青鱗魚蛋白酶解工藝及產(chǎn)物組分分析

俞益芹 張煥新 殷玲 祁興普 董志儉

摘要：以青鱗魚魚肉為原料，用風味蛋白酶對其進行水解處理制取水解蛋白質(zhì)，通過單因素試驗考察了酶解溫度、加酶量、酶解時間、底物濃度、pH值等不同因素對青鱗魚蛋白質(zhì)水解物中游離氨基態(tài)氮含量和水解度的影響。在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，優(yōu)化了青鱗魚水解蛋白質(zhì)的制備工藝。結(jié)果表明：在水解溫度50℃、pH值6.5、底物：水=1.O：1.9（質(zhì)量比）、加酶量2 200 U/g、酶解時間300 min條件下，青鱗魚蛋白質(zhì)的水解度為14.82%，與理論預測值之間誤差僅為0.29%，游離氨基態(tài)氮含量為1.946 mg/ml，表明采用響應面法優(yōu)化得到的青鱗魚蛋白質(zhì)酶解工藝參數(shù)準確可靠。酶解產(chǎn)物主要由3- 19肽構(gòu)成，占總酶解產(chǎn)物的71. 63%，其中2-4肽占總酶解產(chǎn)物的48. 6%。表明青鱗魚魚肉經(jīng)風味蛋白酶水解時主要生成聚合度為2-4的小分子寡肽，風味蛋白酶對青鱗魚蛋白質(zhì)具有較強水解作用。

關(guān)鍵詞：青鱗魚;風味蛋白酶;氨基態(tài)氮;水解度

中圖分類號：TS254

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（ 2019） 03-0701-08

青鱗魚（Harengula zunast），硬骨魚系，真骨總目，鯡形目，鯡科的一種，俗名“青皮”、“柳葉青”，屬暖水性中上層低值魚，是中國常見海產(chǎn)魚種，主要分布于東海、黃海和渤海海域，資源豐富[1-2]。青鱗魚肉雖然蛋白質(zhì)含量高，但它體小多刺，脂肪及血和肉含量高，不宜鮮食，且不耐貯藏，是中國主要的低值海產(chǎn)品[3]。近年來，由于現(xiàn)代捕撈技術(shù)的推廣，大中型魚類資源逐年受到破壞，使得低值小雜魚迅速繁殖，比重占到海洋捕撈產(chǎn)量的57% - 59%。由于食用價值低，用于食品加工的小雜魚比重僅約1/3，大多制作為動物蛋白質(zhì)飼料或工業(yè)原料等低值產(chǎn)品，資源價值未得到充分利用[4-5]。此外，因加工技術(shù)和回收手段落后，造成大量營養(yǎng)成分流失，產(chǎn)品的得率和附加值沒有得到有效的提高，資源浪費嚴重并對環(huán)境造成污染[6]。因此，加大對低值魚的深加工技術(shù)研究以提高其經(jīng)濟附加值對于充分利用水產(chǎn)資源有著非常重要的意義。目前，對青鱗魚的應用研究主要集中在探討酶法水解魚肉提取濃縮魚蛋白質(zhì)、多肽以及制作魚露等[7-11]終產(chǎn)物的技術(shù)研究，而針對酶水解工藝過程各種因素作用的詳盡研究報告則相對較少[12-13]，且不太完善。

風味蛋白酶是一種真菌蛋白酶/肽酶的復合體，在中性或微酸性條件下不僅能脫除蛋白質(zhì)水解液的苦味，同時對蛋白質(zhì)具有較強的水解能力，可以增進和改善水解液的風味[14-15]。本研究以青鱗魚魚肉為底物，以風味蛋白酶水解魚肉制取水解蛋白質(zhì)，探討酶解反應中各因素對水解物中游離氨基態(tài)氮含量和水解度的影響，在此基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗設(shè)計，優(yōu)化青鱗魚水解蛋白質(zhì)制備的最佳水解工藝參數(shù)，旨在為深入研究與利用青鱗魚水解蛋白質(zhì)提供參考，同時為低值海洋蛋白質(zhì)的高值化開發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與主要試劑

青鱗魚，購自南通市水產(chǎn)品市場，鮮魚清洗干凈后人工取魚肉片，去除魚皮和黑膜;用冷水將魚肉清洗干凈，置于多孔篩網(wǎng)上瀝干，然后用PVC袋按照1袋80 9進行封裝，并于-18℃冰柜中保存?zhèn)溆?。風味蛋白酶（ Flavourzyme◎，24 000 U/g）購自諾維信（中國）投資有限公司，甲醛溶液、石油醚購自上?；瘜W試劑公司，氫氧化鈉、鹽酸、硫酸鉀，硫酸銅、硼酸均為分析純（上海國藥試劑有限公司產(chǎn)品），試驗所用水均為蒸餾水。

1.2 試驗儀器設(shè)備

S-3C型精密pH計購自上海精科雷磁有限公司，MA-45型水分測定儀購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，BS323S型精密電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，R502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器購自上海申生科技有限公司，78-1型磁力加熱攪拌器購自常州國華電器有限公司，JJ-2型組織搗碎機購自舟山市淀海區(qū)海源儀器廠，CXJ-2型離心機購自上海離心機械研究所，DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱購自上海精密實驗設(shè)備有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1 水分測定取適量魚肉置于水分測定儀中，自動測定得出結(jié)果。

1.3.2 灰分含量測定參照GB 5009.4-2016《食品安全國家標準——食品中灰分的測定》測定灰分。

1.3.3 脂肪含量測定參照GB5009.6-2016中的索氏抽提法測定飲料中的脂肪含量（脂肪含量是粗脂肪）的方法測定。

1.3.4 蛋白質(zhì)含量測定 參照GB5009.5 -2016測定蛋白質(zhì)含量。

1.3.5 游離氨基態(tài)氮（AN）含量測定[16] 采用甲醛滴定法。取5 ml離心后的上清夜，置于100 ml容量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，吸取20 ml稀釋液于200ml燒杯中，加水60 ml。開磁力攪拌器，用0.05mol/L NaOH標準溶液標定至pH 8.20，再加入10ml甲醛溶液，繼續(xù)用NaOH標準溶液標定至pH9. 20。相同條件下另做一組空白試驗。按下列公式計算樣品中游離氨基態(tài)氮的含量：

AN（ mg/ml）=（V1-Vo ）cx0.140 08xl00

（1）式中，c：NaOH的當量濃度;vl：滴定樣品時消耗NaOH溶液的體積（ml）;vo：滴定空白時消耗NaOH溶液的體積（ml）;0.140 08：氮的毫克當量。

1.3.6 水解度（DH）測定[17]

DH=（B-C）/（A-C） xl00%

（2）式中，A：原料中總氨基氮含量;B：水解液中游離氨基氮含量;C：原料的游離氨基氮含量。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗準確稱取魚肉10g（精確到0. 01g），分別置于250 ml燒杯中，加入40 ml蒸餾水，在60℃水浴鍋中熱處理10 min使魚肉適度變性。待其冷卻后，進行酶解試驗。基于風味蛋白酶在其他蛋白質(zhì)水解中的應用[18-19]，單因素試驗的基本條件設(shè)定為：反應溫度50℃，pH 6.5，風味蛋白酶添加量1650 U/g，料水質(zhì)量比1：4，反應時間240mm。反應完成后，100℃水浴5 min滅酶，測定游離氨基態(tài)氮及水解度。改變影響酶水解的其中一個因素，其他因素保持不變，分別考察反應溫度、pH值、風味蛋白酶添加量、反應時間和底物含量對游離氨基態(tài)氮和水解度的影響，每組處理重復3次。

1.4.2 響應面分析法優(yōu)化試驗 在試驗因素水平不多的情況下，為了得到全面完整數(shù)據(jù)，采用全面試驗法：Response surface 3 -level factorial design[20]。根據(jù)單因素試驗，選擇酶解時間、料水質(zhì)量比、加酶量3個對水解度（DH）有顯著影響的因素，以水解度為響應值，應用Design Expert 6.0的3-level Factorial試驗設(shè)計模塊進行優(yōu)化試驗的設(shè)計及結(jié)果分析，因素水平見表1。

1.4.3 水解液各組分分子量測定 用Sephadex G一15柱（1.1 cm×50.0 cm）分析檢測[21]。以10mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）為洗脫液，流速為0.4ml/min，上樣量為1 ml，QuadTecTM檢測器檢測，檢測波長280 nm。標準樣分別為L一酪氨酸（Mr=181.19）、AMP（Mr=347.2）、輔酶I（NAD，Mr=681.44）、短桿菌肽（Bacitracin zinc，Mr=1 486.2），用緩沖液配成5 g/L的溶液備用，用藍葡聚糖2000測定柱外水體積Ve，然后由標準樣的保留時間計算出相應的洗脫體積Vp，以相對分子質(zhì)量的對數(shù)值（lgMr）為橫坐標，Kav（有效分配系數(shù)）為縱坐標繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 青鱗魚的常規(guī)成分分析

青鱗魚魚肉常規(guī)成分見表2，通過比較青鱗魚魚肉、去內(nèi)臟青鱗魚和青鱗魚下腳料，可以看出隨著青鱗魚加工深度的提高，蛋白質(zhì)、脂肪的含量增加，而灰分減少。蛋白質(zhì)含量在魚肉中所占的比率要大于內(nèi)臟等其他部位。因此，魚肉可以用來制造經(jīng)濟價值較高的水解蛋白質(zhì)，而內(nèi)臟等下腳料用來制造經(jīng)濟價值較低的魚粉更為合適[22]。和另一種常見海洋低值魚——鯤魚相比，青鱗魚蛋白質(zhì)含量更高，其具有更好的經(jīng)濟價值[6]。

2.2 單因素試驗

2.2.1 溫度對酶解游離氨基態(tài)氮和水解度的影響

風味蛋白酶在40 - 65℃內(nèi)水解青鱗魚魚肉時游離氨基態(tài)氮和水解度的變化如圖1所示。由圖1可知，在風味蛋白酶水解作用下，產(chǎn)物中游離氨基態(tài)氮含量和水解度呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性，在40 - 50℃內(nèi)，游離氨基態(tài)氮含量（AN）和水解度（DH）均隨溫度升高而增加，當溫度升高到50℃，AN和DH分別達到最大值1.225 mg/ml和8.77%。在50- 60℃，二者均呈下降趨勢，原因主要是反應溫度過高，酶分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，次級鍵解離，導致酶活力下降[23]。同時，魚肉蛋白質(zhì)變性后，水解難度增加24]。因此，風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉的最佳酶解溫度為50℃。

2.2.2 pH值對酶解游離氨基態(tài)氮和水解度的影響

在溫度50℃，加酶量1 650 U/g，料水質(zhì)量比1：4，時間240 min條件下，探討pH對風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉反應的影響，結(jié)果如圖2。圖2表明，在pH值5.5 -8.0，游離氨基態(tài)氮含量和水解度均變化不大，當pH值為7.0時，AN和DH分別達到最大值1.208 mg/ml和8.63%?？傮w來看，在試驗選取范圍內(nèi)，pH值對風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉反應的影響較小，最佳酶解pH值為7.0。

2.2.3 加酶量對酶解游離氨基態(tài)氮和水解度的影響在反應pH值6.5，溫度50℃，料水質(zhì)量比1：4，時間4.0 h條件下，探討風味蛋白酶添加量對青鱗魚魚肉水解反應的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著風味蛋白酶添加量的增加，水解度和游離氨基態(tài)氮同時增大。風味蛋白酶添加量由550 U/g增大至1 650 U/g時，水解曲線斜率增大迅速，表明反應速度增大，水解度和產(chǎn)物中游離氨基態(tài)氮含量快速提高;當風味蛋白酶添加量大于1650 U/g時，水解曲線斜率緩慢減小，表明反應速度降低，水解度和產(chǎn)物中游離氨基態(tài)氮含量增加緩慢。綜合考慮得率與生產(chǎn)成本之間的關(guān)系，確定風味蛋白酶適宜添加量為1 650 U/g。

2.2.4 時間對酶解游離氨基態(tài)氮和水解度的影響

在pH值6.5，反應溫度50℃，加酶量1 650 U/g，料水質(zhì)量比1：4條件下，探討反應時間對風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉反應的影響，結(jié)果見圖4。圖4表明，隨著酶解時間的延長，水解度逐漸增大，水解液中游離氨基態(tài)氮含量增加。反應時間從180 min延長至270 min，兩者增幅較大。由此可見，反應時間延長使蛋白質(zhì)水解為更多的小肽和游離氨基酸。從270 min到300 min水解度和水解液中游離氨基態(tài)氮含量增幅較小，反應時間至300 min時，AN和DH分別達到最大值1.398 mg/ml和10. 22%。而300 min到330 min時AN和DH都略有下降。因此，風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉適宜的酶解時間為280 min。

2.2.5 料水質(zhì)量比對酶解反應的影響 在pH值6.5，反應溫度50℃，加酶量1650 U/g，時間240nun條件下，探討料水質(zhì)量比對風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉反應的影響，結(jié)果見圖5。圖5表明，底物濃度對酶解反應的影響較大。料水比為1：2（質(zhì)量比），AN和DH分別達到最大值1.736 mg/ml和13. 06%。料水質(zhì)量比大于1：2后，隨著加水量的增加，水解度和游離氨基態(tài)氮同時大幅度下降。因此，風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉的適宜料水質(zhì)量比為1：2。

2.3 酶解工藝參數(shù)的RSA優(yōu)化

本試驗選取對酶解反應影響較大的3個因素（酶解時間、料水質(zhì)量比和加酶量）作為自變量，DH為響應值，采用響應面分析法在三因素三水平上對酶解反應條件進行優(yōu)化，其他兩因素條件固定為：溫度50℃，pH7.O。試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。

試驗組1- 28為析因試驗，29-32為中心試驗。32個試驗點分為析因點和零點，其中析因點為自變量取值在X1、X2、X3所構(gòu)成的三維頂點;零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復4次，用以估計試驗誤差。采用RSA Quadratic Model對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，回歸分析結(jié)果見表4。

由表4可知：模型F值為38. 03，產(chǎn)生誤差的可能性只有0.01%，具有顯著性。“Prob>F”值小于0. 010 0，表明計算模型是高度顯著的，可以利用該響應面近似模型進行后續(xù)的優(yōu)化設(shè)計。在試驗中A、C、B2和C2是顯著的模型體系;“Prob>F”值大于0. 010 0表明該因素對模型計算影響不顯著[25]。“失擬F值”為0. 10，“Prob>F”值大于0.05表明不顯著，即該模型在被研究的整個回歸區(qū)域內(nèi)擬合較好，試驗誤差小[26]，回歸模型能充分說明酶解工藝過程。

對各因素進行回歸擬合，得回歸方程：

DH=13. 590+0.440A -0.072B+0.900C -0. 2IOA—1. 700B—0. 400C22—0. 160AB+0.170AC -0. 1OOBC

（3）

為了直觀表示各因素對響應值的影響，并反映最佳優(yōu)化條件，作出響應面圖和等值線圖（圖6、圖7、圖8）。

圖6-圖8直觀地反映了各因素對水解度的影響，由等值線圖可以看出存在極值的條件應該在弧形內(nèi)側(cè)。比較3組圖可知，加酶量（C）對水解度的影響最為顯著，表現(xiàn)為曲面較陡;而酶解時間（A）次之;料水質(zhì)量比（B）影響最小，表現(xiàn)為曲面較為平滑，隨數(shù)值的增加或減少，其響應值變化較小。

在因素水平范圍內(nèi)，進一步確定最佳點的值，運用優(yōu)化程序“Optimization”求解最佳點，解得：A=1. 00，B=-0.01，C=1. 00，即風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉的最佳酶解時間為300 min，最佳料水質(zhì)量比為1.0：1.9，最佳加酶量為2 200 U/g。在此條件下，酶解反應的魚肉蛋白水解度DH的理論值可達14.51%。

2.4 最佳工藝條件下的酶解

為檢驗RSA分析法的可靠性，采用上述最佳提取條件進行酶解試驗，酶解條件為pH7.0，溫度50℃，加酶量2 200 U/g，料水質(zhì)量比1.0：1.9，時間300 min，同條件下多次重復試驗以減少誤差，試驗結(jié)果見表5。

由表5可知，實際測得青鱗魚蛋白質(zhì)水解度平均值為14.82%，與理論預測值14.51%相比誤差小于0.5%;實際測得游離氨基態(tài)氮含量為1.946mg/ml。表明采用RSA分析法優(yōu)化得到的水解條件參數(shù)準確可靠。在上述的工藝流程和試驗確定的工藝條件下，用風味蛋白酶對青鱗魚魚肉水解處理，制得的濃縮魚蛋白質(zhì)具有如下特性：色澤為白色至灰白色，固體疏松無結(jié)塊，無腥臭味，易溶于水，口感不苦有魚肉的鮮味，表明此工藝具有較高實用價值。

2.5 酶解物組分分析

2.5.1 標準曲線的繪制 測得Sephadex G-15柱的Vc為14. 98 ml，柱床體積為47. 50 ml，由各標準物的保留時間計算出相應的vP，進而計算出有效分配系數(shù)Kav，制作標準曲線（圖9）。由圖9可見，Kav（有效分配系數(shù)）與相對分子質(zhì)量的對數(shù)值（lgMr）呈線性關(guān)系，回歸方程為Y= -0. 879 80x+2.767 71，r=0. 995 23，其中x為相對分子質(zhì)量的對數(shù)值，y為有效分配系數(shù)，標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)為0. 995 23，說明線性關(guān)系很好，可以根據(jù)此回歸方程計算出待測樣品的相對分子質(zhì)量27]。

2.5.2 酶解物分子質(zhì)量分布 取待測酶解液2 ml利用Sephadex G-15凝膠柱層析分離，流速為0.4ml/min，每管收集2 ml，由此得到洗脫峰（圖10）。由圖10可知，青鱗魚魚肉經(jīng)風味蛋白酶水解后產(chǎn)生不同分子質(zhì)量的多肽類物質(zhì)。酶解樣品經(jīng)過Sephadex G-15凝膠分離后出現(xiàn)8個明顯的洗脫峰，根據(jù)標準曲線可以計算出8個峰值處的分子質(zhì)量及含量，分別為1484.72（14. 91%）、1 075.34（5.22%）、674. 00（0.70%）、563. 72（1.94%）、185. 28（ 48. 86%）、61. 33（5.91%）、34. 45（2.88%）和9. 93（ 20. 23%）。酶解蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為185. 28 -1 484. 72，酶解產(chǎn)物中主要由小分子的肽（3-19肽）構(gòu)成，占酶解產(chǎn)物總量的71. 63%;其中2-4肽（分子質(zhì)量185. 28）占酶解產(chǎn)物總量的48. 86%，由此可見青鱗魚肉經(jīng)風味蛋白酶水解后的主要產(chǎn)物為聚合度為2-4的小分子寡肽。氨基酸殘基最小為57，平均分子質(zhì)量為61. 33，酶解產(chǎn)物代表游離氨基酸，占酶解產(chǎn)物總量的5. 91%;而平均分子質(zhì)量34. 45和9.93洗脫峰的出現(xiàn)表明酶解產(chǎn)物還含有其他雜質(zhì)和非氨基酸殘基類物質(zhì)[28-30]。

3 結(jié)論

通過單因素試驗，考察了不同因素對風味蛋白酶水解青鱗魚魚肉效果的影響，研究結(jié)果表明，在試驗選取的因素水平范圍內(nèi)，結(jié)果表明反應溫度和pH值對酶解效果影響較小，酶解時間、料水質(zhì)量比和加酶量對酶解效果影響較大;應用響應面試驗設(shè)計優(yōu)化的酶解工藝：pH值7.0、酶解溫度50℃、加酶量2 200 U/g、酶解時間300 min、料水質(zhì)量比1.0：1.9，在此條件下，游離氨基態(tài)氮含量和水解率分別可達1. 946 mg/ml和14. 82%，且以青鱗魚魚肉為原料制得的濃縮魚蛋白質(zhì)具有良好的感官特性。酶解產(chǎn)物主要由3- 19肽構(gòu)成，占總酶解產(chǎn)物的71. 63%;其中2-4肽占總酶解產(chǎn)物的48. 86%。表明青鱗魚魚肉經(jīng)風味蛋白酶水解時主要生成聚合度為2-4的小分子寡肽，風味蛋白酶對青鱗魚蛋白質(zhì)具有較強水解作用。

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