杜長(zhǎng)大豬UCP3基因克隆及白藜蘆醇對(duì)其表達(dá)的影響

崔悅悅 張廣杰 徐曉芙 夏琴 鄒輝 江雨航 瞿秋紅 蔣欽楊 黃艷娜 郭亞芬 蘭干球

摘要：【目的】明確白藜蘆醇對(duì)杜長(zhǎng)大豬UCP3基因表達(dá)及脂肪代謝的影響，為揭示豬優(yōu)良肉質(zhì)性狀形成機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā刻崛?月齡杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪組織RNA，采用RT-PCR擴(kuò)增杜長(zhǎng)大豬UCP3基因編碼區(qū)（CDS）序列，運(yùn)用在線軟件對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)白藜蘆醇（400 mg/kg，飼喂30 d）對(duì)杜長(zhǎng)大豬脂肪中UCP3基因表達(dá)的影響。【結(jié)果】從杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪組織中成功克隆獲得UCP3基因CDS序列，全長(zhǎng)927 bp，共編碼308個(gè)氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量33673.09 Da，理論等電點(diǎn)（pI）9.44;與普通豬的UCP3基因序列相比，杜長(zhǎng)大豬UCP3基因編碼序列共有9處發(fā)生堿基突變，其中4處為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致UCP3蛋白有4處氨基酸突變，分別為第74位脯氨酸（Pro）→亮氨酸（Leu）、第150位甘氨酸（Gly）→精氨酸（Arg）、第203位Arg→Gly和第259位纈氨酸（Val）→Leu。杜長(zhǎng)大豬UCP3基因CDS序列與普通豬UCP3基因CDS序列的同源性為99.0%，其UCP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中以α-螺旋占比最高（46.43%）、β-轉(zhuǎn)角占比最低（7.47%），屬于親水性蛋白。飼喂白藜蘆醇（400 mg/kg）能極顯著上調(diào)杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪UCP3基因表達(dá)（P<0.01），其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組（不飼喂白藜蘆醇）的2.06倍。【結(jié)論】白藜蘆醇是通過上調(diào)杜長(zhǎng)大豬UCP3基因表達(dá)而影響其脂肪代謝。

關(guān)建詞： 杜長(zhǎng)大豬;解偶聯(lián)蛋白（UCP）;UCP3基因;生物信息學(xué)分析;白藜蘆醇;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）03-0439-07

0 引言

【研究意義】解偶聯(lián)蛋白（Uncoupling protein，UCP）主要分布在線粒體內(nèi)膜上，參與機(jī)體的能量代謝，且是影響肉質(zhì)的關(guān)鍵基因（叢軍和高弼虎，2012），即開展UCP研究可為培育低脂肪的優(yōu)良肉質(zhì)畜禽品種打下理論基礎(chǔ)。豬肉產(chǎn)品在畜禽食品中占據(jù)重要地位，尤其是我國(guó)作為全球第一大豬肉生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó)家，豬肉產(chǎn)量和消費(fèi)量逐年遞增。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2017年我國(guó)的豬肉產(chǎn)量和消費(fèi)量分別為5340萬(wàn)和5487萬(wàn)t。但隨著人們生活水平的提高，對(duì)豬肉品質(zhì)的要求也越來(lái)越高，因此在豬生產(chǎn)中如何獲得量多且質(zhì)優(yōu)的肉類產(chǎn)品已成為養(yǎng)豬育種工作者的首要任務(wù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已發(fā)現(xiàn)有5種UCP家族蛋白（UCP1～UCP5），且研究證實(shí)UCP3與UCP1不僅具有高度同源性，還與產(chǎn)熱機(jī)能相關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確（孔勇等，2010;高文榮等，2012）。Gong等（2000）、Seifert等（2008）通過對(duì)動(dòng)物脂肪酸代謝過程的研究，發(fā)現(xiàn)UCP3能減緩線粒體氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)脂肪酸氧化，減少脂肪沉積。劉穎等（2013）研究表明，UCP3在動(dòng)物脂肪代謝合成過程中發(fā)揮重要作用，可將能量轉(zhuǎn)化為熱能。白藜蘆醇（Resveratrol，RES）多存在于虎杖、花生和葡萄籽等植物中（韋曉等，2018），是一種無(wú)色無(wú)味針狀結(jié)晶、難溶于水但易溶于有機(jī)溶劑的多酚化合物（韓晶晶等，2008）。孫延權(quán)等（2011）研究表明，白藜蘆醇具有減輕肥胖小鼠體重、上調(diào)脂肪組織Sirt1基因表達(dá)及降低體內(nèi)脂肪含量的作用。王曉珂等（2013）研究表明，白藜蘆醇通過促進(jìn)肥胖易感大鼠脂肪組織中AMPKα1、AMPKα2和Sitr1基因的表達(dá)，而降低高脂膳食誘導(dǎo)肥胖易感大鼠的體重和脂肪蓄積量。王筱婧等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與清除氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化損傷及抑制炎癥反應(yīng)水平有關(guān)。鄭新杰等（2017）研究證實(shí)，高脂膳食攝入和尼克酰胺會(huì)抑制脂肪代謝相關(guān)蛋白基因Sirt1、PPARγ和UCP1的表達(dá)，但經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)處理后能上調(diào)UCP1基因表達(dá)，并減輕小鼠體內(nèi)白色脂肪組織的重量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，已有研究證明白藜蘆醇和UCP3基因均與機(jī)體脂肪代謝相關(guān)，但通過飼喂白藜蘆醇能否調(diào)控豬UCP3基因表達(dá)進(jìn)而影響脂肪代謝的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】克隆杜長(zhǎng)大豬UCP3基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)白藜蘆醇能否調(diào)控UCP3基因表達(dá)，明確其對(duì)豬脂肪代謝的影響，為揭示豬優(yōu)良肉質(zhì)性狀的形成機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1月齡杜長(zhǎng)大豬由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院科研基地養(yǎng)殖場(chǎng)（許可證號(hào)GXU2013002）提供，共8頭，隨機(jī)分為飼喂白藜蘆醇組（400 mg/kg）（Zhang et al.，2015）和對(duì)照組（不飼喂白藜蘆醇）。飼喂30 d后進(jìn)行屠殺采樣，采取皮下脂肪組織立即置于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩MD19-T載體、RNAiso Plus、熒光定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRⅡ等均購(gòu)自TaKaRa公司;DNA聚合酶和普通反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;膠回收試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司;酵母浸出物和胰蛋白胨等購(gòu)自O(shè)XOID公司;瓊脂糖購(gòu)自法國(guó)Biowest公司;氨芐西林、氯化鈉和氯化鉀等購(gòu)自上海華舜生物技術(shù)有限公司;白藜蘆醇（PHLC≥98%）購(gòu)自陜西慈緣生物技術(shù)有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1. 2 PCR引物設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)NCBI中已發(fā)表的豬UCP3基因序列（NM_214049.1），利用Oligo 7.0設(shè)計(jì)引物，包括克隆引物UCP3-F1、UCP3-R1及定量引物UCP3-F2和UCP3-R2，以18S rRNA為內(nèi)參基因（表1），其中克隆引物擴(kuò)增片段中的5'端和3'端均包含非翻譯區(qū)。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 3 杜長(zhǎng)大豬UCP3基因克隆

以TRIzol法提取杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄體系8.0 μL：1.0 μL Oligo（dT）23VN（59 μmol/L），10 pg～50 μg RNA，RNase Free H2O補(bǔ)足至8.0 μL。反應(yīng)程序：65 ℃ 5 min，冰浴2 min。繼續(xù)在反應(yīng)體系中加入10.0 μL的2×RT Mix和2.0 μL HiscriptTM II Enzyme Mix。反應(yīng)程序：55 ℃ 45 min;85 ℃ 5 min;4 ℃保存。以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系10.0 μL：5.0 μL Taq DNA聚合酶，1.0 μL cDNA模板（308.3 ng/μL），UCP3-F1和UCP3-R1（10 μmol/L）各0.5 μL，雙蒸水補(bǔ)足至10.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后切取目的條帶，按膠回收試劑盒說(shuō)明對(duì)目的條帶進(jìn)行純化回收?；厥盏哪康钠闻cpMD19-T載體連接后置于4 ℃下過夜，連接產(chǎn)物與40.0 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰浴30 min后42 ℃水浴45 s，最后冰浴2 min;加入500.0 μL LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃下?lián)u床振蕩（200 r/min）培養(yǎng)1 h;取100.0 μL菌液涂布于含氨芐青霉素（0.1 mg/mL）的LB固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)10～12 h。從LB固體培養(yǎng)基上挑選單個(gè)白色菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，將PCR鑒定呈陽(yáng)性的菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1. 4 杜長(zhǎng)大豬UCP3基因生物信息學(xué)分析

首先利用MegAlign對(duì)克隆獲得的杜長(zhǎng)大豬UCP3基因與參考豬序列進(jìn)行比對(duì)分析，同時(shí)與奶牛（Bos taurus，NM_174210.4）、斑馬魚（Danio rerio，NM_200353.2）、人類（Homo sapiens，U84763.1）、小鼠（Mus musculus，AB010742.1）、褐家鼠（Rattus norvegicus，U92069.1）和普通豬（Sus scrofa，NM_2140 49.1）6個(gè)物種的UCP3基因進(jìn)行同源性比對(duì)分析;采用LaserGene構(gòu)建多物種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹;以ExPASy ProPtaram（http：//web.expasy.org/protparam/）系統(tǒng)分析杜長(zhǎng)大豬UCP3基因編碼蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)、分子量和等電點(diǎn);利用ExPASy-ProtScale（http：//web.expasy.org/prot）進(jìn)行UCP3蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)分析;通過NPS@在線蛋白分析系統(tǒng)（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）對(duì)杜長(zhǎng)大豬UCP3基因編碼蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，并利用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1. 5 qRT-PCR檢測(cè)UCP3基因表達(dá)情況

1. 5. 1 杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪cDNA合成 以TRIzol法提取8頭豬的皮下脂肪總RNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系10.0 μL：2.0 μL 5×gDNA Eraser Buffer，1.0 μL gDNA Eraser，1.0 μg總RNA，RNase Free H2O補(bǔ)足至10.0 μL。反應(yīng)程序：42 ℃ 2 min。繼續(xù)在體系中加入1.0 μL Prime Script RT Enzyme Mix I、1.0 μL RT Prime Mix、4.0 μL 5×Primescript Buffer和4.0 μL RNase Free H2O。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min;85 ℃ 5 s;4 ℃保存。

1. 5. 2 qRT-PCR檢測(cè)UCP3基因 以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系20.0 μL：10.0 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，UCP3-F2/UCP3-R2（10 μmol/L）各0.5 μL，5.0 μL cDNA模板（5 ng/μL），4.0 μL RNase Free H2O。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。以CFX-96（Bio-RAD）進(jìn)行檢測(cè)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1. 6 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，使用SAS 9.1進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，再以GraphPad Prism 7.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 杜長(zhǎng)大豬UCP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在1000 bp附近出現(xiàn)單一明亮的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。純化的目的條帶經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后，其菌液PCR鑒定結(jié)果也顯示在1000 bp附近出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期序列長(zhǎng)度1009 bp基本吻合。

2. 2 杜長(zhǎng)大豬UCP3基因生物信息學(xué)分析結(jié)果

2. 2. 1 UCP3基因序列比對(duì)分析結(jié)果 利用Meg-Align對(duì)杜長(zhǎng)大豬UCP3基因與NCBI中已發(fā)表豬的UCP3基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)杜長(zhǎng)大豬UCP3基因序列長(zhǎng)927 bp，相對(duì)于參考豬的UCP3基因序列，杜長(zhǎng)大豬UCP3基因編碼區(qū)（CDS）序列共有9處發(fā)生堿基突變，分別是第117位 C→T、第211位C→T、第306位T→C、第444位 G→T、第448位A→G、第555位T→C、第564位G→C、第607位G→T和第776位T→C。其中5處（第117、306、444、555、564位）為同義突變，剩余4處則發(fā)生錯(cuò)義突變，具體表現(xiàn)：第221位C→T致使第74位脯氨酸（Pro）→亮氨酸（Leu）;第448位A→G致使第150位甘氨酸（Gly）→精氨酸（Arg）;第607位G→T致使第203位Arg→Gly;第776位T→C致使第259位纈氨酸（Val）→Leu。

2. 2. 2 UCP3基因同源性比對(duì)分析結(jié)果 通過MegAlign比對(duì)分析杜長(zhǎng)大豬與NCBI中其他物種的UCP3基因同源性，結(jié)果表明，杜長(zhǎng)大豬UCP3基因CDS序列與奶牛、斑馬魚、人類、小鼠、褐家鼠和普通豬的UCP3基因CDS序列同源性分別為90.0%、68.8%、87.3%、83.6%、84.0%和99.0%。

2. 2. 3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 使用MegAlign構(gòu)建基于UCP3基因同源性的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示杜長(zhǎng)大豬與普通豬具有非常近的親緣關(guān)系，而與斑馬魚的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2. 2. 4 UCP3蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 經(jīng)ExPASy ProPtaram分析可知，杜長(zhǎng)大豬UCP3基因共編碼308個(gè)氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量33673.09 Da，理論等電點(diǎn)（pI）9.44。杜長(zhǎng)大豬UCP3蛋白的氨基酸組成成分如表2所示。

2. 2. 5 UCP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 利用NPS@在線蛋白分析系統(tǒng)預(yù)測(cè)杜長(zhǎng)大豬UCP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。杜長(zhǎng)大豬UCP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋（用h表示）占46.43%，β-轉(zhuǎn)角（用t表示）占7.47%，延伸鏈（用e表示）占15.26%，無(wú)規(guī)則卷曲（用c表示）占30.84%。

2. 2. 6 UCP3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果 利用SWISS-MODEL對(duì)杜長(zhǎng)大豬UCP3蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，以α-螺旋為主，與UCP3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2. 2. 7 UCP3蛋白親/疏水性預(yù)測(cè)分析結(jié)果 利用ExPASy ProtScale對(duì)杜長(zhǎng)大豬UCP3蛋白的親/疏水性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，圖中縱坐標(biāo)代表疏水性分值，分值越高表明蛋白疏水性越強(qiáng)。杜長(zhǎng)大豬UCP3蛋白的親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，故屬于親水性蛋白。

2. 3 白藜蘆對(duì)杜長(zhǎng)大豬UCP3基因表達(dá)的影響

飼喂白藜蘆醇（400 mg/kg）能極顯著上調(diào)杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪UCP3基因表達(dá)（P<0.01），其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的2.06倍。

3 討論

UCP3是線粒體內(nèi)膜中一類非常關(guān)鍵的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，與骨骼肌線粒體的產(chǎn)熱調(diào)節(jié)有著密切關(guān)聯(lián)（安建多和江瑛，2013;楊占清等，2013）。Fabris等（2001）研究證實(shí)，大鼠血漿游離脂肪酸的升高能有效提高大鼠骨骼肌中UCP2和UCP3 mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而影響脂肪堆積。趙建國(guó)等（2002）研究表明，血漿中游離脂肪酸的增加可上調(diào)白色脂肪及骨骼肌中UCP2和UCP3基因的表達(dá)。叢軍和高弼虎（2012）研究發(fā)現(xiàn)，UCP2和UCP3蛋白對(duì)動(dòng)物機(jī)體能量平衡狀態(tài)的保持具有重要作用，且對(duì)體重及體脂代謝等相關(guān)性狀產(chǎn)生明顯影響。本研究從杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪中成功克隆獲得UCP3基因，通過與已報(bào)道的豬UCP3基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)杜長(zhǎng)大豬UCP3蛋白有4處氨基酸突變，分別為第74位Pro→Leu、第150位Gly→Arg、第203位Arg→Gly和第259位Val→Leu;基于UCP3基因同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，杜長(zhǎng)大豬與普通豬具有非常近的親緣關(guān)系，二者的同源性為99.0%。相對(duì)于普通豬，杜長(zhǎng)大豬UCP3基因堿基發(fā)生錯(cuò)義突變導(dǎo)致的氨基酸突變是否影響其生物學(xué)功能，尚有待于進(jìn)一步探究。

陳峰等（2010）研究表明，經(jīng)白藜蘆醇干預(yù)后能有效抑制高糖誘導(dǎo)的氧自由基生成，同時(shí)上調(diào)小鼠細(xì)胞中UCP5基因表達(dá)。周逸亭等（2014）研究表明，經(jīng)白藜蘆醇飼喂的小鼠體內(nèi)UCP1基因表達(dá)水平升高，體重減輕，糖代謝得到一定改善，還能促進(jìn)其白色脂肪褐色化。于飛（2015）研究表明，白藜蘆醇可改善小鼠的脂肪代謝，對(duì)其體內(nèi)外脂肪代謝均有不同程度的影響，促使高脂日糧飼喂條件下小鼠肝臟脂肪變性的風(fēng)險(xiǎn)降低，說(shuō)明白藜蘆醇與脂肪代謝緊密相連。鄭新杰等（2017）研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇干預(yù)處理小鼠體內(nèi)脂肪細(xì)胞的體積減小，脂質(zhì)蓄積減少。可見，白藜蘆醇是通過調(diào)控UCP3基因表達(dá)而影響機(jī)體脂肪沉積。本研究結(jié)果表明，飼喂白藜蘆醇（400 mg/kg）30 d后，杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪UCP3基因極顯著上調(diào)表達(dá)，其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的2.06倍，說(shuō)明白藜蘆醇是通過上調(diào)豬UCP3基因表達(dá)而影響其脂肪代謝，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

杜長(zhǎng)大豬UCP3基因CDS序列與參考豬的UCP3基因CDS序列同源性最高，親緣關(guān)系最近，僅有4處堿基發(fā)生錯(cuò)義突變。飼喂白藜蘆醇（400 mg/kg）能極顯著上調(diào)杜長(zhǎng)大豬皮下脂肪UCP3基因表達(dá)，說(shuō)明白藜蘆醇是通過上調(diào)豬UCP3基因表達(dá)而影響其脂肪代謝。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）