駱駝刺正丁醇萃取部位中單體化合物的分離純化及其對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的影響研究

劉雪松 馬曉玲 石磊嶺 阿勒騰圖婭 張大鵬 李寧 魏鴻雁

中圖分類號(hào) R966 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）04-0506-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.15

摘 要 目的：分離純化駱駝刺正丁醇萃取部位中的單體化合物，并探討其對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移的影響。方法：采用硅膠柱、Sephadex LH-20凝膠色譜柱、制備型高效液相色譜等方法對(duì)駱駝刺正丁醇萃取部位進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和波譜（質(zhì)譜、氫譜、碳譜等）數(shù)據(jù)分析、鑒定化合物結(jié)構(gòu)。以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為對(duì)象，以5-氟尿嘧啶（5-FU）為陽性對(duì)照，采用四甲基偶氮唑鹽法檢測(cè)經(jīng)各化合物不同劑量（均為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）預(yù)處理后的細(xì)胞抑制率，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），以篩選活性單體；采用劃痕實(shí)驗(yàn)考察上述活性單體（均為50 μg/mL）對(duì)HeLa細(xì)胞遷移能力的影響；采用金氏公式評(píng)價(jià)5-FU與上述活性單體分別聯(lián)用[（3.125+6.25）、（6.25+12.5）、（12.5+25）、（25+50）μg/mL]的效果。結(jié)果：從駱駝刺正丁醇萃取物部位中共分離得到6個(gè)化合物，分別鑒定為紫鉚素（Ⅰ）、3′，4′，7-三羥基異黃酮（Ⅱ）、對(duì)甲氧基苯乙酸（Ⅲ）、4-羥基苯乙酮（Ⅳ）、橙黃胡椒酰胺（Ⅴ）、原兒茶醛（Ⅵ）。與空白對(duì)照組比較，5-FU和各化合物（5-FU：6.25～200 μg/mL各劑量，化合物Ⅰ：12.5～200 μg/mL各劑量，化合物Ⅱ：25、50、200 μg/mL，化合物Ⅲ：6.25、100、200 μg/mL，化合物Ⅳ：50、100、200 μg/mL，化合物Ⅴ：12.5、25、200 μg/mL，化合物Ⅵ：6.25～200 μg/mL各劑量）均可顯著升高細(xì)胞抑制率，且化合物Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ的IC50值均顯著降低（P<0.05或P<0.01），其中化合物Ⅰ、Ⅵ的IC50值相對(duì)較低。5-FU與化合物Ⅰ、Ⅵ組細(xì)胞的遷移距離均較空白對(duì)照組顯著縮?。≒<0.05或P<0.01）；5-FU分別與化合物Ⅰ、Ⅵ聯(lián)用后，對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖具有相加或增強(qiáng)的協(xié)同抑制作用（增效指數(shù)均大于0.9）。結(jié)論：化合物Ⅰ～Ⅵ均為首次從駱駝刺屬植物中分離得到，紫鉚素和原兒茶醛是其正丁醇萃取部位的活性單體。這2種活性單體均可抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖和遷移，具有較強(qiáng)的體外細(xì)胞抑制作用，且與5-FU聯(lián)用后的抑制作用強(qiáng)于兩者分別單用。

關(guān)鍵詞 駱駝刺；正丁醇萃取部位；單體化合物；抗腫瘤活性；增殖；遷移；聯(lián)合用藥；人宮頸癌Hela細(xì)胞

ABSTRACT OBJECTIVE： To separate and purify Alhagi sparsifolia n-butanol extract monomeric compounds， and to investigate its effects on the proliferation and metastasis of human cervical cancer HeLa cells. METHODS： The n-butanol extract was separated and purified by silica gel column， Sephadex LH-20 gel column and prep-HPLC. The structures of compounds were analyzed and identified according to physicochemical properties and spectrum （mass spectrum， hydrogen spectrum， carbon spectrum） data. Using human cervical cancer HeLa cells as objects， 5-FU as positive control， MTT assay was used to detect the inhibitory rate of HeLa cells pretreated with different doses of compounds （6.25， 12.5， 25， 50， 100， 200 μg/mL）； IC50 was calculated to screen active monomers. Scratch test was used to investigate the effects of above active monomers （all 50 μg/mL） on the migration ability of HeLa cells. Kim’s formula was used to evaluate the effects of 5-FU separately combined with above active monomers [（3.125+6.25），（6.25+12.5），（12.5+25），（25+50）μg/mL]. RESULTS： Six compounds were isolated from the n-butanol extract part of A. sparsifolia and identified as butin （Ⅰ）， 3′，4′，7-trihydroxyisoflavone （Ⅱ）， p-methoxyphenylacetic acid （Ⅲ）， 4-hydroxyacetophenone （Ⅳ）， aurantiamide acetate （Ⅴ）， protocatechualdehydea （Ⅵ）. Compared with blank control group， 5-FU and each compound （5-FU：6.25-200 μg/mL， compound Ⅰ： 12.5-200 μg/mL； compound Ⅱ： 25， 50， 200 μg/mL； compound Ⅲ： 6.25， 100， 200 μg/mL； compound Ⅳ： 50， 100， 200 μg/mL； compound Ⅴ： 12.5， 25， 200 μg/mL； compound Ⅵ： 6.25-200 μg/mL） could significantly increase the cell inhibition rate. IC50 of compound Ⅰ， Ⅴ， Ⅵ were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and those of compound Ⅰ and Ⅵ were lower relatively. The migration distance of cells in 5-FU and compound Ⅰ and Ⅵgroups were decreased significantly， compared with blank control group （P<0.05 or P<0.01）. 5-FU separately combined with compound Ⅰ and Ⅵ showed additive and enhanced inhibitory effects on the proliferation of HeLa cells （synergistic index>0.9）. CONCLUSIONS： Compounds Ⅰ-Ⅵ are isolated from Alhagi for the first time. Butin and protocatechualdehydea are active monomers of its n-butanol extract part. Above two monomers can inhibit the proliferation and migration of human cervical cancer Hela cells， with strong inhibitory effect in vitro， and stronger inhibitory effect combined with 5-FU than any compound alone.

KEYWORDS Alhagi sparsifolia； n-butanol extract part； Monomeric compounds； Antitumor activity； Proliferation； Migration； Drug combination； Human cervical cancer HeLa cells

駱駝刺（Alhagi sparsifolia Shap.）為豆科駱駝刺屬植物[1]，是新疆干旱沙漠地區(qū)特有的一種落葉灌木，也是沙漠戈壁“三寶”之一，具有開通阻滯、止咳祛痰、清除異常黏液質(zhì)等功效，是治療腹痛腹脹、痢疾腹瀉、風(fēng)濕病以及滋補(bǔ)強(qiáng)壯、平衡體液、改善異常膽液質(zhì)的常用藥材[2-3]。宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，全球每年約有新發(fā)病例50萬，并呈逐年遞增和年輕化的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[4]。我國(guó)是宮頸癌高發(fā)國(guó)家，每年新發(fā)病例約13.5萬，約占全球每年宮頸癌新發(fā)病例總量的1/3[5]。目前，新型放化療綜合治療手段雖有助于提高中晚期和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移宮頸癌患者的治療效果，但由于毒副作用較大等原因，其臨床應(yīng)用受到了一定的限制[6]。因此，學(xué)者一直致力于探索惡性腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等相關(guān)機(jī)制，以尋求更好的治療藥物[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，駱駝刺正丁醇萃取部位抗腫瘤（尤其是宮頸癌）和免疫調(diào)節(jié)的作用最強(qiáng)[8-11]。故本研究在此基礎(chǔ)上，對(duì)駱駝刺的正丁醇萃取部位進(jìn)行分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定；同時(shí)，以體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞為對(duì)象，對(duì)其活性單體進(jìn)行篩選，并對(duì)活性單體的協(xié)同作用進(jìn)行初探，以期為駱駝刺活性成分治療宮頸癌的后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

BC-J80S型CO2培養(yǎng)箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ELx800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；ARX-300型核磁共振儀、AV-600型核磁共振儀（德國(guó)Bruker公司）；API 2000型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）儀（美國(guó)Sciex公司）；FTIR6700型紅外光譜儀（美國(guó)Nicolet公司）；ZF-6型三用紫外線分析儀（上海嘉鵬科技有限公司）；SPD-20A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Eclipse Ts2型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）；DZF-2B型電熱真空干燥箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；V-100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、CCA-1111型冷卻水循環(huán)裝置（上海愛朗儀器有限公司）；RE-5210A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；SW-CJ-2F型潔凈工作臺(tái)（蘇州尚田潔凈技術(shù)有限公司）；Mikro 220R型冷凍離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；UPT-I-5T/L型優(yōu)普超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）；THZ-02型臺(tái)式恒溫振蕩器（中國(guó)科學(xué)院新疆分院科學(xué)儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

駱駝刺采自新疆吐魯番地區(qū)，經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所王果平研究員鑒定為豆科駱駝刺屬植物駱駝刺（A. sparsifolia Shap.）的地上部分。

5-氟尿嘧啶（5-FU）原料藥（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號(hào)：FA161012；臨用前以相應(yīng)培養(yǎng)基稀釋至0.25 g/10 mL）；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：L0T20170511-0135）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：TBD0110HYT）、0.25%胰蛋白酶（批號(hào)：L0T20170612-0085）、青霉素-鏈霉素雙抗（PS，批號(hào)：L0T20170310-0146）均購自天津?yàn)笕A科生物制品科技有限公司；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，美國(guó)Boster公司，批號(hào)：11D16B30，pH 7.2）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：1212U0516）；硅膠G薄層板、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）；RyC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司）；開放ODS色譜柱[100 mm×4.6 mm，15 μm，YMC（中國(guó)）公司]；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠色譜柱（80 cm×1.3 cm，40 μm，英國(guó)GE Healthcare Bio-Science AB公司）；HPD100大孔吸附樹脂（粒徑：0.3～1.25 mm，滄州寶恩化工有限公司）；甲醇為色譜純，石油醚、乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、硫酸、二甲基亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為去離子水。

1.3 細(xì)胞

人宮頸癌HeLa細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

2 方法

2.1 正丁醇萃取部位的提取、分離與純化

取干燥的駱駝刺地上部分9 kg，用70%乙醇以料液比1 ∶ 10（m/V，kg/L）于70 ℃加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓回收后得浸膏1 550 g。浸膏加水9 L分散，用正丁醇萃取3次，每次9 L，合并萃取液，于50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，即得正丁醇萃取部位260.0 g，得率為16.77%（按正丁醇萃取部位質(zhì)量與浸膏質(zhì)量之比計(jì)算）。取上述駱駝刺正丁醇萃取部位250 g，經(jīng)HPD100大孔吸附樹脂柱，以乙醇-水（100 ∶ 0～0 ∶ 100，V/V）梯度洗脫，洗脫液合并、濃縮，得30%乙醇洗脫部分浸膏120.0 g和90%乙醇洗脫部分浸膏75.0 g。取90%乙醇洗脫部分浸膏70.0 g，經(jīng)硅膠（100～200目）柱，以二氯甲烷-甲醇（100 ∶ 1、90 ∶ 1，V/V）梯度洗脫，經(jīng)薄層色譜鑒別后合并，得4個(gè)流份（Fr.1～Fr.4）。Fr.1經(jīng)開放ODS柱色譜，以甲醇-水（100 ∶ 1，V/V）洗脫，得Fr.1.1；對(duì)Fr.1.1進(jìn)行制備型高效液相色譜（色譜柱為RyC18）分離，得化合物Ⅰ（13.4 mg）和化合物Ⅱ（20.3 mg）。Fr.2經(jīng)開放ODS柱色譜，以甲醇-水（80 ∶ 1，V/V）洗脫，得Fr.2.2A和Fr.2.2B；對(duì)Fr.2.2A和Fr.2.2B進(jìn)行制備型高效液相色譜分離，分別得化合物Ⅲ（13.2 mg）和化合物Ⅳ（12.3 mg）。Fr.3經(jīng)開放ODS柱色譜，以甲醇-水（30 ∶ 1，V/V）洗脫，得Fr.3.3；對(duì)Fr.3.3進(jìn)行制備型高效液相色譜分離，得化合物Ⅴ（13.4 mg）。Fr.4經(jīng)開放ODS柱色譜，以甲醇-水（5 ∶ 1，V/V）洗脫，得化合物Ⅵ（13.2 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

結(jié)合熔點(diǎn)等理化性質(zhì)，采用質(zhì)譜（MS）、氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）、紅外（IR）等波譜手段對(duì)化合物Ⅰ～Ⅵ進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

2.3 抗HeLa細(xì)胞增殖活性單體的篩選

2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將HeLa細(xì)胞從液氮中取出，迅速置于37 ℃水浴鍋中解凍，取適量至離心管中，加入細(xì)胞培養(yǎng)液（含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，下同）3 mL，以1 000 r/min離心5 min后，棄去上清液，將沉淀重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL中，并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入細(xì)胞培養(yǎng)液5 mL，混勻，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；每2天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，備用[12-14]。

2.3.2 活性單體篩選 取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整至6×104個(gè)/mL，按100 μL/孔接種至96孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、5-FU組和各化合物組（各給藥組劑量均為6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL，劑量設(shè)置均參考文獻(xiàn)[15]），空白對(duì)照組給予等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，其余各給藥組給予相應(yīng)劑量的藥物（均以細(xì)胞培養(yǎng)液為溶劑）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液（以生理鹽水為溶劑，10 μL/孔）作用4 h，棄去上清液，加入DMSO適量（100 μL/孔），于搖床上振蕩5～10 min使完全混勻。使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞抑制率（E）[E=（1-各給藥組平均吸光度/空白對(duì)照組平均吸光度）×100%]，并推算半數(shù)抑制濃度（IC50，即當(dāng)存活細(xì)胞數(shù)減少一半時(shí)所需的藥物濃度[16]），以篩選活性較強(qiáng)（即IC50值相對(duì)較?。┑膯误w。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)/mL，按400 μL/孔接種至48孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜，用200 μL槍頭在細(xì)胞培養(yǎng)皿中均勻劃痕后，用PBS清洗3次，加入不含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)液（即不含F(xiàn)BS的DMEM高糖培養(yǎng)基，下同）后，立即使用倒置顯微鏡拍照（時(shí)間點(diǎn)為0 h）；隨后將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、5-FU組和“2.3”項(xiàng)下篩選所得活性較強(qiáng)化合物組（各給藥組劑量均為50 μg/mL，劑量設(shè)置參考本課題組前期研究成果[8]及“2.3.2”項(xiàng)下測(cè)算的IC50值），空白對(duì)照組給予等體積的不含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)液，其余各給藥組給予相應(yīng)劑量的藥物（均以不含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)液為溶劑）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24、48 h后，用倒置顯微鏡觀察劃痕愈合程度并拍照。與0 h相比，48 h時(shí)劃痕縫隙縮小的差值即為HeLa細(xì)胞的遷移距離[17-18]。上述試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)

取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞密度調(diào)整至1×105個(gè)/mL，按100 μL/孔接種至96孔板中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜后，將細(xì)胞隨機(jī)分為5-FU聯(lián)合“2.3”項(xiàng)下篩選所得活性較強(qiáng)化合物的不同劑量組[（3.125+6.25）、（6.25+12.5）、（12.5+25）、（25+50）μg/mL；劑量設(shè)置參考本課題組前期研究成果[8]），空白對(duì)照組給予等體積細(xì)胞培養(yǎng)液，其余各給藥組給予相應(yīng)劑量的藥物（均以細(xì)胞培養(yǎng)液為溶劑）。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，加入5 mg/mL的MTT溶液作用4 h，吸棄上清液，加入DMSO適量（100 μL/孔），于搖床上振蕩5～10 min使完全混勻[19]。按“2.3.2”項(xiàng)下方法檢測(cè)各孔吸光度并計(jì)算E，并采用金氏公式[20]評(píng)價(jià)藥物聯(lián)用效果：q=Ea+b/（Ea+Eb-Ea×Eb）（式中，“q”為增效指數(shù)；“Ea+b”為兩藥聯(lián)用抑制率；“Ea”“Eb”分別為各藥抑制率）；其中，0.85

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ：淡黃色針晶。分子式：C16O5H14，分子量：286，熔點(diǎn)（mp）：330～332 ℃。電子轟擊質(zhì)譜（EI-MS）：m/z 287[M+H]+。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：7.65（1H，d，J=8.4 Hz，H-5），6.98（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），6.82（1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-6′），6.80（1H，d，J=7.8 Hz，H-5′），6.51（1H，dd，J=2.4，8.4 Hz，H-6），6.36（1H，d，J=2.4 Hz，H-8），5.35（1H，dd，J=3.0，12.6 Hz，H-2），2.98（1H，dd，J=12.6，16.2 Hz，H-3b），2.65（1H，dd，J=2.4，16.2 Hz，H-3a）。13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：190.5（C-4），165.2（C-7），164.4（C-9），146.2（C-4′），145.9（C-3′），132.0（C-5），129.4（C-1′），119.2（C-6′），116.0（C-2′），115.2（C-5′），114.7（C-6），111.1（C-8），103.6（C-10），80.5（C-2），44.7（C-3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]基本一致，故確定該化合物為紫鉚素，其結(jié)構(gòu)式見圖1A。

化合物Ⅱ：淡褐色粉末。分子式：C15O5H8，分子量：268，mp：271～272 ℃。UV（甲醇）λmax：261、326 nm。EI-MS：m/z 269 [M+H]+。1HNMR（CD3OD，600 MHz）δ：6.83（1H，s，H-8），6.84（1H，dd，J=8.0，2.0 Hz，H-6′），6.84（1H，d，J=8.0 Hz，H-5′），6.94（1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H-6），7.01（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），8.06（1H，d，J=8.5 Hz，H-5），8.11（1H，s，H-2）。13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：103.2（C-8），116.3（C-6），116.4（C-5′），117.5（C-2′），118.2（C-10），121.7（C- 6′），124.8（C-1′），126.1（C-3），128.5（C-5），146.2（C-3′），146.7（C-4′），154.7（C-2），159.8（C-9），164.6（C-7），178.2（C-4）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]基本一致，故確定該化合物為3′，4′，7-三羥基異黃酮，其結(jié)構(gòu)式見圖1B。

化合物Ⅲ：淺黃色針狀結(jié)晶。分子式：C9O3H10，分子量：166，mp：85～87 ℃。EI-MS：m/z 167[M+H]+。1H- NMR（CD3OD，600 MHz）δ：3.56（2H，s，H-2），6.76（2H，dd，J=8.5，1.5 Hz，H-2′，6′），7.13（2H，dd，J=8.5，1.5 Hz，H-3′，5′），3.70（3H，s，4′-OCH3）。13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：172.7（C-1），40.2（C-2），115.5（C-1′），130.4（C-2′，6′），115.1（C-3′，5′），154.8（C-4′），52.1（4′-OCH3）。

以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]基本一致，故確定該化合物為對(duì)甲氧基苯乙酸，其結(jié)構(gòu)式見圖1C。

化合物Ⅳ：白色粉末。分子式：C8O2H8，分子量：136，mp：108～111 ℃。EI-MS：m/z 137 [M+H]+。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：7.89（2H，d，J=8.4 Hz，H-2，6），6.83（2H，d，J=8.4 Hz，H-3，5），2.52（3H，s，8-CH3）。13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：130.4（C-1），132.2（C-2，6），116.5（C-3，5），164.4（C-4），199.6（C-7），26.3（C-8）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]基本一致，故確定該化合物為4-羥基苯乙酮，其結(jié)構(gòu)式見圖1D。

化合物Ⅴ：白色針狀晶體。分子式：C27O4N2H28，分子量：444，mp：179～181 ℃。IR（CHCl3，KBr）λmax：3 313、 1 726、1 661、1 632、1 579、1 264、746、698 cm-1。EI-MS： m/z 445[M+H]+。1H-NMR（CDC13，600 MHz）δ：1.96（3H，s，4-CH3），2.75（1H，ddd，J=15.90，9.20，6.41 Hz，b′-H），3.07（1H，dd，J=10.26，16.42 Hz，b-H），3.22（1H，dd，J=5.99，16.42 Hz，c′-H），3.84（1H，dd，J=5.12，13.46 Hz，H-2），3，92（1H，dd，J=6.16，13.34 Hz，H-2′），4.35（1H，m，d-H），4.78（1H，ddd，J=7.19，10.26，9.23 Hz，c-H），6.03（1H，d，J=8.55 Hz，-N′H），6.73（1H，d，J=7.69 Hz，-NH），7.05（1H，m，f′-H），7.21（1H，m，f-H），7.30 （2H，m，H-k，k′），7.42（2H，t，J=7.27 Hz，H-j，j′），7.51（2H，d，J=7.27，1.21 Hz，H-g，g′），7.70（4H，dd，J=7.27，1.21 Hz，H-3′，3），8.01（2H，s，H-h，I）。13C-NMR（CDCl3，150 MHz）δ：20.77（C-3′），37.49（C-c′），49.51（C-2），55.03（C-2′），64.61（C-4），126.77（C-I），127.06（C-j，j′），127.17（C-b），128.61（C-k，k′），128.65（C-c，d），128.72（C-h，g），129.15（C-b′，g′），129.31（C-f′，f），131.91（C-1），133.75（C-i），136.67（C-a），136.72（C-e），167.11（C-m），170.25（C-1′），170.74（C-3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]基本一致，故確定該化合物為橙黃胡椒酰胺，其結(jié)構(gòu)式見圖1E。

化合物Ⅵ：無色針狀結(jié)晶。分子式：C7O3H6，分子量：138，mp：153～155 ℃。EI-MS：m/z 139 [M+H]+。1H-NMR（CD3OD，600 MHz）δ：9.68（1H，s，7-CHO），7.30（1H，m，H-6），7.28（1H，brs，H-2），6.90（1H，d，J=8.4 Hz，H-5）。13C-NMR（CD3OD，150 MHz）δ：193.1（C-7），153.7（C-4），147.2（C-3），130.8（C-1），126.4（C-6），116.2（C-5），115.3（C-2）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]基本一致，故確定該化合物為原兒茶醛，其結(jié)構(gòu)式見圖1F。

3.2 活性單體的篩選結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，5-FU和各化合物（5-FU：6.25～200 μg/mL各劑量，化合物Ⅰ：12.5～200 μg/mL各劑量，化合物Ⅱ：25、50、200 μg/mL，化合物Ⅲ：6.25、100、200 μg/mL，化合物Ⅳ：50、100、200 μg/mL，化合物Ⅴ：12.5、25、200 μg/mL，化合物Ⅵ：6.25～200 μg/mL各劑量）均可使細(xì)胞抑制率顯著升高，且5-FU以及化合物Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ的IC50值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。其中，化合物Ⅰ、Ⅵ的IC50值相對(duì)較低，提示兩者對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制活性更強(qiáng)，詳見表1。因此，選擇這2個(gè)化合物作為活性單體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，5-FU與化合物Ⅰ、Ⅵ組細(xì)胞的遷移距離均顯著縮小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見圖2、表2。

3.4 聯(lián)合用藥效果評(píng)價(jià)結(jié)果

不同劑量的5-FU與化合物Ⅰ、Ⅵ分別聯(lián)合作用48 h后，各組細(xì)胞的q值均大于0.9，即兩者聯(lián)用對(duì)HeLa細(xì)胞的增殖具有相加或增強(qiáng)的協(xié)同抑制作用，詳見表3。

4 討論

宮頸癌是臨床上最為常見的婦科惡性腫瘤。近年來，該病的發(fā)病率日益升高，且患者呈年輕化的趨勢(shì)[4，27]，故尋找有效的治療方法刻不容緩。本課題組前期研究結(jié)果顯示，駱駝刺正丁醇萃取部位具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性[8-11]。故本研究在此基礎(chǔ)上，以傳統(tǒng)的周期特異性抗腫瘤藥物5-FU作為陽性對(duì)照（對(duì)多種實(shí)體瘤如結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、膀胱癌等均具有一定的治療作用[28-29]），以人宮頸癌HeLa細(xì)胞為對(duì)象，在駱駝刺正丁醇萃取部位分離、純化的基礎(chǔ)上，對(duì)其抗腫瘤活性單體進(jìn)行篩選，以期為宮頸癌的早期診斷、治療以及延長(zhǎng)患者生存時(shí)間、提高患者生存質(zhì)量提供參考。

本研究采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜、ODS柱色譜、制備型高效液相色譜等技術(shù)對(duì)駱駝刺正丁醇萃取部位中的有效成分進(jìn)行分離和富集，結(jié)合其理化性質(zhì)以及MS、IR、核磁共振等波譜技術(shù)對(duì)化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，本研究共分離得到紫鉚素（Ⅰ）、3′，4′，7-三羥基異黃酮（Ⅱ）、對(duì)甲氧基苯乙酸（Ⅲ）、4-羥基苯乙酮（Ⅳ）、橙黃胡椒酰胺（Ⅴ）和原兒茶醛（Ⅵ）等6個(gè)化合物，且均為首次從該屬植物中分離得到，可為后續(xù)該屬植物的化學(xué)成分研究提供參考。本研究以5-FU為陽性對(duì)照，采用MTT法對(duì)上述6個(gè)化合物的體外抑制活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，5-FU和各化合物（5-FU：6.25～200 μg/mL各劑量，化合物Ⅰ：12.5～200 μg/mL各劑量，化合物Ⅱ：25、50、200 μg/mL，化合物Ⅲ：6.25、100、200 μg/mL，化合物Ⅳ：50、100、200 μg/mL，化合物Ⅴ：12.5、25、200 μg/mL，化合物Ⅵ：6.25～200 μg/mL各劑量）均可使細(xì)胞抑制率顯著升高，其中化合物Ⅰ、Ⅴ、Ⅵ的IC50值較空白對(duì)照組顯著降低，且化合物Ⅰ、Ⅵ的IC50值相對(duì)較低，提示其抑制活性更強(qiáng)，這也與本課題組前期研究結(jié)果[8]相吻合。

當(dāng)臨床診斷為原發(fā)腫瘤時(shí)，約有50%的患者已發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且大多數(shù)惡性腫瘤患者實(shí)質(zhì)上死于腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移及轉(zhuǎn)移所引發(fā)的復(fù)雜性病癥，可見腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致惡性腫瘤患者死亡的主要原因之一[18]。劃痕實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移能力的經(jīng)典方法：當(dāng)單層細(xì)胞長(zhǎng)滿時(shí)，人為制造一塊空白區(qū)域（即劃痕）后，處于其邊緣的細(xì)胞會(huì)向空白區(qū)域移動(dòng)，直至愈合，以此來考察受試藥物/化合物對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響[30]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，駱駝刺提取物對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞具有明顯的抑制作用，提示其可能具有開發(fā)為抗腫瘤藥物的潛質(zhì)，但關(guān)于其對(duì)宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用尚未見相關(guān)報(bào)道。故本研究以5-FU為陽性對(duì)照，采用劃痕實(shí)驗(yàn)考察活性單體（化合物Ⅰ、Ⅵ）對(duì)HeLa細(xì)胞遷移的抑制作用。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，5-FU與化合物Ⅰ、Ⅵ組細(xì)胞的遷移距離均顯著縮小，提示這2個(gè)化合物可抑制HeLa細(xì)胞的體外遷移。其中，化合物Ⅰ的抗腫瘤作用未見相關(guān)報(bào)道，化合物Ⅵ的抗腫瘤作用與文獻(xiàn)報(bào)道[30]基本一致。

聯(lián)合用藥是指兩種或兩種以上藥物同時(shí)或先后應(yīng)用，其主要目的是為了增強(qiáng)療效或減輕毒副作用，但有時(shí)也可能會(huì)產(chǎn)生相反的效果[31]。故本研究對(duì)5-FU與化合物Ⅰ、Ⅵ的聯(lián)用效果進(jìn)行了初探。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量5-FU分別與化合物Ⅰ、Ⅵ聯(lián)用后對(duì)HeLa細(xì)胞均具有相加或增強(qiáng)的抑制作用（q>0.9），提示兩者具有一定的協(xié)同效應(yīng)。同時(shí)，本研究在藥物劑量上選擇了更低的劑量（即5-FU 3.125 μg/mL+化合物Ⅰ或化合物Ⅵ 6.25 μg/mL），也得到了類似的結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了兩者的協(xié)同作用。

綜上所述，本研究從駱駝刺正丁醇萃取物中共分離得到了6個(gè)化合物，其中紫鉚素和原兒茶醛是其正丁醇萃取部位的活性單體。上述兩種單體均可抑制人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖與遷移，具有較強(qiáng)的體外細(xì)胞抑制作用，且與5-FU聯(lián)用后的抑制作用強(qiáng)于兩者分別單用。但本研究?jī)H從細(xì)胞水平初步探討了駱駝刺正丁醇萃取部位活性單體化合物對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用，故其具體機(jī)制仍需后續(xù)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 米克熱木·沙衣布扎提，蔣志惠，吾買爾江·牙合甫，等.傳統(tǒng)維藥駱駝刺刺糖有效成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材，2016，39（10）：2397-2399.

[ 2 ] 韓曾嬌.刺糖多糖對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7的免疫調(diào)節(jié)及信號(hào)通路的研究[D].烏魯木齊：新疆醫(yī)科大學(xué)，2017.

[ 3 ] 波拉提·馬卡比力，熊元君，賈曉光，等.駱駝刺糖中黃酮、異黃酮類化學(xué)成分研究[J].新疆中醫(yī)藥，2010，28（2）：53-55.

[ 4 ] 劉靜，余夢(mèng)紅，張叢敏，等.紫杉醇聯(lián)合洛鉑經(jīng)介入栓塞給藥化療宮頸癌的臨床觀察[J].中國(guó)藥房，2017，28（17）：2374-2377.

[ 5 ] LERTKHACHONSUK AA，YIP CH，KHUHAPREMA T，et al. Cancer prevention in Asia：resource-stratified guidelines from the Asian Oncology Summit 2013[J]. Lancet Oncol，2013，14（12）：e497-e507.

[ 6 ] MOHANTY G，GHOSH SK. Risk factors for cancer of cervix，status of screening and methods for its detection[J]. Arch Gynecol Obstet，2015，291（2）：247-249.

[ 7 ] 孫婧，金盧陽，王慧瑩，等.Eps8與惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2013，21（2）：493-497.

[ 8 ] 張貴杰，李寧，熊元君，等.駱駝刺的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44（12）：897-899.

[ 9 ] 馬曉玲，魏鴻雁，徐曉琴，等.駱駝刺提取物體內(nèi)外抗腫瘤作用及機(jī)制研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2015，27（3）：517-520.

[10] 馬曉玲，魏鴻雁，賈曉光，等.駱駝刺膠囊對(duì)大鼠長(zhǎng)期毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中藥藥理與臨床，2014，30（2）：113-115.

[11] 馬曉玲，徐建國(guó)，夏提古麗·阿不利孜，等.駱駝刺提取物對(duì)免疫抑制小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的作用[J].新疆醫(yī)學(xué)，2017，47（10）：1103-1105.

[12] FAN L，STRASSER-WEIPPL K，LI JJ，et al. Breast cancer in China[J]. Lancet Oncol，2014，15（7）：e279-e289.

[13] WU C，QIU S，LIU P，et al. Rhizoma amorphophalli inhibits TNBC cell proliferation，migration，invasion and metastasis through the PI3K/Akt/mTOR pathway[J]. J Ethnopharmacol，2018.DOI：10.1016/j.jep.2017.09.033.

[14] HE K，HE J，WANG S，et al. HSHIP induces S-phase arrest and growth inhibition in cervical cancer HeLa cells[J].J Genet Genomics，2010，37（4）：249-255.

[15] 徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：202-204.

[16] 劉庭波，李秀琴，王文峰，等.大黃素衍生物E11的篩選及對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡作用的研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2018，26（5）：1407-1413.

[17] QIONG MX，ZHAN S，WEN JH，et al. Antitumor activity of Pulsatilla chimensis（Bunge）Regel saponins in human liver tumor 7402 cells in vitro and in vivo[J]. Phytomedicine，2012，19（3/4）：293-300.

[18] 梁迎春.白頭翁皂苷單體抗腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移作用及其機(jī)制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[19] 鄧麗芬，王艷紅，賈慶安，等.索拉非尼聯(lián)合5-氟尿嘧啶對(duì)人肝癌細(xì)胞株MHCCLM3增殖的抑制作用及其機(jī)制[J].中華肝臟病雜志，2013，21（11）：845-849.

[20] 常明向，吳梅梅，李瀚旻.姜黃素與甘草次酸聯(lián)用對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用[J].藥物評(píng)價(jià)研究，2017，40（1）：42-47.

[21] 趙萍萍，霍仕霞，彭曉明，等.驅(qū)蟲斑鳩菊中紫鉚素、紫鉚花素的分離及其對(duì)人A375黑素瘤細(xì)胞黑素合成作用的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48（20）：1724-1727.

[22] 趙煥新，白虹，李巍，等.蘇木化學(xué)成分的研究[J].食品與藥品，2010，12（5）：176-180.

[23] 邵紅軍，房立真，劉吉開.西澳粘滑菇的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2010，22（5）：786-788.

[24] 石磊嶺，馬國(guó)需，楊峻山，等.天山假狼毒的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2016，47（2）：223-226.

[25] 湯俊，SUPINYA T，王崢濤，等.蜆殼花椒莖中的橙黃胡椒酰胺[J].中國(guó)藥學(xué)，2003，12（4）：231-233.

[26] 劉世杰.毛支清口服液的質(zhì)量控制、制備工藝及抗炎作用研究[D].北京：中央民族大學(xué)，2013.

[27] 張懷念，張?jiān)伬?宮頸癌分子遺傳機(jī)制及其相關(guān)基因功能研究[J].安徽醫(yī)藥，2015，19（2）：219-221.

[28] 李津.氨肽酶N抑制劑與5-FU及其衍生物聯(lián)合抗腫瘤活性研究[D].濟(jì)南：山東大學(xué)，2015.

[29] MUHAMMAD K. PD-L1單鏈抗體的篩選、抗體偶聯(lián)藥物的制備以及抗腫瘤活性的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2018.

[30] 李希哲，黃海燕，趙威，等.桂枝化合物的分離與鑒定及神經(jīng)保護(hù)作用[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，33（1）：14-19.

[31] 謝雁鳴，王連心，王永炎.臨床聯(lián)合用藥機(jī)制研究的探討[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（18）：3424-3426.

（收稿日期：2018-04-23 修回日期：2018-11-28）

（編輯：張?jiān)拢?/p>