高、低糖甘蔗品種伸長期糖分積累特征及代謝相關(guān)酶活性分析

?？∑?苗小榮 王道波 黃維 楊麗濤 李楊瑞

摘要：為了探究高、低糖甘蔗品種伸長期蔗糖代謝相關(guān)酶與糖分積累的相關(guān)性，采用桶栽試驗，對甘蔗高糖（CT35）和低糖（B8）品種伸長期不同成熟度的葉和莖中的蔗糖合成方向和分解方向酶的酶活性、蔗糖、葡萄糖和果糖含量進行分析。結(jié)果表明，2個品種葉中蔗糖和己糖含量與NI酶活性呈顯著正相關(guān)，莖中蔗糖含量與SPS和CIN酶活性呈顯著正相關(guān)，與SS-e、SAI和NI酶活性呈顯著負相關(guān)。GT35在成熟莖和老莖中蔗糖含量顯著高于B8，己糖含量則顯著低于B8。GT35中酶活性顯著高于低糖B8的酶有成熟葉中的SPS、SS-e和SAI，老葉中的SPS、SS-e、NI和CIN，幼葉中的SS-s和NI，成熟莖中的SPS和CIN，老莖中的SPS、SS-s和CIN以及幼莖中的SS-e和CIN。B8中酶活性顯著高于GT35的酶有幼葉中的SS-e、SA/和CIN，成熟葉中的SA/和CIN，老葉中的SAI和SS-s，幼莖中的SA/、SS-s和NI，成熟莖中的SS-s、SS-e和SAI，老莖中的NI?；谝陨辖Y(jié)果，認為葉中高SPS和NI酶活性，莖中SPS和CIN酶活性高，SAI、SS-e和NI酶活性低，可能是調(diào)節(jié)伸長期高糖甘蔗品種莖中蔗糖積累的重要因素。

關(guān)鍵詞：甘蔗;伸長期;蔗糖代謝相關(guān)酶;糖分積累

中圖分類號：S566.1

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0537-07

甘蔗是世界上最重要的糖料作物，提高甘蔗的產(chǎn)量和蔗糖分，是現(xiàn)階段甘蔗育種和栽培中面臨的重大挑戰(zhàn)[1-3]。糖分積累是個復雜的過程，由多種酶調(diào)控，涉及到蔗糖的合成、運輸和代謝等生理過程，其中蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）和轉(zhuǎn)化酶（INV）是調(diào)控蔗糖代謝途徑的3大關(guān)鍵酶[4-5]。蔗糖代謝相關(guān)酶是研究蔗糖代謝機理的一個重要方面，探討甘蔗體內(nèi)與蔗糖代謝相關(guān)酶的水平、消長規(guī)律和基因的遺傳多樣性，可為選育高糖甘蔗品種奠定理論基礎(chǔ)‘卅。

在植物中，SPS是光合產(chǎn)物向蔗糖和淀粉分配的關(guān)鍵調(diào)控點，也是蔗糖合成的關(guān)鍵限速酶之一，其酶活力與蔗糖合成呈正相關(guān)[7-11]。SS能催化蔗糖合成，也能催化蔗糖分解，促使蔗糖進入各種代謝途徑[12]，通過調(diào)控庫器官輸入蔗糖多少和代謝蔗糖的能力，來影響果實品質(zhì)和作物產(chǎn)量[13]。INV在蔗糖的轉(zhuǎn)運、貯藏和分配中發(fā)揮重要作用[14]，其中細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶（ CIⅣ）是質(zhì)外體韌皮部蔗糖卸載通道的關(guān)鍵酶[15]。可溶性酸性轉(zhuǎn)化酶（SAI）與果實發(fā)育、成熟以及糖分的積累密切相關(guān)[16];中性或堿性轉(zhuǎn)化酶（ N/）在線粒體中，與線粒體膜上蔗糖轉(zhuǎn)運蛋白酶活性相互作用，在調(diào)節(jié)細胞滲透壓和中間產(chǎn)物代謝方面起著重要作用[17-18]。蔗糖代謝相關(guān)酶活力水平高低，不僅影響含糖量，而且還決定“庫”器官中積累糖的成分，因此蔗糖代謝相關(guān)酶對蔗糖積累的調(diào)控機制一直是研究的熱點問題[5]。

甘蔗不同生育期蔗糖代謝相關(guān)酶與蔗糖積累的相關(guān)性研究，是解開甘蔗莖糖分積累復雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的必要依據(jù)。甘蔗產(chǎn)量和蔗糖含量的增加歸結(jié)為“源一庫”關(guān)系的協(xié)調(diào)，“源”和“庫”器官中蔗糖積累過程，不僅受發(fā)育階段的調(diào)節(jié)，而且還受蔗糖運輸相關(guān)酶活性的調(diào)節(jié)，是蔗糖合成和分解酶類共同協(xié)作調(diào)節(jié)的[19]。伸長期以甘蔗發(fā)大根、長大莖的個體生長為主，是甘蔗一生中生長最快和生理代謝最為活躍的時期，也是決定甘蔗莖產(chǎn)量的關(guān)鍵時期[20]。因此，在課題組對甘蔗工藝成熟期2個甘蔗品種（GT28和ROC22）節(jié)間蔗糖代謝相關(guān)酶活性與蔗糖積累相關(guān)性研究的基礎(chǔ)上，本研究旨在探究伸長期高、低糖甘蔗品種葉和莖中蔗糖代謝相關(guān)酶活性與蔗糖積累的關(guān)系，探討高、低糖甘蔗品種伸長期糖分積累差異的內(nèi)在機理，為進一步揭示甘蔗在生長發(fā)育過程中甘蔗莖糖分積累的分子調(diào)節(jié)機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗與材料

甘蔗高糖品種GT35和低糖品種B8由廣西農(nóng)業(yè)科學院甘蔗研究所提供。于2014年1月25日在廣西大學農(nóng)學院甘蔗溫室大棚中進行沙土育苗，3月20日選取大小、長勢一致的幼苗移栽入塑料桶（300 mmX350 mm）中。每桶裝營養(yǎng)土25 kg，其營養(yǎng)土成分為土：牛糞：砂子比例為7：2：1（質(zhì)量比）。于2014年7月20日，取伸長期（自甘蔗開始拔節(jié)至伸長基本停止的時期）的幼莖、成熟莖、老莖、幼葉、成熟葉和老葉，用于測定蔗糖合成方向（SPS和蔗糖合成酶合成方向SS-s）和分解方向（SAI、CIN、NI和蔗糖合成酶分解方向SS-c）酶活性和糖分含量。采樣時以頂端第一片完全展開葉為+1葉，即成熟葉，處于頂端中心位置還沒有展開的葉為幼葉，甘蔗靠近莖基部的葉片為老葉。幼莖為幼葉包裹的未成熟莖，成熟莖為甘蔗莖中部已經(jīng)完全成

熟的莖，老莖為靠近甘蔗莖基部的莖。每個甘蔗品種隨機選取30株，把相同成熟度的葉片切碎混勻后，分成3份。同樣，把相同成熟度的莖節(jié)去皮，切碎混勻后，也分成3份。對每份樣品分別進行蔗糖分和酶活性的測定。

1.2 儀器和試劑

蔗糖、葡萄糖和果糖含量的測定采用美國Water公司Alliance2695高效液相色譜儀，酶活性測定采用美國伯騰Synergy H1全功能酶標儀。乙腈、蔗糖、葡萄糖和果糖均為色譜純，試驗用水為超純水。

1.3 糖分含量的測定

利用HPLC技術(shù)測定甘蔗葉和莖中蔗糖、葡萄糖和果糖含量[17]。將甘蔗節(jié)間去皮并切成小塊，將葉片切碎，用液氮研磨成均勻的粉末狀。稱取2.5 9粉末置于50 ml離心管，加入10 ml 80%乙醇，80℃水浴提取30 min，每隔5min搖勻1次，12 000 r/min離心15 min，取上清液，用80%乙醇重復抽提2次，將上清液合并于50 ml離心管中，90 cC水浴約3h，揮發(fā)至大約2 ml，將上清液定容到10 ml。用0.22μm微孔濾膜過濾除去雜質(zhì)，得到糖分提取液。色譜條件為：YMC-Pack NH2 carbohydrate column （250.0 mmx4.6mm，5μm），柱溫40℃，流速1ml/min，進樣量為20μl，時間20 min。依據(jù)標準品的峰面積和糖分含量，利用公式（標樣峰面積/標樣糖分含量=樣品峰面積/樣品糖分含量）可計算樣品中的糖分含量。己糖含量為葡萄糖和果糖含量之和。

1.4 蔗糖代謝相關(guān)酶活性測定

甘蔗蔗糖合成方向酶（SPS和SS-s）和分解方向酶（SA/，CIN，NI和SS-c）的提取、純化和酶活性的測定，參照?？∑娴萚21-22]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007進行數(shù)據(jù)初步處理，運用SPSS21.0對數(shù)據(jù)進行顯著性和相關(guān)性分析。采用Duncan法進行多重比較分析。將不同成熟度莖中蔗糖含量變化與相應(yīng)部位的某個酶活性變化進行相關(guān)性分析。同理，分析莖中己糖含量、葉中蔗糖和己糖含量與蔗糖代謝相關(guān)酶酶活性的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 伸長期高、低糖甘蔗品種葉和莖中糖分含量變化

2.1.1 蔗糖含量變化在伸長期，GT35和B8莖中蔗糖含量的變化趨勢相同，呈現(xiàn)為老莖>成熟莖>幼莖（圖1），GT35在老莖和成熟莖中蔗糖含量極顯著高于B8，說明所選品種GT35和B8莖中蔗糖含量存在顯著差異，可以作為本試驗的材料。

2個甘蔗品種的幼莖中蔗糖含量差異不顯著，主要是因為幼莖是分生組織，細胞處于旺盛的分裂和生長階段，不進行蔗糖的積累。幼葉合成的蔗糖先是供給自身的生長，多余的部分才供給甘蔗莖的生長，因此成熟葉才是合成蔗糖的主要功能葉。GT35在成熟葉和老葉中蔗糖含量高于B8，說明GT35葉中合成蔗糖的能力高于B8，但品種間差異不顯著。

2.1.2 己糖含量變化在伸長期，GT35和B8在成熟莖中己糖含量顯著高于幼莖和老莖（圖2）。B8在老莖和成熟莖中己糖含量顯著高于GT35，說明GT35在老莖和成熟莖中催化蔗糖合成的酶類酶活性比較強，能催化葡萄糖和果糖合成蔗糖，從而降低己糖含量。葉中己糖含量變化趨勢相同，呈現(xiàn)為幼葉>成熟葉>老葉，但品種間差異不顯著。

2.2 伸長期高、低糖甘蔗品種葉和莖中蔗糖合成方向酶活性變化

2.2.1 SPS酶活性變化在伸長期，GT35和B8莖中SPS酶活性變化趨勢相同，呈現(xiàn)為老莖>成熟莖>幼莖（圖3）。GT35在成熟莖和老莖中SPS酶活性分別是B8的1.59倍和1.51倍，品種間差異都達到極顯著水平，而在幼莖中未達到顯著差異水平。GT35葉中SPS酶活性呈現(xiàn)為成熟葉>老葉>幼葉，老葉和成熟葉中SPS酶活性分別是幼葉的2.12倍和2.40倍，品種內(nèi)達到顯著差異水平。B8葉中SPS酶活性呈現(xiàn)為成熟葉>幼葉>老葉，成熟葉和幼葉中SPS酶活性分別是老葉的3. 35倍和1.89倍，品種內(nèi)達到顯著差異水平。說明高糖甘蔗品種成熟葉、老葉、成熟莖和老莖中SPS酶活性顯著高于低糖品種。 2.2.2 SS-s酶活性變化在伸長期，GT35莖中SS-s酶活性變化趨勢呈現(xiàn)為老莖>成熟莖>幼莖，在老莖和成熟莖中SS-s酶活性分別是幼莖中2.44倍和1.75倍，達到極顯著差異水平（圖4）。B8莖中SS-s酶活性變化趨勢呈現(xiàn)為成熟莖>幼莖>老莖，成熟莖和幼莖SS-s酶活性分別是老莖中的2.08倍和1.28倍，達到極顯著差異水平。葉中SS-s酶活性在GT35變化趨勢呈現(xiàn)為幼葉>成熟葉>老葉，差異達到極顯著水平。B8葉中SS-s酶活性變化趨勢呈現(xiàn)為成熟葉>幼葉>老葉，差異達到極顯著水平。高糖品種老莖中SS-s酶活性顯著高于低糖品種，而低糖品種成熟葉和老葉中SS-s酶活性顯著高于高糖品種，說明SS-s酶活性在高、低糖甘蔗品種葉和莖中表達模式不同。 2.3 伸長期高、低糖甘蔗品種莖和葉中蔗糖分解方向酶活性變化 2.3.1 SS-c酶活性變化在伸長期，GT35和B8莖中SS-c酶活性變化趨勢相同，呈現(xiàn)為幼莖>成熟莖>老莖（圖5）。GT35幼莖SS-c酶活性是B8中的1.28倍，品種間達到極顯著差異水平。B8成熟莖中SS-c酶活性是GT35的1.39倍，品種間達到極顯著差異水平。葉中SS-c酶活性在GT35中變化趨勢呈現(xiàn)為老葉>成熟葉>幼葉，而在B8葉中呈現(xiàn)為老葉>幼葉>成熟葉，品種間同一部位差異達到顯著水平。GT35在老葉和成熟葉中SS-c酶活性高于B8，分別是其的1. 50倍和1.55倍，而在幼葉中酶活性低于B8。高糖甘蔗品種成熟莖和老莖中SS-c酶活性低于低糖甘蔗品種，而在成熟葉和老葉中SS-c酶活性顯著高于低糖甘蔗品種，說明SS-c在高、低糖甘蔗品種葉和莖中表達模式不同。 2.3.2 NI酶活性變化在伸長期，GT35和B8莖中NI酶活性變化趨勢相同，呈現(xiàn)為幼莖>成熟莖>老莖（圖6）。B8幼莖和老莖中NI酶活性顯著高于GT35，分別是其的1.16倍和1.21倍。GT35成熟莖中NI酶活性高于B8，但未達到顯著差異水平。GT35和B8葉中NI酶活變化趨勢也相同，呈現(xiàn)為幼葉>成熟葉>老葉。GT35在幼葉、成熟葉和老葉中NI酶活性分別是B8的1.33倍、1.04倍和1.88倍，其中品種間差異在幼葉和老葉中達到極顯著水平，而在成熟葉中差異未達到顯著水平。說明高、低糖甘蔗品種葉和莖中NI酶活性表達模式相同，其次，高糖品種在老葉中NI酶活性顯著高于低糖品種，而在老莖中顯著低于低糖品種。

2.3.3 SAI酶活性變化在伸長期，GT35和B8莖中SAI酶活性變化趨勢相同，呈現(xiàn)為幼莖>成熟莖>老莖（圖7）。在幼莖、成熟莖和老莖中B8的SAI酶活性分別是GT35的1.53倍、1.30倍和1.32倍，其中品種間在幼莖和成熟莖中達到極顯著差異水平，而在老莖中未達到顯著差異水平。GT35葉中SAI酶活性變化趨勢呈現(xiàn)為成熟葉>幼葉>老葉，品種內(nèi)達到極顯著差異水平。而在B8中呈現(xiàn)為幼葉>成熟葉>老葉，幼葉和成熟葉中SAI酶活性分別是老葉的1. 72倍和1.19倍，酶活性在幼葉和老葉之間達到顯著差異水平，而在成熟葉和老葉之間未達到顯著差異水平。說明高、低糖甘蔗品種在莖中SAI表達模式相同，其次，高糖品種SAI酶活性低于低糖品種，而成熟葉中高糖品種SAI酶活性顯著高于低糖品種，老葉中SA/酶活性顯著低于低糖品種。

2.3.4 CIN酶活性變化在伸長期，GT35和B8莖中CIN酶活變化趨勢相同，呈現(xiàn)出老莖>成熟莖>幼莖（圖8）。GT35在幼莖、成熟莖和老莖中CIN酶活性分別是B8中的4.40倍、2.27倍和2.76倍，品種間相同部位都達到極顯著差異水平，GT35品種內(nèi)不同部位間差異也達到極顯著差異水平。GT35葉中CIN酶活性呈現(xiàn)為老葉>成熟葉>幼葉。B8幼葉中CIN酶活性是GT35中的2.10倍，達到極顯著差異水平。CIN在高、低糖甘蔗品種莖中酶表達模式相同，高糖品種莖中CIN酶活性顯著高于低糖品種，說明CIN可能在調(diào)節(jié)甘蔗莖糖分積累中發(fā)揮作用。

2.4 伸長期高、低糖甘蔗品種葉和莖中蔗糖代謝相關(guān)酶活性與糖分含量的相關(guān)性

GT35葉中蔗糖含量與SPS酶活性和NI酶活性呈極顯著正相關(guān)，與SS-s呈極顯著負相關(guān)（表1）。B8葉中蔗糖含量與SPS、SS-s、CIN、SAI和NI酶活性呈正相關(guān)，其中與NI和SAI達到極顯著相關(guān)水平。GT35葉中己糖含量與SS-s和NI呈極顯著正相關(guān)，而與SPS呈極顯著負相關(guān)，與SS-c和CIN呈顯著負相關(guān)。2個品種莖中蔗糖含量都與SPS和CIⅣ酶活性呈極顯著正相關(guān)，與SS-c、NI和SAI酶活性呈極顯著負相關(guān)，而GT35莖中蔗糖含量與SS-s酶活性呈極顯著正相關(guān)。B8莖中己糖含量與SS-s酶活性呈極顯著正相關(guān)，而GT35莖中己糖含量與NI酶活性呈極顯著正相關(guān)。2個品種莖中己糖含量與SPS酶活性呈負相關(guān)，但都未達到顯著相關(guān)水平。說明高、低糖甘蔗品種在葉和莖中糖分積累與蔗糖代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)性，有共同規(guī)律，但也存在差異。

3 討論

甘蔗是莖內(nèi)積累蔗糖含量最高的作物，蔗糖的積累是甘蔗品質(zhì)形成的關(guān)鍵，而蔗糖代謝又是蔗糖積累的重要環(huán)節(jié)。SPS與甘蔗生長、發(fā)育和糖分積累密切相關(guān)，其活性大小直接影響甘蔗的蔗糖合成和積累能力[23-24]本研究結(jié)果表明，2個甘蔗品種莖中蔗糖含量與SPS和CIⅣ酶活性顯著正相關(guān)，高糖品種GT35在老莖和成熟莖中SPS酶活性顯著高于低糖品種B8，這與前人的研究結(jié)果相一致[23.25]。甘蔗莖中SAI酶活性降低有利于蔗糖積累，而節(jié)間CIN酶活性提高，有利于蔗糖從低含量節(jié)間向高含量節(jié)間的運輸[21]。本研究結(jié)果也表明甘蔗莖CIN自上而下莖段中酶活性逐漸增加，與莖中蔗糖含量呈極顯著正相關(guān)，且GT35莖中CIN酶活性極顯著高于低糖B8，說明CIN在甘蔗莖糖分積累中起重要作用。因此，莖中高SPS和CIN酶活性可以作為伸長期甘蔗高糖品種的一個重要特性。

果實中蔗糖的積累與SA/活性呈顯著負相關(guān)[26]。引起甜瓜果實蔗糖積累的主要內(nèi)在因子是SPS和SS-s酶活性的增加，INV和SS-c酶活性降低[27]。在靈武長棗果實發(fā)育前期SS-c酶活性高于SS-s酶活性，發(fā)育中后期以SS-s酶活性為主，SS-c酶活性隨果實發(fā)育而下降，而SS-s酶活性隨果實發(fā)育而逐步增強[28-29]。有研究結(jié)果表明，隨著甘蔗節(jié)間成熟，甘蔗莖糖分增加，從而抑制SS-s酶活性，甘蔗節(jié)間錘度、蔗糖含量與SS-s酶活性呈顯著負相關(guān)[22];本研究中，甘蔗伸長期高糖品種老莖蔗糖含量顯著高于低糖品種，其SS-s酶活性仍維持在較高水平，且顯著高于低糖品種;同時，相關(guān)性分析結(jié)果表明，高糖品種莖中蔗糖含量與SS-s活性呈顯著正相關(guān)，低糖品種呈負相關(guān)，這可能與高糖品種甘蔗莖尚未完全成熟，蔗糖含量還有較大提升空間有關(guān)，可作為甘蔗伸長期高、低糖品種的一個重要特性。同時，本研究結(jié)果也表明甘蔗莖蔗糖積累與SS-c、SAI和NI酶活性呈極顯著負相關(guān)，這與前人研究結(jié)果相一致[26-29]。在駿棗和辣椒果實的糖代謝中，NI酶活性起主要的調(diào)控作用[30-31]，這與本研究2個甘蔗品種葉中蔗糖和己糖含量與NI酶活性呈顯著正相關(guān)的結(jié)果相一致。前人研究也發(fā)現(xiàn)在甘蔗成熟期，葉中SAI酶活性隨甘蔗的成熟而降低，而NI酶活性隨甘蔗的成熟而升高[32]。

由于甘蔗基因型遺傳特性差異，不同甘蔗品種中的蔗糖含量存在著顯著的差異，但目前對這種現(xiàn)象的生化原理所知者甚少[5]。本研究結(jié)果表明，高、低糖甘蔗品種在伸長期葉和莖中蔗糖積累存在著共性特征，葉中蔗糖和己糖含量與NI酶活性呈極顯著正相關(guān)，莖中蔗糖含量與SPS和CIN酶活性呈極顯著正相關(guān)，與SS-c、SAI和NI酶活性呈極顯著負相關(guān)。但低糖品種葉和莖中蔗糖代謝相關(guān)酶活性也有顯著高于高糖品種的酶。由于甘蔗蔗糖分的表現(xiàn)型是由基因型和環(huán)境共同作用的結(jié)果。同時，甘蔗又是異源多倍體的雜合體，染色體遺傳行為復雜，導致甘蔗糖分代謝機制的遺傳學研究陷入困境。但利用功能基因組學，從轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平研究甘蔗糖分代謝相關(guān)基因，不僅可以避開這個問題，而且能使研究深入到基因水平。下一步將采用RNA-Seq和iTRAQ技術(shù)分析這2個品種在伸長期幼莖、成熟莖和老莖中的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組，進行蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組關(guān)聯(lián)分析，篩選差異表達基因，挖掘調(diào)控甘蔗糖分積累的關(guān)鍵基因，構(gòu)建甘蔗糖分積累關(guān)鍵差異基因的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析甘蔗莖糖分積累的分子調(diào)控機制。

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（責任編輯：陳海霞）