丹參飲對氣虛血瘀模型大鼠的血小板生物學(xué)

張玉昆　馮月男　卞敬琦　肖洪彬　牛雯穎

摘要?目的：觀察丹參飲對氣虛血瘀模型大鼠血小板生物學(xué)的影響，從血小板動態(tài)變化上探討丹參飲作用機制。方法：選取SD大鼠40只為研究對象，一次性向氣管內(nèi)注射博萊霉素生理鹽水溶液復(fù)制氣虛血瘀模型，將40只SD大鼠隨機分為空白對照組、氣虛血瘀模型組、丹參飲高劑量組（3.6 g/kg）、低劑量組（0.9 g/kg），每組10只。造模后第2天開始灌胃給藥，連續(xù)21 d，末次給藥1 h后5%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，檢測全血黏度、血漿黏度、血小板參數(shù)、血小板活化黏附、聚集、釋放以及纖溶相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果：丹參飲可顯著降低模型大鼠中低切變率下的全血黏度和血漿黏度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），可顯著降低PDW和MPV血小板相關(guān)參數(shù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;可顯著升高環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），降低環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、β-血小板球蛋白（β-TG）血小板第4因子（PF4）和纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），延長凝血酶原時間（PT）和凝血酶時間（TT），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：丹參飲可能主要通過改善血小板聚集、抑制凝血及血小板釋放亢進(jìn)的狀態(tài)方面達(dá)到降低全血黏度，改善氣虛血瘀狀態(tài)。

關(guān)鍵詞?丹參飲;氣虛血瘀;血液流變學(xué);血小板;黏附;聚集;釋放;纖溶

Effects of Danshen Decoction on Platelet Biology of Model Rats with Blood Stasis Due to Qi Deciency

Zhang Yukun， Feng Yuenan， Bian Jingqi， Xiao Hongbin， Niu Wenying

（Heilongjiang University of Chinese Medicine， Harbin 150040， China）

Abstract?Objective：To observe the effects of Danshen Decoction on the biological indexes of platelets in model rats with blood stasis due to qi deciency， and to explore the mechanism of Danshen Decoction from the dynamic changes of platelets. Methods：A total of 40 SD rats were randomly assigned to blank group， model group， high-dose Danshen Decoction group （3.6 g/kg） and low-dose Danshen Decoction group （0.9 g/kg） with 10 rats in each group after establishing the model of blood stasis due to qi deciency through injecting bleomycin saline solution into trachea at one time. On the second day after establishing model， the medicine was given through intragastric administration for 21 days. After one hour of the last administration， the rats were anesthetized with 5% chloral hydrate and blood was taken from the abdominal aorta. Blood viscosity， plasma viscosity， platelet parameters， platelet activation， adhesion， aggregation， release and related indicators of fibrinolysis were detected. Results：Compared with the model group， Danshen Decoction could significantly reduce the blood viscosity （P<0.05） and plasma viscosity （P<0.05）. PDW and MPV could be reduced significantly （P<0.05）. The content of cAMP could be increased significantly （P<0.05）. The content of cGMP， β-TG， PF4 and PAI-1 could be reduced significantly （P<0.05）. And prothrombin time （PT） and thrombin time （TT） were prolonged （P<0.05）. Conclusion：Danshen Decoction could decrease whole blood viscosity to improve the blood stasis due to qi deficiency through improving the aggregation of platelet， inhibiting coagulation and the hyper-active release of platelet.

Key Words?Danshen Decoction; Blood stasis due to qi deciency; Hemorheology; Platelets; Adhesion; Aggregation; Release; Fibrinolysis

中圖分類號：R285.5;R289.3;R289.5文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2019.04.012

丹參飲來源《時方歌括》，具有化瘀行氣止痛的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參飲廣泛應(yīng)用于治療慢性胃炎[1-2]、冠心病[3-5]、心絞痛[6]、糖尿病[7]、偏頭痛[8]等方面。課題組前期實驗對補陽還五湯、少腹逐瘀湯以及丹參飲對氣虛血瘀、寒凝血瘀、氣滯血瘀模型進(jìn)行了方證相關(guān)的研究，主要研究了三方對三證的全血黏度以及紅細(xì)胞膜組分的影響[9]。然而影響全血黏度的除紅細(xì)胞之外，血小板也是不可忽略的因素之一。因此我們逐步將三方對三證在血小板生物學(xué)差異進(jìn)行了研究。本研究先從氣虛血瘀模型入手，以丹參飲為探針，針對血小板活化黏附、聚集、釋放以及纖溶系統(tǒng)等相關(guān)聯(lián)過程進(jìn)行分析[10]。探討活血化瘀方藥的作用特點和靶點，進(jìn)一步找到方證相關(guān)作用靶點，為血瘀證證候?qū)嵸|(zhì)提供新的研究思路和實驗依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物?選取清潔級雄性SD老齡大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量（235.8±20.4）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供（動物合格證號SCXK（黑）2008004）。

1.1.2?藥物?丹參飲：丹參30 g、檀香5 g、砂仁5 g（以上中藥飲片均購置于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院）。上述三味藥，加10倍量水浸泡0.5 h，加熱回流煎煮2次，第1次1.5 h，第2次1.0 h，合并煎煮液，濃縮備用。）

1.1.3?試劑與儀器?活化部分凝血活酶時間（Activated Partial Thromboplastin Time，APTT）（北京普利生儀器有限公司，批號173203012），凝血酶原時間（Prothrombin Time，PT）（北京普利生儀器有限公司，批號176202021），凝血酶時間（Thrombin Time，TT）（北京普利生儀器有限公司，批號172902011），纖維蛋白原（Fibrinogen，F(xiàn)IB）（北京普利生儀器有限公司，批號172804011），血管性血友病因子（von Willebrand Factor，vWF）（南京建成生物工程研究所，批號20171214），纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）（Andy gene，批號HTLV171101），環(huán)磷酸腺苷（cAMP）（南京建成生物工程研究所，批號20171214），環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）（南京建成生物工程研究所，批號20171215），6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1alpha，6-keto-PGF1α）（由南京建成生物工程研究所，批號20171214），血栓素B2（Thromboxane B2，TXB2）（南京建成生物工程研究所，批號20171214），β-血小板球蛋白（β-thromboglobulin，β-TG）（Andy gene，批號HTLV171101），血小板第4因子（Platelet Factor 4，PF4）（Andy gene，批號HTLV171101），組織型纖溶酶原活化劑（Tissue-type Plasminogen Activator，t-PA）（Andy gene，批號HTLV171101），纖溶酶原激活物抑制劑-1（Plasminogen Activator Inhibito，PAI-1）（Andy gene，批號HTLV171101）。Bio-rad Imark酶標(biāo)儀（美國伯樂公司），LBY-N7500B全自動血液流變儀（美國貝克曼庫爾特有限公司），TGL-16G型高速臺式離心機（蘇州捷美電子有限公司），xs-500i全自動血液細(xì)胞分析儀（日本希森美康有限公司），C2000-A全自動血凝儀（北京普利生儀器有限公司），DZKW-D-1水浴鍋（上海醫(yī)用分析儀器廠），HYQ-2121A渦旋儀（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備?將40只大鼠按體質(zhì)量隨機分為4組，即丹參飲高劑量組（3.6 g生藥/kg）、丹參飲劑量組（0.9 g生藥/kg）、模型組（蒸餾水組）和空白組（蒸餾水組）。除空白組外其余各組大鼠以5%的水合氯醛腹腔注射麻醉，待大鼠麻醉昏迷后將四肢和頭部仰臥位固定于老鼠固定板上。采用注射博萊霉素生理鹽水溶液（5 mg/kg）法復(fù)制氣虛血瘀模型[11]。

1.2.2?給藥方法?從造模后第2天開始灌胃給藥，連續(xù)給藥21 d。其中丹參飲高劑量組按照3.6 g生藥/kg灌胃給藥，丹參飲劑量組按照0.9 g生藥/kg灌胃給藥。模型組和空白組給予等劑量的蒸餾水灌胃。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法?全血黏度及血漿黏度的測定方法請參照參考文獻(xiàn)[12]。取EDTA抗凝血，采用全自動血細(xì)胞分析儀測定PLT、PDW、MPV、PCT和PLCR血小板參數(shù)相關(guān)指標(biāo)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法檢測vWF、FN、cAMP、cGMP、6-keto-PGF1α、TXB2、β-TG和PF4血小板活化黏附、聚集、釋放相關(guān)指標(biāo)。采用ELISA法檢測t-PA和PAI-1、采用全自動血凝儀檢測APTT、PT、TT和FIB纖溶系統(tǒng)及凝血相關(guān)指標(biāo)。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法?采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件處理所得數(shù)據(jù)，計量資料用（±s）表示，多組比較用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?4組大鼠血液流變學(xué)比較?與模型組比較，丹參飲可顯著降低中低切變率的全血黏度和血漿黏度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.2?4組大鼠血小板參數(shù)比較?與模型組比較，丹參飲可降低PDW水平及MPV，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3?4組大鼠血小板活化黏附相關(guān)指標(biāo)比較?與模型組比較，丹參飲對于vWF和FN水平無影響。見表3。

2.4?4組大鼠血小板聚集性相關(guān)指標(biāo)比較?與模型組比較，丹參飲可顯著升高cAMP水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），降低cGMP，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。6-keto-PGF1α、TXB2有變化趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

2.5?4組大鼠血小板釋放相關(guān)指標(biāo)比較?與模型組比較，丹參飲可顯著降低β-TG和PF4水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

2.6?4組大鼠血小板纖溶相關(guān)指標(biāo)比較?與模型組比較，丹參飲可顯出延長TT和PT，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。丹參飲可顯著降低PAI-1水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），t-PA有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表6。

3?討論

丹參飲由丹參、檀香和砂仁組成?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，丹參水溶性成分通過舒張冠脈、保護(hù)內(nèi)皮、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)能量代謝、活性氧代謝、抑制炎性反應(yīng)等作用[13]。丹酚酸A和丹酚酸B抗血小板聚集的機制不同，丹酚酸A抑制花生四烯酸、凝血酶和ADP誘導(dǎo)的血小板凝集，與其抑制PI3K信號通路下游分子Akt的磷酸化有關(guān)[14]。丹酚酸B可減少血小板釋放產(chǎn)物（PLTaRP）造成的LDH釋放，高劑量丹酚酸B可明顯抑制細(xì)胞凋亡。丹酚酸類和丹參素均可抑制血小板聚集及抗凝[15]，故能改善血流動力學(xué)，防止血栓的形成，預(yù)防心肌缺血的產(chǎn)生。此外，有研究表明丹參與當(dāng)歸配伍劑量比為1∶3時，抗血小板聚集能力和降脂作用活性最佳[16]。丹參、紅花水溶性組分對心肌缺血/再灌注損傷后的指標(biāo)改善方面，升高6-keto-PGF1α水平方面作用加強，從而抑制血小板聚集，防治血栓形成，對缺血后再灌注損傷的心肌有保護(hù)作用[17]。有關(guān)檀香對于血小板方面的研究內(nèi)容較少，三味檀香膠囊能有效降低血小板聚集率，改善冠心病心絞痛患者血脂代謝和血液流變學(xué)，防治血栓形成[18]?，F(xiàn)代研究顯示砂仁具有抗?jié)?、抗腹瀉、促進(jìn)胃排空和胃腸推進(jìn)運動、利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血小板聚集和延長凝血時間等藥理作用[19]。砂仁對致聚劑誘發(fā)的小鼠突然性死亡有明顯的保護(hù)作用，推測砂仁除有抑制血小板聚集的作用外，可能與擴張血管或抑制血栓素合成也有關(guān)系[20]。故丹參飲從理論上具有抑制血小板聚集以及血栓形成的作用。

血小板活化黏附、聚集、釋放以及纖溶等是一系列相關(guān)聯(lián)過程。vWF是早期血小板活化的標(biāo)志物，F(xiàn)N加強了血小板的黏附過程，在損傷的局部形成血小板血栓[21-22]。本實驗中氣虛血瘀模型組vWF和FN水平均顯著上升，而丹參飲對于vWF和FN無顯著性作用。因此，丹參飲對于血小板活化黏附方面未見顯著作用。

血小板聚集是指血小板之間通過黏附受體相互黏附形成血小板團(tuán)的功能。cAMP能抑制血小板聚集，cGMP與之相反。TXA2具有強烈促進(jìn)血小板聚集的作用，PGI2是由血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的一種抗血小板聚集物質(zhì)，由于TXA2、PGI2的不穩(wěn)定而自行轉(zhuǎn)變?yōu)檩^穩(wěn)定的產(chǎn)物TXB2、6-keto-PGF1α。本實驗中丹參飲可顯著升高cAMP水平、降低cGMP水平，而TXB2、6-keto-PGF1α變化不顯著。因此，丹參飲通過顯著改善cAMP與cGMP的水平達(dá)到抑制血小板聚集的目的。

PF4可使血小板釋放細(xì)胞因子和生長因子，并覆蓋在血管內(nèi)皮的硫酸乙酰肝素相結(jié)合，對血小板具有促聚集作用。β-TG是血小板α顆粒合成與分泌的特意蛋白質(zhì)，使PGI2分泌減少從而促進(jìn)血小板聚集。實驗中氣虛血瘀模型組中β-TG和PF4水平均顯著升高，丹參飲可顯著降低β-TG和PF4水平。因此，丹參飲對血小板的釋放具有一定影響。

t-PA和PAI-1是纖溶系統(tǒng)的主要調(diào)節(jié)物，二者的動態(tài)平衡對維持血漿纖溶系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)起決定作用。t-PA抑制和解聚血小板的聚集，PAI-l是t-PA的快速抑制物，滅活t-PA，對t-PA起特異性調(diào)控作用。實驗中模型組中t-PA水平顯著降低，PAI-1水平顯著升高，表示模型組血小板易聚集，向凝血方向發(fā)展。本實驗丹參飲可顯著降低PAI-1水平，然而對t-PA又升高趨勢但是不具有顯著性。因此，丹參飲可能通過使平衡系統(tǒng)向纖溶方向發(fā)展，從而達(dá)到抑制血小板聚集。

凝血過程可分為內(nèi)源性和外源性2種，APTT和TT的延長與內(nèi)源系統(tǒng)凝血酶的抑制有關(guān)，PT與外源性凝血系統(tǒng)有關(guān)。FIB作用下交聯(lián)為纖維蛋白引起血小板聚集性增強，誘發(fā)血栓形成。本實驗中丹參飲可顯著延長PT和TT，通過對內(nèi)源和外源系統(tǒng)的影響，發(fā)揮抗血小板聚集的作用。

綜上所述，丹參飲可能主要通過改善血小板聚集、抑制凝血及血小板釋放亢進(jìn)的狀態(tài)方面達(dá)到降低全血黏度，改善氣虛血瘀狀態(tài)。

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