與普通豬的親緣關(guān)系最近（同源性達99.5%），其次是牛（同源性為91.7%），與人類的同源性也在90.0%以上。廣西巴馬小型豬的各種生理生化指標及各臟器組織的大小結(jié)構(gòu)與人體極為相似，可作為動物模型用于與人類相關(guān)疾病的研究（齊麗娜等，2012;宋少銳等，2014;司景磊等，2016）。本研究結(jié)果還表明，廣西巴馬小型豬CTGF基因在pDsRed-CTGF真核表達載體和pDsRed-N1載體轉(zhuǎn)染的小鼠Hep3B細胞中均有表達，但pDsRed-CTGF轉(zhuǎn)染組小鼠Hep3B細胞中的CTGF基因相對表達量顯著高于pDsRed-N1轉(zhuǎn)染組，說明廣西巴馬小型豬CTGF基因能轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞并成功表達，與吳延軍等（2015）的研究結(jié)果一致，為生產(chǎn)CTGF轉(zhuǎn)基因廣西巴馬小型豬提供了技術(shù)支持。

目前，有關(guān)臟器移植、干細胞、轉(zhuǎn)基因等研究領(lǐng)域發(fā)展迅速。國外學者Kragh等（2009）已成功利用手工克隆方法生產(chǎn)出針對阿爾茨海默病的轉(zhuǎn)基因小型豬模型;郝朝亮等（2014）已成功通過體細胞核移植及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)生產(chǎn)出廣西巴馬小型豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，為后期生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因廣西巴馬小型豬疾病模型奠定了基礎(chǔ)。本研究構(gòu)建了廣西巴馬小型豬CTGF基因的真核表達載體，并成功轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞，為研究CTGF基因在哺乳動物中的表達規(guī)律及其生物學活性打下基礎(chǔ)，也為研發(fā)治療由CTGF引發(fā)的癌癥藥物提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

廣西巴馬小型豬CTGF基因在進化過程中的保守性非常穩(wěn)定，通過構(gòu)建的真核表達載體能轉(zhuǎn)染小鼠Hep3B細胞并成功表達，可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因廣西巴馬小型豬及研發(fā)與CTGF基因有關(guān)的疾病模型。

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（責任編輯 蘭宗寶）