知母皂苷B對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護作用及其機制研究

丁玲 胡毅 劉潔 安瑞娣 張作文

中圖分類號 R285.5 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）04-0488-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.04.12

摘 要 目的：探討知母皂苷B對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護作用及其可能機制。方法：原代新生SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)、鑒定后，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（尼莫地平，10 μmol/L）以及知母皂苷B低、中、高劑量組（1、10、100 μmol/L）。正常組和模型組均給予完全培養(yǎng)基1 000 μL，給藥組給予含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 000 μL。除正常組外，其余各組細(xì)胞均采用氧糖剝奪/再灌注法復(fù)制缺氧/復(fù)氧損傷模型。復(fù)氧后，采用比色法檢測細(xì)胞中乳酸脫氫酶（LDH）的相對釋放率；采用四甲基偶氮唑鹽法檢測細(xì)胞相對活力；采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測細(xì)胞中水通道蛋白4（AQP-4）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量。結(jié)果：與正常組比較，模型組細(xì)胞中LDH相對釋放率以及AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均顯著升高，細(xì)胞相對活力顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組細(xì)胞中LDH相對釋放率以及AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均顯著下降，細(xì)胞相對活力均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：知母皂苷B可明顯降低細(xì)胞損傷程度、增強細(xì)胞活力，對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的保護作用，且這種作用可能與其下調(diào)AQP-4和IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞 知母皂苷B；星形膠質(zhì)細(xì)胞；缺氧/復(fù)氧損傷；乳酸脫氫酶；水通道蛋白4；白細(xì)胞介素6；白細(xì)胞介素1β；腫瘤壞死因子α

ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the protective effects of anemarsaponin B on hypoxia/reoxygenation injury astrocytes and its possible mechanism. METHODS： The primary astrocytes of neonatal SD rats were cultured and identified， and then randomly divided into normal group， model group， positive control group （nimodipine， 10 μmol/L）， anemarsaponin B low-dose， medium-dose and high-dose groups （1， 10， 100 μmol/L）， respectively. Normal group and model group were given complete medium 1 000 μL. Administration group was given complete medium with relevant medicine 1 000 μL. Except for normal group， hypoxia/reoxygenation injury model was established by oxygen-glucose deprivation/reperfusion in other groups. After reoxygenation， relative release rate of lactate dehydrogenase （LDH） in cell was detected by colorimetry. MTT assay was used to detect the relative viability of the cells. The contents of aquaporin 4 （AQP-4）， IL-6， IL-1β and TNF-α in cell were measured by ELISA. RESULTS： Compared with normal group， relative release rate of LDH， the contents of AQP-4， IL-6， IL-1β and TNF-α in cell were increased significantly in model group， while relative viability of the cells were decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， relative release rate of LDH， the contents of AQP-4， IL-6， IL-1β and TNF-α in cell were decreased significantly in administration groups， while relative viability of the cells were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Anemarsaponin B can significantly decrease cell injury degree， strengthen cell viability and protect hypoxia/reoxygenation injury astrocytes to certain extent. The effect may be related to the down-regulation of the secretion of AQP-4， IL-6， IL-1β and TNF-α.

KEYWORDS Anemarsaponin B； Astrocytes； Hypoxia/reoxygenation injury； Lactate dehydrogenase； Aquaporin 4； IL-6； IL-1β； TNF-α

腦卒中分為出血性卒中（占20%）和缺血性卒中（占80%），嚴(yán)重威脅人類的健康。腦水腫作為腦卒中的主要并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致患者殘疾甚至死亡的主要原因[1-3]。針對腦水腫，臨床上大多采用手術(shù)清除、脫水等治療方法，但療效有限[4]。故尋找有效治療腦水腫的方法成為了目前研究的熱點之一。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中，星形膠質(zhì)細(xì)胞作為數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，具有抗氧化應(yīng)激、合成神經(jīng)遞質(zhì)等多種重要功能，可作為治療中樞性疾病的靶點[5]。水通道蛋白4（AQP-4）是由星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)，其表達(dá)水平可影響細(xì)胞中水分的含量，與腦水腫的發(fā)生密切相關(guān)[6-9]；同時有研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生腦缺血/再灌注損傷后，大腦組織（主要為星形膠質(zhì)細(xì)胞）產(chǎn)生的大量炎癥因子[如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等]可影響腦水腫的形成與發(fā)展[10-11]，并可促使AQP-4過表達(dá)，進一步加重腦水腫[12]。由此可見，AQP-4及相關(guān)炎癥因子可能在腦水腫的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

知母皂苷是百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）干燥根莖的主要成分。其中，知母皂苷B為主要活性成分，具有抑制自由基生成、修復(fù)神經(jīng)元損傷等藥理作用，具有很大的開發(fā)價值[13]。為此，本課題組以缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞為對象，通過檢測知母皂苷B對其AQP-4及IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響，初步探索知母皂苷B對缺氧/復(fù)氧神經(jīng)細(xì)胞的保護作用，以期為腦缺血/再灌注損傷提供治療新策略。

1 材料

1.1 儀器

Heal Force型細(xì)胞培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；HEPA Class 100型缺氧培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CKX41型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；TGL-16G型高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）；Synergy 2型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）；TXT3型細(xì)胞離心機（北京汗盟紫星儀器儀表有限公司）；NRV-200型搖床（上海南榮實驗室設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

知母皂苷B原料藥（上海信裕生物科技有限公司，批號：20160926，純度：>98%）；尼莫地平注射液（青島金峰制藥有限公司，批號：20170105，規(guī)格：50 mL ∶ 10 mg）；四甲基偶氮鹽（MTT）試劑（鄭州派尼化學(xué)試劑廠，批號：161201）；0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Sigma公司，pH為7.4，批號分別為h0032、h0012）；DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibico公司，批號：h0010）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：HB0204）；乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒和AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號依次為：A1003、A0101、A0104、A0106、A0107）；兔抗小鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）一抗、經(jīng)異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗（美國Abcam公司，批號分別為ab7261、ab150078）；4′，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI）染料（江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C1005）；含糖Earle’s平衡鹽溶液（EBSS）、不含糖EBSS（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，pH分別為7.4、7.3，批號依次為：20160719、20160712）；二甲亞砜（DMSO）等試劑均為分析純，水為純凈水。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠，新生48 h內(nèi)，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2012- 0001]。

2 方法

2.1 原代新生SD大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、純化、傳代

2.1.1 原代培養(yǎng) 按照文獻[14]方法進行原代培養(yǎng)。選擇新生48 h內(nèi)的乳鼠，斷頭、取腦，剝離海馬體、腦膜，得大腦皮層，用PBS清洗后，置于干凈培養(yǎng)皿中，剪碎，加入2～3倍體積的0.25%胰蛋白酶，于37 ℃下消化15 min后，用等體積完全培養(yǎng)基（即含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，下同）終止反應(yīng)；過200目篩，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，沉淀以適量完全培養(yǎng)基重懸，經(jīng)吹打、分散后，得單細(xì)胞懸液。用適量完全培養(yǎng)基重懸上述單細(xì)胞懸液，按約2×106個/mL的密度接種于玻璃培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于接種后的1～2 d更換培養(yǎng)基，隨后每周更換2次，并每天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.1.2 細(xì)胞純化 待細(xì)胞長滿至融合（約接種后7～10 d），將其置于搖床中，于37 ℃下以250 r/min振蕩24 h；棄去上清液，用0.25%胰蛋白酶消化，以1 000 r/min離心5 min；棄去上清液，沉淀用適量完全培養(yǎng)基重懸后，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。為提高細(xì)胞的純度，可待細(xì)胞再次融合時，重復(fù)上述操作。

2.1.3 細(xì)胞傳代 取培養(yǎng)14 d左右的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化直至細(xì)胞間隙增加；用完全培養(yǎng)基終止消化，并搖動、吹打細(xì)胞懸液，分別將其接種至另外2個培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每天用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，視情況添加、補充、更換培養(yǎng)基，并最終選用純度較高的第二代星形膠質(zhì)細(xì)胞進行后續(xù)試驗。

2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定

將“2.1”項下經(jīng)傳代、純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞以5×104個/mL的密度接種至24孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，進行標(biāo)志蛋白GFAP染色，使用免疫熒光法進行鑒定。將細(xì)胞置于4%多聚甲醛中固定15 min，以胎牛血清封閉2 h后，加入GFAP一抗（1 ∶ 100），于4 ℃反應(yīng)24 h后，用PBS反復(fù)沖洗4次，每次15 s；隨后加入經(jīng)FITC標(biāo)記的相應(yīng)二抗（1 ∶ 100），于37 ℃下避光反應(yīng)1 h，用DAPI染料60 μL染核3 min后，以中性樹脂封片，于顯微鏡下觀察并拍照，觀察細(xì)胞的形態(tài)與分布[GFAP染色陽性（即發(fā)出綠色熒光），且細(xì)胞扁平，可見突起]。

2.3 分組、給藥和造模

取對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×104個/mL的密度接種至24孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組（尼莫地平10 μmol/L）和知母皂苷B低、中、高劑量組（1、10、100 μmol/L），各給藥組劑量均參照本課題組前期預(yù)試驗結(jié)果。每組設(shè)置9個復(fù)孔。正常組和模型組細(xì)胞均加入不含藥物的完全培養(yǎng)基1 000 μL，各給藥組加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基1 000 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。正常組細(xì)胞加入含糖EBSS 400 μL，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，隨后更換為完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。其余各組細(xì)胞均采用氧糖剝奪/再灌注法復(fù)制缺氧/復(fù)氧損傷模型：先加入不含糖EBSS 400 μL，于37 ℃、94%N2、5%CO2、1%O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，進行缺氧處置；隨后更換為完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進行復(fù)氧恢復(fù)。

2.4 知母皂苷B對細(xì)胞損傷的影響考察

按“2.3”項下方法分組、給藥并復(fù)制缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞模型。復(fù)氧后，取各組細(xì)胞培養(yǎng)液20 μL，采用比色法以酶標(biāo)儀檢測其LDH漏出率，并計算各組LDH相對釋放率以評價細(xì)胞損傷程度（LDH相對釋放率=給藥組或模型組細(xì)胞的LDH漏出量/正常組細(xì)胞的LDH漏出量×100%）。上述試驗重復(fù)3次。

2.5 知母皂苷B對細(xì)胞活力的影響考察

按“2.3”項下方法分組、給藥，并復(fù)制缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞模型。復(fù)氧后，各組細(xì)胞均加入MTT試劑（15 μL/孔），于37 ℃下培養(yǎng)4 h，棄去上清液，加入DMSO（150 μL/孔），于37 ℃下振蕩10 min，采用酶標(biāo)儀于570 nm波長處檢測各孔的光密度（OD）值，并計算相對細(xì)胞活力（細(xì)胞相對活力=給藥組或模型組細(xì)胞的平均OD值/正常組細(xì)胞的平均OD值×100%）。上述試驗重復(fù)3次。

2.6 知母皂苷B對細(xì)胞中相關(guān)指標(biāo)含量的影響考察

按“2.3”項下方法分組、給藥，并復(fù)制缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞模型。復(fù)氧后，取各組細(xì)胞培養(yǎng)液適量，采用ELISA法以酶標(biāo)儀于450 nm波長處測定各孔的OD值，并計算其中AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書操作。上述試驗重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞鑒定結(jié)果

成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體飽滿、體形較大，胞質(zhì)、突起清晰，胞核呈空泡狀（見圖1A）；經(jīng)DAPI染色后，胞核呈橢圓形、間隔均勻，胞質(zhì)、突起、胞核清晰（見圖1B）；將圖1A、圖1B進行實時疊合后，可見細(xì)胞形態(tài)和分布均符合星形膠質(zhì)細(xì)胞特征，且兩者完全重合，提示其為星形膠質(zhì)細(xì)胞，且純度較高（見圖1C）。

3.2 知母皂苷B對細(xì)胞損傷的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞中的LDH相對釋放率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，知母皂苷B各劑量組和陽性對照組細(xì)胞中的LDH相對釋放率均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.3 知母皂苷B對細(xì)胞活力的影響

與正常組比較，模型組的細(xì)胞相對活力顯著減弱，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，知母皂苷B各劑量組和陽性對照組的細(xì)胞相對活力均顯著增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表1。

3.4 知母皂苷B對AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α含量的影響

與正常組比較，模型組細(xì)胞中AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；與模型組比較，知母皂苷B各劑量組和陽性對照組細(xì)胞中AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），詳見表2。

4 討論

在腦缺血/再灌注損傷的進展后期，作為其必然結(jié)局的腦水腫不僅可導(dǎo)致患者神經(jīng)功能嚴(yán)重缺失，還可明顯增高其顱內(nèi)壓，進一步加重腦水腫，從而形成一個不斷反復(fù)加重的惡性循環(huán)[15]。LDH是一種主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的重要的細(xì)胞內(nèi)酶，當(dāng)細(xì)胞膜受到損傷時，LDH立即迅速地向細(xì)胞外泄漏，并釋放到培養(yǎng)基中。由于釋放出來的LDH穩(wěn)定且敏感，故其釋放程度的高低可作為衡量細(xì)胞損傷程度的重要指標(biāo)[16]。AQP-4作為腦組織中最重要的AQP，在腦水腫的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[6-9，17]。該蛋白可控制水分進出腦組織的通道，以維持腦組織的水平衡、炎癥因子及星形膠質(zhì)細(xì)胞的正常遷移等[18]。AQP-4與腦水腫關(guān)系密切，其參與了多種疾病致腦水腫的病理過程[19]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞是體形最大、數(shù)量最多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，其不僅對維持大腦正常功能具有重要的支持和調(diào)節(jié)作用，還對缺血大腦具有一定的保護作用，且在眾多神經(jīng)細(xì)胞中，只有星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌、表達(dá)AQP-4[5]。有研究指出，腦缺血卒中可能會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β、TNF-α等一系列炎癥因子，這些炎癥因子的大量分泌可增加血腦屏障的通透性，并促進自由基釋放，從而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損等毒性反應(yīng)的發(fā)生[20]。其中，TNF-α作為炎癥的“始動因子”，可激活多核白細(xì)胞，從而進一步促進多種炎癥因子的釋放以激發(fā)炎癥反應(yīng)，參與誘發(fā)腦水腫；同時，TNF-α可加重細(xì)胞損傷，并可調(diào)控早期炎癥因子（IL-6、IL-1β等）的表達(dá)，以“瀑布式過度炎癥級聯(lián)反應(yīng)”的方式破壞血腦屏障、加重腦水腫[21]。由此可見，AQP-4和IL-6、IL-1β、TNF-α在腦水腫發(fā)生發(fā)展的病理進程中均具有一定的調(diào)節(jié)作用，可作為相關(guān)研究的考察指標(biāo)。

傳統(tǒng)中藥知母的活性成分知母皂苷B具有抗炎、解熱、抗病毒等諸多藥理活性[13，22]。雖然也有研究證明知母皂苷對腦缺血/再灌注損傷具有一定的保護作用[23]，但涉及機制的研究卻甚少，且尚未見其對星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響及作用機制的相關(guān)研究。尼莫地平對預(yù)防和治療腦缺血/再灌注損傷具有很好的效果，是腦缺血/再灌注基礎(chǔ)研究中的經(jīng)典陽性藥物[24]。為此，本研究在已有文獻報道的基礎(chǔ)上，以尼莫地平為陽性對照，初步探討了知母皂苷B對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護作用及其可能機制。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組細(xì)胞中的LDH相對釋放率以及AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均顯著升高，細(xì)胞的相對活力顯著降低。這提示星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生了缺氧/復(fù)氧損傷，模型復(fù)制成功。與模型組比較，知母皂苷B各劑量組和陽性對照組細(xì)胞中的LDH相對釋放率以及AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量均顯著降低，細(xì)胞的相對活力均顯著升高。這提示細(xì)胞損傷減弱，且AQP-4、IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌受到明顯抑制，表明知母皂苷B對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的保護作用，與本課題組前期在體研究結(jié)果[25]基本一致。筆者分析其機制可能為：知母皂苷B通過抑制缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥始動因子TNF-α的表達(dá)，從而延緩了炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生；同時，其通過反饋性下調(diào)AQP-4的表達(dá)，進一步減輕了腦水腫的癥狀。

綜上所述，知母皂苷B可明顯降低細(xì)胞損傷程度、增強細(xì)胞活力，對缺氧/復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞具有一定的保護作用，且這種作用可能與其下調(diào)AQP-4和IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌有關(guān)。但本研究仍然存在如下不足之處：（1）一般而言，應(yīng)在離體研究的基礎(chǔ)上進行在體研究，而本課題組前期先進行了在體研究，后續(xù)為排除實驗動物個體差異等眾多干擾因素的影響，再針對星形膠質(zhì)細(xì)胞進行的離體研究；（2）除AQP-4外，分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞連接終足上的縫隙連接蛋白43（Cx43）對血腦屏障的內(nèi)環(huán)境及穩(wěn)定性也具有重要意義[26]，而本研究并未對該蛋白進行相關(guān)考察，故仍有待后續(xù)研究進一步完善。

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（收稿日期：2018-09-17 修回日期：2018-12-04）

（編輯：張元媛）