陸地棉轉GR79與GAT基因對草甘膦抗性的鑒定及其遺傳規(guī)律分析

趙龍飛 趙亮 狄佳春 陳旭升

摘要：本研究采用特異引物對陸地棉種質系GGK-2的抗草甘膦基因進行PCR鑒定，結果顯示：GCK-2不僅擴增出488 bp的GR 79基因的特征條帶，同時還擴增出379 bp的GAT基因特征條帶。而后采用草甘膦對陸地棉與陸地棉雜交F2分離群體進行浸種抗性鑒定，結果顯示CGK-2對草甘膦表現(xiàn)出良好抗性，其抗草甘膦性狀分離符合抗性株：非抗性株=3：1的質量性狀分離規(guī)律，顯示抗草甘膦性狀是受孟德爾單顯性基因控制的質量性狀。同時，利用陸地棉與陸地棉雜交F：群體對抗性基因GR79和GAT的分離進行PCR檢測，顯示目的基因GR79和GAT導人棉花后，以共有的方式在棉花雜交后代穩(wěn)定地遺傳傳遞，共有比率高達97.9%。而后，采用海島棉與陸地棉雜交F2群體作為定位群體，利用SSR分子標記對外源基因進行遺傳定位，結果顯示GR79和GAT2個基因均被定位于棉花第20號染色體上，并表現(xiàn)為連鎖遺傳，其遺傳距離為3.3 cM。在GR79基因位點一側有7個SSR分子標記，與其最近的標記為相距7.1 cM的NAU2579;在GAT基因位點一側也有7個SSR分子標記，與其最近的標記是相距3.9 cM的NAU3137。本研究為品系GGK-2在抗除草劑棉花育種中的應用提供了理論依據。

關鍵詞： GGK-2;抗草甘膦基因;GR79;GAT;遺傳規(guī)律

中圖分類號： Q78

文獻標識碼：A

文章編號： 1000-4440（ 2019） 03-0531-06

棉花是十分重要的經濟作物，與國民生活以及國家的農業(yè)經濟息息相關。中國棉花集約化生產水平相對落后，其中雜草對棉花的危害是導致棉花綜合生產效益較低的一個重要因素。雜草不僅與農作物競爭水、肥、光和空間等，而且容易滋生病蟲害，嚴重影響棉花個體的生長發(fā)育，造成棉花產量降低與品質的下降[1]。草甘膦是世界公認的優(yōu)良除草劑之一，其除草范圍廣，高效、低毒、無殘留，并且價格低廉，因此草甘膦尤其適合在作物大面積種植地區(qū)推廣使用。這就需要種植的作物對草甘膦具有抗性，這樣在使用草甘膦時不至于對作物造成藥害[2]。

當今世界，作物生產逐漸向機械化和集約化方向發(fā)展。抗除草劑品種的培育將成為中國棉花機械化生產的一種迫切需求。棉花對草甘膦的抗性可通過以下2種主要途徑獲得：一是通過誘變或向棉株體內導人對草甘膦不敏感的基因，進而提高植物對草甘膦的耐受性。二是通過向棉株體內導人草甘膦降解基因，在草甘膦發(fā)揮作用前將其降解，使棉株對草甘膦產生抗性。Comai等[3-4]在鼠傷寒門氏菌中篩選并分離出了抗草甘膦的突變基因aroA，并成功在大腸桿菌中獲得抗草甘膦特性的表達。Nida等[5]將在土壤農桿菌變種CP4菌株中發(fā)現(xiàn)的莽草酸羥基乙烯轉移酶基因（ EPSPS），通過農桿菌介導的方法轉移到棉花中，成功培育出具有抗草甘膦除草劑特性的棉花品種。中國在自主培育抗草甘膦棉花新種質系方面已有不少研究報道[6-10]，特別在自主篩選與克隆抗草甘膦基因方面已取得長足進步[ll]。中國農業(yè)科學院生物技術研究所科研團隊在草甘膦嚴重污染的土壤微生物中克隆到抗草甘膦新型EPSP合酶GR79及N-乙酰轉移酶GAT，并進行植物偏愛性密碼子改造，構建含GR79或GAT單基因和同時含有雙基因的植物表達載體，并將這2種基因同時導入到棉花中，獲得了雙抗草甘膦基因的棉花新種質系，通過分子檢測和功能鑒定發(fā)現(xiàn)，轉基因種質系的抗草甘膦能力達生產用量的5倍以上[12-14]。

本試驗利用中國農業(yè)科學院生物技術研究所提供的抗草甘膦棉花新品系GGK-2作為試驗材料，通過對這一抗草甘膦棉花新品系進行抗性基因的PCR鑒定和抗性遺傳分析，并對抗性基因進行連鎖遺傳定位，旨在為國產抗除草劑棉花新材料育種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

國產抗草甘膦陸地棉新種質系GGK-2由中國農業(yè)科學院生物技術研究所郭三堆研究員提供，勝利1號（V-1）為非抗草甘膦的海島棉品種，YK1107為非抗草甘膦的陸地棉種質系。

以GGK-2為母本，配置雜交組合：GGK-2×YK1107、GGK-2xV-1。其F.代自交獲得F2代群體[GGK-2xYK1107] F2、[GGK-2xV-1] F2.

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因的PCR檢測 本試驗所采用的特異引物是根據郭三堆等[12]公布的GR79和GAT基因序列自行合成。GR79特異性引物序列如下，其目標條帶總長488 bp;F：5’-GATGCGAGCACGGCCTG-CTACTT-3’： R：5’-ATGCGAATGTGCGGAACCTTG-AC-3’;GAT基因的特異性引物序列如下，其目標條帶總長為379 bp;F：5’-CCTATGAGTTGAGGCACC-GTATT-3’：R：5’-TGAGGTCCCACAGGAGGAGTGT-C-3’。

取GGK-2、V-1與YK1107的種子，提取DNA，方法參照匡猛等[15]的方法。PCR擴增產物在恒壓90 V條件下，使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察目的基因片段。

1.2.2 草甘膦抗性的生物學鑒定 棉種對草甘膦的抗性鑒定參照陳旭升等報道的棉籽浸種鑒定法[16]。取GGK-2種子50粒，YK1107種子50粒，GGK-2xYK1107 F，種子100粒，將41%濃度的農達試劑稀釋到0.3%，在150 ml錐形瓶中用稀釋后的農達試液浸沒種子24 h，取出棉種做沙基發(fā)芽試驗。然后放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，計數各群體對草甘膦的抗性苗與非抗性苗。

1.2.3 GR79和GAT基因的染色體定位取GGK-2xV-1 F2的種子提取DNA，方法同上。在F'分離群體中隨機選取含有目的基因GR79和GAT個體各10個，對應不含有目標基因的個體10個，分別建立GR79和GAT的近等基因池。然后利用我們前期篩選獲得的分布于棉花26對染色體上的234對SSR核心引物[17]，對雙親和近等基因池進行PCR擴增，篩選有多態(tài)性的引物。PCR擴增反應體系為10.0μl，反應程序為，GR79基因：94 cC預變性10 min;94℃變性15 s，63 ℃退火30 s，72 cC延伸1 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min;GAT基因：94 cC預變性10 min;94℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后72 cC延伸10 min。擴增產物在8.0%的非變性PAGE凝膠上電泳，電壓為恒壓220V，電泳緩沖液為lxTBE。電泳結束后，參照張軍等[18]的方法進行銀染，在膠片觀察燈下篩選多態(tài)性引物。用獲得的多態(tài)性引物檢測F'代分離群體單株的標記基因型，統(tǒng)計多態(tài)性條帶，將與V-1帶型相同的個體基因型記為1，與GGK-2帶型相同的個體基因型記為2，共顯性雜合帶型的基因型記為3，條帶為空或無法辨識的記為0。采用Join Map4.0軟件進行連鎖分析，以鎖定目標引物以及目的染色體。然后合成目的染色體上的其他SSR引物對圖譜進行加密，繪制連鎖遺傳圖譜。

2 結果與分析

2.1 GGK-2抗性基因的PCR鑒定

本試驗依據GR79和GAT基因序列設計了2個基因的特異檢測引物，其PCR擴增結果分別見圖1、圖2。兩圖中泳道1均為品系GGK-2，它不僅擴增出GR79基因的特征條帶（大小488 bp），同時還擴增出GAT基因379 bp大小的特征條帶。兩圖中的泳道2、泳道3分別為2個對照品系：V-1（海島棉）、YK1107（陸地棉），二者均不含GAT與GR79基因;因此都沒有擴增出488 bp與379 bp大小的特征條帶。以上結果表明，外源抗性基因GR79和GAT已成功轉入品系GGK-2。

2.2 棉苗對草甘膦生物學抗性鑒定

用質量濃度為0.3%的草甘膦浸種，在溫光培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d后取出棉苗，比較抗性苗與非抗性苗的表型差異（圖3）。由圖3可見，GGK-2棉苗發(fā)育正常，根系長出許多須根，表現(xiàn)出對草甘膦的良好抗性;而同等條件下的對照品系YK1107的棉苗發(fā)育矮小，根部未見須根，幼苗長勢差，并有發(fā)黑壞死的癥狀，對草甘膦表現(xiàn)為不抗。雜交F，分離群體的抗性苗與非抗性苗的發(fā)育情況見圖3C和圖3D。

統(tǒng)計2個親本與F2群體的抗性苗與非抗性苗數，其結果列于表1。由表1可見，GGK-2棉苗全部表現(xiàn)為抗性苗;YK1107全部表現(xiàn)為非抗性苗。通過卡方檢驗，F(xiàn)2代分離群體抗性苗和非抗性苗的比例符合孟德爾經典遺傳學的3：1分離比例，說明GGK-2的抗草甘膦性狀是受單個孟德爾顯性基因控制的質量性狀。

2.3 GR79和GAT基因在F2群體的分離特性

將GGK-2xYK1107 F，群體用于目的基因GR79和GAT在雜交分離后代遺傳表達特性的分析，通過對分離群體2個目的基因的PCR檢測，其分離情況見表2。由表2可知，GGK-2×YK1107 F2群體中GR79基因的顯性隱性個體通過卡方檢驗符合3：1的分離比例;對GAT基因的檢測也是同樣的結果。這說明，這2個目的基因都呈顯性表達特征，都符合單基因控制的質量性狀遺傳規(guī)律;而且F2分離群體中的GR79基因與GAT基因呈現(xiàn)明顯的共有分離現(xiàn)象，總共檢測F2群體137顆種子個體，其中有94個個體表現(xiàn)為GR79與GAT基因的共有分離現(xiàn)象，只有2個個體未出現(xiàn)GR79和GAT的共有分離現(xiàn)象，共有比例高達97.9%。至于2個個體為什么未能出現(xiàn)GR79和GAT的共有分離現(xiàn)象，其內在原因尚需進一步研究探討。

2.4 GR79和GAT基因的染色體定位

相比于陸地棉與陸地棉雜交分離群體GGK-2xYK1107 F，，海島棉與陸地棉雜交群體GGK-2xV-1F，的凝膠電泳的多態(tài)性條帶更加豐富，故將GGK-2xV-1 F2群體用于目的基因的定位。通過對F2分離群體2個目的基因做PCR檢測，其分離情況見表3。表3中顯示：在海島棉與陸地棉雜交F2分離群體中，外源基因GR79和GAT均符合3：1的孟德爾分離規(guī)律，因此可以利用SSR分子標記對它們進行基因定位。

利用近等基因池篩選核心引物，率先獲得的連鎖標記是NAU2579，這是一個位于棉花20號染色體上的SSR標記。外源基因GR79和GAT初步定位的目標染色體是相同的，2個基因均連鎖于棉花20號染色體上。而后查找棉花20號染色體上的其他連鎖分子標記，以豐富其遺傳圖譜。最后通過JoinMap4.0進行連鎖分析，獲得抗草甘膦基因GR79和GAT的染色體定位圖譜（圖4）。由圖4可以看出，GR79和GAT基因表現(xiàn)連鎖，兩者遺傳距離為3.3cM。共有14個SSR引物與這2個基因相連，在GR79 -側有7個SSR分子標記，在GAT -側也有7個。與GAT相距最近的SSR標記是相距3.9 cM的NAU3137，與GR79最近的分子標記是相距7.1 cM的NAU2579。整個遺傳圖譜的遺傳距離為120.9cM。值得指出的是，GR79和GAT基因雖然表現(xiàn)連鎖，但因采用的定位群體較小，只有181個個體，因此獲得兩目的基因的連鎖遺傳距離較大。

3 討論

外源基因導人棉花會產生不同的遺傳轉化事件，燕樹鋒等[IO]分析轉基因抗草甘膦棉花的遺傳情況，曾檢測26個抗草甘膦棉花轉化事件，只有20個轉化事件分離符合3：1的分離規(guī)律，其他6個轉化事件出現(xiàn)了偏分離，不符合1對基因的分離規(guī)律，表明轉基因植株中外源基因的整合和遺傳機制相當復雜。本研究通過鑒定陸地棉抗草甘膦品系GGK-2外源基因類型以及抗草甘膦基因的遺傳方式發(fā)現(xiàn)，抗草甘膦性狀符合1對孟德爾顯性基因控制的質量性狀遺傳規(guī)律。同時利用陸地棉與陸地棉雜交F，群體以及海島棉與陸地棉雜交F2群體，分別檢測基因GR79與GAT在雜交后代的分離，也均符合3：1的理論比例。前人研究結果表明，通過與某一染色體的多個SSR分子標記的連鎖關聯(lián)分析，可實現(xiàn)外源基因的染色體定位[19-21]。本研究依據Guo等[22]、Zhao等[23]公布的四倍體棉花分子標記遺傳圖譜，并利用自主篩選的分布在棉花26對染色體上的234對SSR核心引物，將基因GR79和GAT連鎖定位在棉花第20號染色體上。該定位結果相當于多次SSR分子標記連鎖重復驗證，具有極高的可靠性。

對于棉花育種者來說，鑒定轉基因種質系外源基因類型并探明其雜交后代的遺傳規(guī)律，可以有效指導育種者依據育種目標來配置不同的雜交組合，從而有目的地實現(xiàn)不同外源基因的互補與整合。本研究為國產轉抗草甘膦基因棉花新種質系GGK-2在育種中的應用提供了理論依據。

致謝： 本研究使用的抗草甘膦陸地棉品系GGK-2，由中國農業(yè)科學院生物技術研究所郭三堆研究員提供。在此謹表衷心感謝！

參考文獻：

[1]郭三堆，王遠，孫國清，等.中國轉基因棉花研發(fā)應用二十年[J].中國農業(yè)科學，2015，48（ 17）：3372-3387.

[2]陳旭升.抗除草劑棉花研究進展[J].江西農業(yè)學報，2006，18（1）：94-98.

[3] COMAI L，SEN L，STALKER D.An altered aroA gene productconfers resistant to the herbicide glyphosate[J].Science， 1983，221：370-371.

[4] COMAI L，F(xiàn)ACCIOTTI D. HIATT W R， et al-Expression inplants of a mutant aroA gene from Salmonella typhimurium conferstolerance to glyphosate[J].Nature， 1985， 371：741-744.

[5]NIDA D L，KOLACZ K H. LEEMAN M. et al-Glyphosate-tolerantcotton： genetic characterization and protein expression[J].AgricFood Chem. 1996 ，44（7）：1960-1966.

[6]祝水金，汪靜兒，俞志華，等.棉花抗草甘膦突變體篩選及其在雜種優(yōu)勢利用中的應用[J].棉花學報，2003，15（4）： 227-230.

[7]謝龍旭，李云鋒，徐培林.根癌農桿菌介導的轉aroAM12基因棉花植株的草甘膦抗性[J].植物生理與分子生物學學報，2004，30（2）：173-178.

[8] 趙福永，謝龍旭，田穎川，等.抗草甘膦基因aroAM12及抗蟲基 因BtsJm的轉基因棉株[J].作物學報，2005，31（1）：108-113.

[9] 馬燕斌，王霞，吳霞，等.新的抗草甘膦轉基因棉花獲得的初報[J].山西農業(yè)科學，2013，41（ 10）：1046-1049.

[10]燕樹鋒，祝水金，劉海芳，等.轉EPSPS基因抗草甘膦棉花的遺傳分析[J].華北農學報，2015，30（3）：54-57.

[11]王慧，閆曉紅，徐杰，等.我國抗草甘膦基因的發(fā)掘現(xiàn)狀[J].農業(yè)生物技術學報，2014，22（1）：109-118.

[12]郭三堆，孫豹，張銳，等.一種含有草甘膦抗性基因的表達載體及其應用：201410204703.6[P].2014-05-15.

[13]郭三堆，孫豹，孟志剛，等.轉抗蟲、抗除草劑基因棉花分子育種[C]//中國農學會棉花分會.中國棉花學會2015年年會論文匯編.安陽：中國棉花雜志社，2015： 50.

[14]梁成真，孫豹，孟志剛，等.CR79-epsps和CAT協(xié)同增效培育新型低殘留高抗草甘膦棉花[C]//中國農學會棉花分會.中國農學會棉花分會2017年年會暨第九次會員代表大會論文匯編.安陽：中國棉花雜志社，2017：52.

[15]匡猛，楊偉華，許紅霞，等.單粒棉花種子DNA快速提取方法[J].分子植物育種，2010，8（4）：827-831.

[16]陳旭升，劉新民，狄佳春，等.陸地棉抗草甘膦性狀的遺傳規(guī)律分析[J].江蘇農業(yè)科學，2009（1）：76-78.

[17]景超，馬曉杰，狄佳春，等.陸地棉超矮稈突變體基因的初步定位[J].遺傳，2011（12）：1393-1397.

[18]張軍，武耀廷，郭旺珍，等.棉花微衛(wèi)星標記的PACE/銀染快速檢測[J].棉花學報，2000 .21（5）：267-269.

[19]劉吉燾，馬曉杰，狄佳春，等.棉花草甘膦抗性基因CP4-EPSPS的初步定位[J].江蘇農業(yè)學報，2013，29（3）：480484.

[20]安百偉，趙亮，狄佳春，等.陸地棉Bt抗蟲基因類型鑒定與染色體定位[J].江蘇農業(yè)學報，2016，32（2）：262-266.

[21]周向陽，趙亮，狄佳春，等.抗蟲雜交棉蘇雜6號抗蟲親本的Bt基因鑒定與染色體定位[J].江蘇農業(yè)學報，2016.32（5）：987-991.

[22] GUO W， CAI C， WANC C， et al.A microsateLlite-based， gene-rich linkage map reveals genome structure， function and evolutionin Gossypium[J].Cenetics. 2007， 176（1）：527-541.

[23] ZHAO L，LV Y D. CAI C P. et al-Toward allotetraploid cottongenome assembly： integration of a high-density molecular geneticlinkage map with DNA sequence information[J].BMC Cenomics.2012. 13：539-570.