Fonsecaeamonophora色素對(duì)人巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

覃靜林 張靜 張軍民

【關(guān)鍵詞】 Fonsecaea monophora;色素;人巨噬細(xì)胞;THP-1單核細(xì)胞;炎癥細(xì)胞因子

Effect of Fonsecaea monophora pigment on the expression of inflammatory cytokines in THP-1-derived human macrophages Qin Jinglin， Zhang Jing， Zhang Junmin. Department of Dermatology， Sun Yat-sen Memorial Hospital， Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Zhang Junmin， E-mail： junminmx@ 163. com

【Abstract】 Objective To evaluate the effect of Fonsecaea monophora （F. monophora） pigment on the expression of inflammatory cytokines in THP-1-derived human macrophages. ?Methods THP-1 human monocytes were induced into macrophages and co-cultured with the standard， pigment and albino strains of F. monophora. The expression levels of CD14 and CD68 on the cell membrane surface were quantitatively detected by immunofluorescence. Real-time quantitative PCR was performed to detect the expression of IL-1β，TNF-α， IL-6， IL-10 and TGF-β in each group. ?Results After the induction of THP-1 human mononuclear cells into macrophages， the expressed membrane surface molecule was changed from CD14 to CD68. After co-culture with F. monophora， the expression levels of IL-6， IL-10 and TGF-β were significantly up-regulated in the standard strain （all P < 0.05）. The expression of IL-6 and TGF-β was remarkably up-regulated in the pigment strain （both P < 0.05）. The expression levels of IL-1β， TNF-α， IL-6 and IL-10 were significantly up-regulated in the albino strain （all P < 0.05）. The expression of IL-1β in the albino strain was significantly higher than that in the standard strain （P < 0.05）. The expression levels of IL-10 and TGF-β were significantly up-regulated in the standard strain compared with those in the pigment and albino strains （all P < 0.05）. ?Conclusions The standard strain of F.monophora can promote the development of human macrophages into the anti-inflammatory state. The albino strain can accelerate the progression of human macrophages into the pro-inflammatory state， whereas the pigment strain can maintain human macrophages in the balance state between pro-inflammatory and anti-inflammatory state， indicating that F. monophora pigment may lead to the disorder of inflammatory state of the host.

【Key words】 Fonsecaea monophora;Pigment;Human macrophage;THP-1 monocyte;

Inflammatory cytokine

著色芽生菌?。–BM）由暗色孢科中的一組特殊暗色真菌導(dǎo)致的一種慢性進(jìn)行性皮膚和皮下組織肉芽腫性真菌病，是最常見(jiàn)的植入性真菌感染病之一。病原菌通過(guò)皮膚破損處進(jìn)入宿主體內(nèi)，最常發(fā)生于下肢，多發(fā)于從事農(nóng)、林及畜牧業(yè)的體力勞動(dòng)者。該病進(jìn)展緩慢，病程可達(dá)數(shù)十年，治療困難且易復(fù)發(fā)，部分患者發(fā)病部位可以發(fā)生癌變，使患者喪失工作能力甚至威脅患者生命，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。該病于2017年被世界衛(wèi)生組織正式納入“被忽略的熱帶病”范疇，以此呼吁全球?qū)＜抑匾昜1]。在我國(guó)，CBM發(fā)生地域主要位于山東及兩廣地區(qū)[2-3]。很多研究表明CBM的重要致病因子是黑色素、硬殼細(xì)胞、細(xì)胞黏附性和疏水性[1]。

Fonsecaea monophora（F. monophora）是從多株F. pedrosoi著色霉菌株中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新種，是我國(guó)南方地區(qū)CBM的主要致病菌[4-5]。該菌不僅可以造成局限性皮膚感染，也可引起系統(tǒng)性感染，侵犯神經(jīng)系統(tǒng)或呼吸道，具有噬神經(jīng)性，正如隱球菌一樣，嚴(yán)重者危及患者的生命健康[6-7]。盡管很多學(xué)者致力于CBM發(fā)病機(jī)制的研究，但到目前為止，F(xiàn).monophora的致病機(jī)制并不十分清楚。

在不同的微環(huán)境下，巨噬細(xì)胞可被刺激產(chǎn)生不同的炎癥細(xì)胞因子，當(dāng)處于促炎狀態(tài)時(shí)，可分泌IL-1β、TNF-α、IL-6等促炎癥細(xì)胞因子，清除和殺傷入侵的病原菌，抑制周圍細(xì)胞的增殖和破壞組織的完整性，當(dāng)處于抗炎狀態(tài)時(shí)，可分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等抗炎癥和促修復(fù)細(xì)胞因子，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和組織修復(fù)，導(dǎo)致疾病慢性化[8-9]。以往的相關(guān)體外研究大多數(shù)是在小鼠巨噬細(xì)胞層面進(jìn)行。然而，F(xiàn). monophora對(duì)人巨噬細(xì)胞的影響，尤其是F. monophora色素對(duì)人巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響，暫未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

材料與方法

一、細(xì)胞和菌株

人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典藏物保存中心。F.monophora標(biāo)準(zhǔn)株（CBS269.37，SUMS0310）受贈(zèng)于荷蘭微生物菌種保藏中心，既有孢子成分又有菌絲成分，含色素;F. monophora 色素株（CBS122845，SUMS0505）分離自一位81歲CBM患者的皮損，是一種分生孢子突變株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列鑒定為F. monophora，含色素，無(wú)菌絲成分;F. monophora 白化株（CBS1 25149，SUMS0 510）是上述色素株在PDA培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種10余次后得到的天然突變株，不含色素，無(wú)菌絲成分。

二、主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA） （BD，美國(guó)）;RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco， 美國(guó)）;青霉素/

鏈霉素混合液（雙抗）（Hyclone， 美國(guó)）;胎牛血清（Fetal Bovine Serum， FBS）（Gibco， 美國(guó)）; PBS緩沖液（1×）（Gibco， 美國(guó)）;丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）（Sigma， 美國(guó)）;6孔板細(xì)胞爬片（廣州永津生物科技有限公司）;抗CD14抗體（Servicebio， 中國(guó)）;抗CD68抗體（Servicebio， 中國(guó)）;Trizol RNA提取試劑（TaKaRa，大連寶生物工程有限公司）;TB GreenTM ?Premix Ex TaqTM ?Ⅱ（TaKaRa， 大連寶生物工程有限公司）;PrimeScriptTM RTMaster Mix（TaKaRa， 大連寶生物工程有限公司）。

三、實(shí)驗(yàn)方法

1. 細(xì)胞復(fù)蘇、傳代及培養(yǎng)

在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)，無(wú)菌操作復(fù)蘇THP-1細(xì)胞株，用提前配置好的含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 ～ 3 d。經(jīng)2 ～ 3次傳代狀態(tài)穩(wěn)定后用Count Star細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整細(xì)胞密度至6×105 /ml，轉(zhuǎn)至6孔板。

2. 細(xì)胞免疫熒光

將實(shí)驗(yàn)分為2組：THP-1空白對(duì)照組和THP-1+PMA實(shí)驗(yàn)組，將細(xì)胞濃度調(diào)整為6×105 /ml，轉(zhuǎn)種至鋪好細(xì)胞爬片的6孔板中，每孔2 ml，加入PMA（100 ng/ml），在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中共孵育48 h?？瞻讓?duì)照組則將濃度為6×105 /ml的細(xì)胞懸液滴加到細(xì)胞爬片上，超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干。在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3 min;用4%的多聚甲醛固定爬片15 min， PBS浸洗玻片3次，每次3 min;0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min;PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min;吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加稀釋好的一抗抗CD14（1∶300）和抗CD68（1∶500），并放入濕盒，4℃孵育過(guò)夜;PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗CY3-山羊抗小鼠（1∶300）和FITC-山羊抗兔（1∶500）（注意避光），濕盒中室溫孵育1 h，PBST浸洗切片3次，每次3 min;滴加DAPI避光孵育5 min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI;用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

3. 制備F. monophora孢子懸液

將3種F. monophora分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)13 ～ 15 d后，用PBS緩沖液反復(fù)輕輕吹打菌落，制備菌懸液。以10 000轉(zhuǎn)/分離心10 min，去上清，重復(fù)2次，PBS緩沖液重懸，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整菌懸液的分生孢子濃度為6×107 CFU/ml，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 實(shí)驗(yàn)分組及共培養(yǎng)的建立

將實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)組：空白對(duì)照組、標(biāo)準(zhǔn)株組、色素株組和白化株組。細(xì)胞傳代2 ～ 3次，細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后將細(xì)胞濃度調(diào)整為6×105 /ml，轉(zhuǎn)種到6孔板，每孔1.8 ml，加入PMA（100 ng/ml），在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中共孵育6 h待細(xì)胞完全貼壁后以細(xì)胞∶孢子=1∶10的比例每孔加入提前配置好的菌懸液200 μl，在含5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)42 h[10]。

5. 細(xì)胞和F. monophora觀察

F. monophora與細(xì)胞共培養(yǎng)42 h后于相差倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞和F. monophora的變化并拍照記錄。

6. 總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR

總RNA提取按照試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄及定量PCR反應(yīng)均依據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1 min;95℃變性 5 s，60℃擴(kuò)增15 s并采集熒光信號(hào)，45個(gè)循環(huán)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，定量PCR結(jié)果由Bio-Rad CFX Connect PCR擴(kuò)增儀收集。PCR循環(huán)結(jié)束后，進(jìn)行溶解曲線分析，以檢驗(yàn)PCR反應(yīng)的特異性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用進(jìn)階相對(duì)定量（advanced relative quant-ification）方法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行分析，根據(jù)擴(kuò)增曲線得到Ct值，以2-△△Ct法分析進(jìn)行組間相對(duì)定量分析。使用Graphpad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PMA可將THP-1人單核細(xì)胞誘導(dǎo)為巨噬細(xì)胞

在加入PMA誘導(dǎo)6 h后，細(xì)胞由懸浮狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橘N壁狀態(tài);與未被誘導(dǎo)的細(xì)胞相比，細(xì)胞體積增大，胞內(nèi)吞噬泡增大增多，隨著共孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，形態(tài)不再呈圓形，而是多邊形，甚至出現(xiàn)觸角。細(xì)胞膜表面分子由單核細(xì)胞高表達(dá)的CD14轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉?xì)胞高表達(dá)的CD68（圖1）。

二、F. monophora 不同菌株對(duì)巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響

標(biāo)準(zhǔn)株與人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)42 h后，可以觀察到孢子的繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖并沒(méi)有受到明顯的影響，但同時(shí)可以觀察到部分菌絲被巨噬細(xì)胞所包裹（圖2B）;色素株和白化株與人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)42 h后，可以發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞聚集在孢子的周圍，標(biāo)準(zhǔn)株的小孢子可被吞噬，但菌絲不可被吞噬;色素株和白化株的孢子由于體積較大，粘連成團(tuán)，不能被吞噬（圖2C、D）。

三、F. monophora色素對(duì)THP-1來(lái)源人巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響

F. monophora標(biāo)準(zhǔn)株上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-6、IL-10、TGF-β的表達(dá)（LSD-t值分別為4.515、9.458、12.630，P均< 0.05），對(duì)促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）;色素株上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-6和抗炎細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)（LSD-t值分別為3.759、4.529，P均< 0.05），對(duì)促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）;白化株上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)（LSD-t值分別為5.118、3.448、6.705、3.922，P均< 0.05），對(duì)抗炎細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)有上調(diào)趨勢(shì)，但差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。白化株較標(biāo)準(zhǔn)株能上調(diào)促炎細(xì)胞因子IL-1β的表達(dá)（LSD-t=3.807，P < 0.05）;標(biāo)準(zhǔn)株較色素株和白化株能上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的表達(dá)（LSD-t值分別為5.815、4.952、7.249、9.848，P均< 0.05），見(jiàn)圖3。

討 論

真菌細(xì)胞壁是真菌生存和致病的重要結(jié)構(gòu)，包括葡聚糖、甘露糖、色素等成分，色素在細(xì)胞壁層形成不規(guī)則顆粒，通過(guò)與含甘露糖或葡聚糖的糖蛋白間形成共價(jià)鏈接而錨定在細(xì)胞壁上[11]。許多文獻(xiàn)證實(shí)色素是真菌的重要毒力因子，參與調(diào)節(jié)宿主與真菌的免疫炎癥反應(yīng)。色素對(duì)宿主免疫的影響涉及炎癥細(xì)胞遷移、吞噬、凋亡等多方面。很多研究證實(shí)了巨噬細(xì)胞在真菌色素-宿主相互作用中的重要性。煙曲霉色素通過(guò)改變巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬體的pH值阻止其凋亡，而無(wú)色素變異株則不能修正這種pH值的變化，致使吞噬體在持續(xù)酸性環(huán)境里最終進(jìn)入死亡階段[12]。煙曲霉色素除了能屏蔽β葡聚糖從而影響病原分子模式識(shí)別外，還能通過(guò)移除細(xì)胞吞噬體內(nèi)NAPDH氧化酶的亞單位、抑制NADPH氧化酶活性而抑制人單核細(xì)胞發(fā)生與LC3相關(guān)的自噬[13]。

真菌的色素除了抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)吞噬細(xì)胞的酸化、中性粒細(xì)胞遷移等免疫反應(yīng)外，近期Rambach等（2015年）證實(shí)色素還有促進(jìn)血小板活化、誘導(dǎo)顆粒釋放等作用。F. pedrosoi色素被證實(shí)能夠刺激IL-10分泌，并可下調(diào)宿主細(xì)胞吞噬率，推測(cè)色素可能是調(diào)節(jié)宿主免疫類型、形成維持感染的主要原因。研究表明F. monophora色素株及其細(xì)胞壁成分可以降低小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）誘導(dǎo)型一氧化氮合酶基因的表達(dá)，抑制一氧化氮在體外的合成，Th2細(xì)胞因子的表達(dá)增加，Th1細(xì)胞因子的表達(dá)被抑制，表明黑色素在體外避免氧化殺傷的過(guò)程中起著重要作用，Th2細(xì)胞因子的表達(dá)增加可能會(huì)加速真菌的持續(xù)存在[14]。此外，F(xiàn). monophora 色素能夠刺激BALB/c小鼠Th2 細(xì)胞因子的產(chǎn)生，下調(diào)Th1細(xì)胞因子的分泌，色素的存在對(duì)BALB/c小鼠產(chǎn)生的毒力較強(qiáng)，從而推測(cè)黑色素是F.monophora重要的毒力因子和保護(hù)因子[15]。在我們的研究中，F(xiàn). monophora與THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，白化株較標(biāo)準(zhǔn)株能明顯上調(diào)促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，標(biāo)準(zhǔn)株較色素株和白化株能明顯上調(diào)抗炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。F. monophora標(biāo)準(zhǔn)株由于既含有色素又有菌絲成分，其毒力更強(qiáng)，能促使人巨噬細(xì)胞往抗炎狀態(tài)發(fā)展，抑制宿主對(duì)病原菌的清除和殺傷，白化株不含色素，毒力較弱，能促使人巨噬細(xì)胞往促炎狀態(tài)發(fā)展，色素株則使人巨噬細(xì)胞處于促炎和抗炎的平衡狀態(tài)，既不利于早期入侵宿主病原體的清除，也不利于宿主的后期修復(fù)。

綜上所述，我們的研究初步表明F. monophora色素在人細(xì)胞水平上的毒力表現(xiàn)與鼠科水平基本一致。所以利用THP-1人單核細(xì)胞系來(lái)研究F. monophora的致病機(jī)制是可行的。同時(shí)，本研究首次成功構(gòu)建了F. monophora不同菌株與THP-1來(lái)源的人巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系，可為后續(xù)在人類細(xì)胞水平上進(jìn)一步闡明CBM的發(fā)病機(jī)制及F. monophora 的致病機(jī)制和宿主防御機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-01-12）

（本文編輯：楊江瑜）