人參皂苷Rb1對肥胖小鼠骨骼肌胰島素抵抗及AMPK信號通路的影響

趙丹丹　白穎　吳瑞　莫芳芳　方心　田甜　馬如風　柳辰玥　朱如愿　高思華

摘要?目的：觀察人參皂苷Rb1對肥胖模型小鼠體質(zhì)量、體成分、血脂、骨骼肌耐力及胰島素敏感性等指標的影響，研究其藥理作用;并進一步探討其對骨骼肌AMPK信號通路的影響。方法：選取8周齡C57BL/6J小鼠高脂喂養(yǎng)12周誘導(dǎo)肥胖模型，將成模小鼠隨機分為模型對照組，二甲雙胍組，人參皂苷Rb1組，以正常飼料喂養(yǎng)的小鼠作為正常對照，給藥干預(yù)8周。每周定期檢測小鼠體質(zhì)量、攝食量;第3和7周行小鼠跑臺實驗;第4和8周行口服葡萄糖耐量實驗;第8周用磁共振成像清醒動物體成分分析儀檢測小鼠體成分;實驗結(jié)束后取材，檢測血脂4項及游離脂肪酸水平，實時熒光定量PCR檢測骨骼肌組織單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）α及過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1（PGC-1）α的mRNA水平，免疫印跡法檢測脂肪組織AMPKα、p-AMPKα，PGC-1α蛋白的表達。結(jié)果：人參皂苷Rb1組小鼠體質(zhì)量（自給藥第5周起）、攝食量均明顯低于模型對照組小鼠（P<0.05），有一定的時效關(guān)系。人參皂苷Rb1可顯著降低三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇，提高高密度脂蛋白膽固醇的水平，并降低血清游離脂肪酸水平（P<0.05）。人參皂苷給藥8周可降低肥胖小鼠體脂肪含量，并增加筋肌含量（P<0.05），增加小鼠骨骼肌運動耐力（P<0.05），改善其口服糖耐量。人參皂苷Rb1能上調(diào)肥胖小鼠骨骼肌組織AMPKαmRNA及蛋白表達，且p-AMPKα蛋白表達亦明顯增加（P<0.05），同時提高肥胖小鼠骨骼肌組織PGC-1α的mRNA及蛋白表達（P<0.05）。結(jié)論：人參皂苷Rb1能通過激活骨骼肌AMPK信號通路相關(guān)蛋白，達到減輕肥胖小鼠體質(zhì)量，降低血脂水平，提高骨骼肌耐力，并增加其胰島素敏感性的作用。

關(guān)鍵詞?人參皂苷Rb1;肥胖;骨骼肌;胰島素抵抗;AMPK信號通路

Effects of Ginsenoside Rb1 on Insulin Resistance and AMPK Signal Pathway of Muscular Tissues of Obese Mice

Zhao Dandan1，Bai Ying1，Wu Rui2，Mo FangFang1，F(xiàn)ang Xin3，Tian Tian1，Ma Rufeng1，Liu Chenyue1，Zhu Ruyuan1，Gao Sihua1

（1 Traditional Chinese Medicine School，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2 Department of Endocrinology，South Area of Guang′anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 102618，China; 3 Department of Endocrinology，Third Affiliated Hospital of Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract?Objective：To observe the effects of ginsenoside Rb1 on body weight，body composition，blood lipid，skeletal muscle endurance and insulin sensitivity in obese mice，and further explore its effects on AMPK signaling pathway in skeletal muscle.Methods：8-week-old C57BL/6J mice were fed with high fat diet for 12 weeks to induce obese mice model.The obese mice were randomly divided into three groups（the model control group，the metformin group and the ginsenoside Rb1 group）.The peer mice fed with normal diet was set as the normal control.The mice were administrated with corresponding drugs for 8 weeks.Body weight and food intake of the mice were measured regularly every week.Treadmill test was performed on the 3rd and 7th week，and the oral glucose tolerance test was conducted on the 4th and 8th week.Body composition of the mice was detected by NMR Animal Body Composition Analyzer on the 8th week.Four indexes of plasma lipids and free fatty acid levels were detected at the end of the study.The mRNA expressions of AMPKα and PGC-1α in skeletal muscle were examined by real-time fluorescence quantitative PCR（FQ-PCR），and the protein expression of AMPKα，p-AMPKα and PGC-1α were detected by Western blot.Results：The body weight（since the 5th week）and food intake of the mice in the ginsenoside Rb1 group were significantly lower than those in the model control group（P<0.05）in a relatively time-dependent manner.Ginsenoside Rb1 could significantly reduce the levels of triglyceride and low density lipoprotein cholesterol，while increase that of high density lipoprotein cholesterol（P<0.05）.In addition，ginsenoside Rb1 reduced serum free fatty acid levels（P<0.05）.After the administration of ginsenoside Rb1 for 8 weeks，the body fat mass of obese mice was decreased and the lean mass was increased，oppositely（P<0.05）.The skeletal muscle endurance（P<0.05）and the oral glucose tolerance of the obese mice were improved by ginsenoside Rb1.At the molecular level，ginsenoside Rb1 could up-regulate the mRNA and protein expression of AMPKα in skeletal muscles，and the content of p-AMPK protein was also increased significantly（P<0.05）.At the same time，the mRNA and protein expression level of PGC-1α were also up-regulated，correspondingly（P<0.01）.Conclusion：Ginsenoside Rb1 exerts effects on reducing body weight，decreasing blood lipid levels，improving skeletal muscle endurance and insulin sensitivity in obese mice by activating AMPK signaling pathway in skeletal muscles.

Key Words?Ginsenoside Rb1; Obesity; Muscle tissues; Insulin resistance; AMPK signal pathway

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.013

胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）是指胰島素維持正常血糖的作用下降，其產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)低于正常水平，或肝臟、肌肉和脂肪組織等周圍靶組織細胞對胰島素的反應(yīng)性下降而導(dǎo)致葡萄糖攝取和利用效率下降而產(chǎn)生的一系列臨床表現(xiàn)，是2型糖尿?。═2DM）的重要發(fā)病機制之一。研究表明T2DM患者中80%伴有肥胖，病理改變以肥胖引起脂代謝紊亂，誘發(fā)IR為特點[1]。其中骨骼肌作為胰島素作用的主要靶位，負責餐后狀態(tài)80%以上的葡萄糖代謝[2]，而單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）是骨骼肌細胞代謝調(diào)控的主要激酶，參與調(diào)節(jié)葡萄糖攝取等代謝相關(guān)的多種代謝通路[3]。

人參皂苷Rb1是人參二醇系皂苷的代表成分之一，主要分布于人參、三七、西洋參等傳統(tǒng)中藥中，臨床應(yīng)用較為廣泛，用于糖尿病，冠心病、腫瘤等多種疾病的治療。藥理研究顯示人參皂苷Rb1具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和抗腫瘤等多種藥理作用[4]，但對人參皂苷Rb1在降低血糖及調(diào)節(jié)IR方面，尤其是骨骼肌能量調(diào)節(jié)方面的報道較少。因此，本研究擬觀察人參皂苷Rb1對肥胖小鼠體成分、血脂、糖耐量及AMPK信號通路等的影響，為進一步闡明人參用于糖尿病及其并發(fā)癥的治療提供科學(xué)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物

選取8周齡雄性C57BL/6J小鼠，購自北京斯貝福生物科技股份有限公司（許可證號SCXK（京）2014-0004），飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動物實驗室。小鼠均單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)處于12 h/12 h光暗周期，控制23 ℃恒溫、45%相對濕度，飼養(yǎng)期間小鼠自由進食水。普通飼料采用AIN-96G全價營養(yǎng)飼料，高脂純化飼料均由江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司提供。

1.1.2?藥物

人參皂苷Rb1購自于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司），均4 ℃條件保存。灌胃前用超純水配制成所需濃度混懸液。

1.1.3?試劑與儀器

血脂試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品;FFA試劑盒由北京百諾威有限責任公司提供。全自動生化分析儀為日立7080型。磁共振成像（NMR）小動物體成分分析儀為上海紐邁電子科技有限公司生產(chǎn)。單磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）α、磷酸化單磷酸腺苷活化蛋白激酶（p-AMPKα）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1（PGC-1）α、GAPDH一抗（均購自于CST公司，美國）;辣根過氧化物酶標記二抗（美國GBI公司）。

2?方法

選取8周齡雄性C57/6J小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機抽出10只為正常對照組，余下40只予以高脂飼料喂飼12周后，以體質(zhì)量大于正常對照組平均體質(zhì)量的20%作為肥胖小鼠成模標準。將模型制備成功的肥胖小鼠隨機分成模型對照組、二甲雙胍組、人參皂苷Rb1組，每組8只。

1.2.2?給藥方法

連續(xù)灌胃給藥8周，人參皂苷Rb1組：20 mg/（kg·d），二甲雙胍組：75 mg/（kg·d），體積為0.1 mL/10 g體質(zhì)量，正常對照組和模型對照組灌胃等體積滅菌水。

1.2.3?檢測指標與方法

體成分檢測：藥物干預(yù)8周時，分別對應(yīng)用NMR清醒動物體成分分析儀對各組小鼠進行體成分檢測，記錄體脂含量及體筋肌含量。

口服糖耐量實驗：藥物干預(yù)第4周、8周行口服糖耐量實驗。實驗前小鼠禁食過夜，50%葡萄糖按2 g/kg體質(zhì)量腹腔注射，測定注射前（0 min）及注射后30 min、60 min和120 min小鼠血糖，繪制OGTT時間曲線圖，并采用近似梯形方法計算曲線下面積（AUC），計算公式如下：AUC=0.5×（BG0 min+BG30 min）/2+0.5×（BG30 min+BG60 min）/2+1×（BG60 min+BG120 min）/2。

小鼠跑臺實驗力竭時間測定：在灌胃第3周和第7周，各組小鼠進行為期6 d的跑臺適應(yīng)訓(xùn)練，然后進行正式測試，記錄每只動物每天的力竭時間。力竭速度為20 m/min，跑臺坡度為5°，力竭標準為小鼠連續(xù)掉落電網(wǎng)被電擊，始終處于跑道后1/3段，靜息呈腹臥位，呼吸急促，無法完成跑臺任務(wù)。記錄力竭時間。

血脂水平及游離脂肪酸檢測：給藥8周后禁食過夜，次日早晨麻醉動物，腹主動脈取血，離心后分離血清，用生化儀進行三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的測定。并按照試劑盒說明書檢測血清標本中游離脂肪酸（FFA）水平。

肌組織取材：動物麻醉后，暴露大鼠后肢骨骼肌，剪取兩側(cè)腓腸肌為骨骼肌材料，用生理鹽水清洗骨骼肌，用于后續(xù)分子生物學(xué)指標檢測（80 ℃凍存）。

時熒光定量PCR檢測：應(yīng)用Trizol法提取骨骼肌組織總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作將總RNA轉(zhuǎn)錄成單鏈cDNA，進一步以SYBR MIX（10 μL）+cDNA模板（2 μL）+上/下游引物（各1 μL）+無核酸酶超純水（6 μL）的反應(yīng)體系，上熒光定量PCR儀進行擴增反應(yīng)，95 ℃預(yù)變性2 min，繼以95 ℃變性20 s，退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此反復(fù)40個循環(huán)后，結(jié)束后4 ℃保存。每個樣品設(shè)立3個復(fù)孔重復(fù)。AMPK上游引物AAACCCACAGAAATCCAAACAC，下游引物CCTTCCATTCATAGTCCAACTG;PGC-1α上游引物CCCTGCCATTGTTAAGACC，下游引物TGCTGCTGTTCCTGCTCCT。

Western-Blot方法檢測：剪取骨骼肌組織塊，加入預(yù)冷的含1%PMSF的RIPA裂解液低溫裂解，離心，提取總蛋白，按BCA試劑盒說明進行蛋白含量測定，配制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠、濃縮膠，進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別將聚偏氟乙烯膜用稀釋好的AMPKα，p-AMPKα，PGC-1α（1∶1 000，5%脫脂奶粉稀釋）進行孵育，4 ℃搖蕩過夜，再用熒光二抗（1∶5 000稀釋）室溫孵育1.5 h。電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色，凝膠成像儀曝光成像。ImageJ軟件分析條帶灰度，并進行半定量分析處理。使用GraphPadPrism6軟件進行數(shù)據(jù)管理并制圖。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料以（±s）表示，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett法或獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?對肥胖小鼠的體質(zhì)量和攝食量的影響

人參皂苷Rb1干預(yù)后，自給藥后第5周開始小鼠體質(zhì)量與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。整個實驗過程中模型對照組小鼠體質(zhì)量平均增加了9.50 g，顯著高于正常對照組（1.40 g），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。二甲雙胍組小鼠體質(zhì)量減輕了0.63 g，人參皂苷Rb1小鼠體質(zhì)量增加了1.04 g，二者與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。模型對照組的小鼠攝食量顯著高于正常對照組小鼠（P<0.05）。與模型對照對照比較，二甲雙胍組（自第6周起）及人參皂苷Rb1組（從第1周起）小鼠攝食量與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1A～C。

2.2?對肥胖小鼠總脂肪、筋肌組織含量的影響

各高脂飼料喂養(yǎng)小鼠筋肌組織含量則顯著低于正常對照組，體脂含量均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。藥物干預(yù)8周后，二甲雙胍組、人參皂苷Rb1組體脂含量分別為19.50%，20.91%，較模型對照組（30.46%）明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。體筋肌含量分別為72.64%，72.61%，顯著高于模型對照組（60.02%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖2A～B。

2.3?調(diào)節(jié)肥胖小鼠血脂水平及游離脂肪酸水平

模型對照組小鼠血脂水平異常，表現(xiàn)為TC、TG、LDL-C水平升高，HDL-C水平降低，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），藥物干預(yù)8周后，人參皂苷Rb1能夠顯著降低TG、LDL-C水平，增加血清HDL-C水平，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與正常對照組小鼠比較，模型對照組小鼠FFA水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。藥物干預(yù)8周后，二甲雙胍及人參皂苷Rb1均能夠顯著降低肥胖小鼠FFA水平，與模型對照組比較均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖3A～E。

2.4?改善肥胖小鼠胰島素敏感性

模型對照組小鼠各時間點血糖及曲線下面積明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。給藥4周時，二甲雙胍組在30 min和60 min時間點能明顯降低小鼠血糖水平，其曲線下面積亦顯著低于模型對照組，而人參皂苷Rb1對肥胖小鼠OGTT各時間點及曲線下面積影響均不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。給藥第8周時，人參皂苷Rb1能顯著降低小鼠糖負荷后血糖水平，并顯著減少GTT曲線下面積，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

2.5?提高小鼠運動耐力

模型對照組小鼠在第3和第7周的較同期正常對照組小鼠的力竭時間顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型對照組比較，二甲雙胍及人參皂苷Rb1組小鼠力竭時間均延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖5。

2.6?對小鼠骨骼肌AMPKα，p-AMPKα，PGC-1α基因表達的影響

肥胖小鼠骨骼肌AMPKα、PGC-1α表達均下調(diào);與模型對照組比較，二甲雙胍組與人參皂苷Rb1組大鼠骨骼肌AMPKα和PGC-1α mRNA的表達則明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖6。

2.7?對小鼠骨骼肌AMPKα，p-AMPKα，PGC-1α蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型對照組小鼠骨骼肌AMPKα、p-AMPKα，PGC-1α蛋白表達量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與模型對照組比較，二甲雙胍組與人參皂苷Rb1組大鼠骨骼肌AMPKα、p-AMPKα，PGC-1α蛋白表達量均顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖7。

3?討論

IR為機體對正常劑量的胰島素產(chǎn)生低于正常生物學(xué)效應(yīng)的一種狀態(tài)。從量化的角度看，骨骼肌是體內(nèi)利用血糖最重要的組織，是周圍IR的主要靶位，解決骨骼IR的問題對于改善肥胖、糖尿病等個體的代謝狀態(tài)非常關(guān)鍵[5]。本研究顯示高脂飼料喂養(yǎng)小鼠12周后，與普通飼料喂養(yǎng)的小鼠比較，形態(tài)學(xué)方面表現(xiàn)為肥胖，體質(zhì)分析顯示中脂肪成分含量增多，存在明顯的IR，高脂血癥，血清游離脂肪酸水平明顯升高等表現(xiàn)。

人參皂苷Rb1是人參中的主要活性成分之一。中藥人參的抗糖尿病作用機制涉及到機體糖脂代謝調(diào)節(jié)途徑的多個環(huán)節(jié)[6]。本研究結(jié)果顯示，人參皂苷Rb1灌胃8周能夠顯著降低肥胖小鼠體質(zhì)量，減少肥胖小鼠的體脂含量，調(diào)節(jié)肥胖小鼠的血脂代謝紊亂狀態(tài)，并改善其胰島素敏感，其作用與陽性藥物二甲雙胍類似，與以往研究結(jié)果一致[7]。在此基礎(chǔ)上，本研究還發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1能夠改善肥胖小鼠體成分，增加肌組織含量的趨勢，并能增加其骨骼肌耐力，說明人參皂苷Rb1改善肥胖小鼠IR狀態(tài)的作用除了與上調(diào)脂肪細胞過氧化物酶增殖體激活受體γ促進脂肪細胞分化[8]，上調(diào)脂肪細胞葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達，促進葡萄糖的消耗利用[9]，抑制炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激狀態(tài)等有關(guān)[10]，與調(diào)節(jié)骨骼肌能量物質(zhì)的代謝亦有一定的關(guān)系。

血漿游離脂肪酸（FFA）升高是T2DM和肥胖的臨床特征，是導(dǎo)致IR的決定性因素[11]。因為血循環(huán)FFA含量升高導(dǎo)致骨骼肌細胞內(nèi)FFA水平升高及蓄積，可顯著降低胰島素刺激的骨骼肌葡萄糖攝取和利用，影響骨骼肌的能量代謝，引起骨骼肌IR的發(fā)生[12-13]。本研究顯示，與模型對照組比較，人參皂苷Rb1能夠顯著降低血清游離脂肪水平，從而進一步改善骨骼肌的能量物質(zhì)的代謝。

因此，在藥效基礎(chǔ)上，本研究進一步檢測骨骼肌能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子AMPK和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）的變化。骨骼肌是機體糖和脂質(zhì)有氧氧化的主要組織，在調(diào)節(jié)全身能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，AMPK是骨骼肌的能量感受器，能夠調(diào)節(jié)機體能量代謝[14]，因此有學(xué)者認為AMPK在代謝性疾病、能量代謝紊亂等方面是一個有力的潛在靶點。作為能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵遞質(zhì)，AMPK活化通過增強骨骼肌細胞葡萄糖攝取和氧化、增加脂肪酸的氧化率，同時抑制肌糖原合成和促進糖原的分解等[15]，在骨骼肌能量代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，與骨骼肌IR關(guān)系密切。有研究顯示，骨骼肌組織過表達AMPK可增加脂肪酸氧化，并防止高脂飲食誘導(dǎo)的骨骼肌脂質(zhì)沉積[16]。PGC-1α可調(diào)節(jié)能量代謝、誘導(dǎo)線粒體生物合成。有研究證實骨骼肌中的PGC-1α可維持糖代謝平衡，并在骨骼肌和胰島之間建立了細胞因子介導(dǎo)的聯(lián)系[17]。而AMPK作為PGC-1α的重要調(diào)節(jié)因子，可活化PGC-1α，可增強骨骼肌線粒體發(fā)生，并促進脂肪酸氧化[18]。因此，激活的AMPK不僅能通過促進葡萄糖轉(zhuǎn)運體的表達增加及其向胞膜的囊泡轉(zhuǎn)運來增加骨骼肌細胞對葡萄糖的攝取[19];還能通過調(diào)節(jié)PGC-1α促進線粒體氧化呼吸鏈活動性來改善機體IR狀態(tài)[20]。本研究顯示，模型對照組小鼠骨骼肌組織AMPK和PGC-1α基因表達均呈下調(diào)趨勢，且PGC-1α活性變化趨勢與AMPK的活化趨勢一致，人參皂苷Rb1干預(yù)8周后，二者均被明顯上調(diào)。蛋白水平的結(jié)果與基因水平一致，且活化的AMPK（p-AMPK）蛋白表達顯著增加，說明人參皂苷Rb1能夠激活A(yù)MPK-PGC-1α的聯(lián)動反應(yīng)，進而影響骨骼肌線粒體狀態(tài)及能量代謝水平，從而改善肥胖小鼠模型的IR。

綜上所述，人參皂苷Rb1對肥胖小鼠有明顯減重、降脂、改善骨骼肌IR的作用，其機制可能與降低FFA，上調(diào)骨骼肌線粒體AMPK及PGC-1α基因的表達，激活A(yù)MPK從而增強了線粒體功能及脂肪酸β氧化，最終減少了骨骼肌脂質(zhì)沉積有關(guān)，該研究發(fā)現(xiàn)為后期人參皂苷Rb1治療肥胖、糖尿病等代謝性疾病的相關(guān)研究及AMPK激動劑的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。

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