長沙臭豆腐上色工藝優(yōu)化及鹵水浸泡前后風(fēng)味物質(zhì)比較

唐輝 陳霖 曾玉倫 李跑 賀靜 蔣立文

摘要：【目的】對長沙臭豆腐的上色工藝和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行研究，為促進(jìn)臭豆腐標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)?！痉椒ā坎捎脝我蛩卦囼灪驼辉囼灴疾炝蛩醽嗚F濃度、茶葉粉用量、上色溫度和上色時間對臭豆腐上色效果的影響，確定最佳上色工藝，并采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（HS-SPME-GC-MS）測定豆腐浸泡鹵水前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的相對含量差異。【結(jié)果】上色因素對臭豆腐色差L值的影響排序為茶葉粉用量>硫酸亞鐵濃度>上色時間>上色溫度;最佳上色工藝為：硫酸亞鐵濃度0.12 g/L、茶葉粉用量7.0 g/L、上色溫度92 ℃、上色時間28 min，在此條件下，臭豆腐色差L值為0.90。豆腐浸泡鹵水后，6種酯類物質(zhì)均未檢出，但酸類物質(zhì)的相對含量大幅增加;醇類物質(zhì)的相對含量有所下降，但種類變化不明顯;4-甲基苯酚和3-甲基吲哚的相對含量均有所增加，分別增加5.29%和2.99%（絕對值）?！窘Y(jié)論】優(yōu)化后的上色工藝可使臭豆腐顏色黑如墨;臭豆腐浸泡鹵水并上色后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生改變，正是這些風(fēng)味物質(zhì)的變化，賦予了臭豆腐“聞起來臭，吃起來香”的特點。

關(guān)鍵詞： 長沙臭豆腐;上色工藝;鹵水浸泡;揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

中圖分類號： S509.9;TS214.2? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0831-07

Abstract：【Objective】In this paper，study on coloring process and volatile flavor compounds of Changsha stinky tofu were studied and carried out. It supplied reference that promoted standardization and industrial production of stinky tofu.【Method】Influence of concentrations of ferrous sulfate， contents of tea powder， coloring temperature and coloring time on coloring effects of stinky tofu were determined by the single factor and orthogonal experiments， the optimal coloring process was determined. The relative content of volatile components before and after the tofu soaked brine were compared by headspace solid phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry（HS-SPME-GC-MS）. 【Result】The results showed that the effects of coloring factors on stinky tofu color L value were contents of tea powder> concentration of ferrous sulfate>coloring time>coloring temperature. The optimum coloring process established were as follows：Adding ferrous sulfate at the concentration of 0.12 g/L，tea powder dosage 7.0 g/L，coloring temperature 92 ℃， coloring time 28 min. Under this conditions， the color L value of stinky tofu was 0.90. After soaking in brine，in addition，six esters in tofu had not been detected，the relative contents of acids increased sharply，alcohols contents decreased，and the species of alcohols did not change largely， relative contents of 4-cresol and 3-methylindole increased by 5.29% and 2.99% respectively. 【Conclusion】Stinky tofu’s color is as black as ink by optimum coloring process. As a result of variation on volatile flavor compounds by soaking in brine and coloring， the stinky tofu has characteristic that smells bad and tastes good.

Key words： Changsha stinky tofu brine; coloring process; soaking in brine; volatile flavor compounds

0 引言

【研究意義】臭豆腐是我國傳統(tǒng)特色小吃，具有“東方奶酪”之稱，早在清朝康熙年間就有關(guān)于臭豆腐制作的文獻(xiàn)記載，由于其具有制作簡單、價格親民、“聞起來臭，吃起來香”等特點，被廣為傳承和推廣，尤其是長沙臭豆腐因其“黑如墨、香如醇、嫩如酥、軟如絨”的特點而深受廣大消費者喜愛（金尉，2012）。臭豆腐中富含蛋白質(zhì)和氨基酸（何理，2012），維生素B12含量較高，可有效預(yù)防老年癡呆癥（郭華等，2004），同時臭豆腐是植物雌激素——雌馬酚的良好食物來源（Akaza et al.，2004;Fuhrman et al.，2008;Abiru et al.，2012;Rui et al.，2014）。長沙臭豆腐是將豆腐坯浸入發(fā)酵鹵水中數(shù)小時或數(shù)天，油炸后拌佐料食用，其“黑如墨”、“聞起來臭，吃起來香”等特性主要來源于臭豆腐鹵水的浸泡。鹵水不直接食用，但在浸泡豆腐坯的過程中進(jìn)行了微生物、功能成分和風(fēng)味物質(zhì)等傳遞，由此賦予了臭豆腐的特殊顏色和風(fēng)味。長沙臭豆腐鹵水主要采用豆豉、香菇、莧菜、竹筍原料加水混合自然發(fā)酵數(shù)月至1～3年不等（Chao et al.，2008），因各地鹵水原料和氣候的差異，常使得臭豆腐在浸泡鹵水后未表現(xiàn)出其特性，而影響消費者食用。因此，研究長沙臭豆腐上色工藝，并對上色后臭豆腐風(fēng)味物質(zhì)的變化進(jìn)行分析，對促進(jìn)長沙臭豆腐的工業(yè)化生產(chǎn)有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前關(guān)于臭豆腐的上色工藝研究較少，譚斯亮（2007）研究發(fā)現(xiàn)，硫酸亞鐵與臭豆腐鹵水中的發(fā)酵物作用可產(chǎn)生墨黑色的硫化鐵，從而使普通豆腐、香干迅速變色上味;何理（2012）對市面上的長沙臭豆腐上色工藝進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)硫酸亞鐵可提升臭豆腐的黑色。臭豆腐風(fēng)味物質(zhì)的研究主要集中在鹵水風(fēng)味方面，鄭小芬等（2013）采用固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜法（SPME-GC-MS）比較了深色和淺色兩種臭豆腐鹵水的揮發(fā)性成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，深色臭豆腐中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有38種，淺色臭豆腐中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)有42種，兩種臭豆腐鹵水共有揮發(fā)性成分9種;孫潔雯等（2015）采用SDE結(jié)合GC-MS分析了北方臭豆腐鹵水揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)吲哚（0.70 μg/g）、正丁醇（7.21 μg/g）、正丙醇（2.33 μg/g）、二甲基二硫（0.42 μg/g）、二甲基三硫（0.36 μg/g）、二甲基四硫（0.15 μg/g）等揮發(fā)性成分是北京王致和臭豆腐的特征性香味成分;賀靜等（2016）采用SPME-GC-MS分析不同發(fā)酵工藝階段臭豆腐鹵水中的揮發(fā)性成分，共鑒定出122種成分，其中烷類30種，酯類24種，酮類20種，醇類18種，酸類和烯類各9種，醛類6種，酚類和吲哚各3種。【本研究切入點】至今，關(guān)于臭豆腐上色工藝的研究較少，且尚未形成標(biāo)準(zhǔn)流程;雖有大量文獻(xiàn)研究臭豆腐鹵水的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分，但關(guān)于臭豆腐浸泡鹵水后風(fēng)味物質(zhì)的變化研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用黑茶粉輔助，硫酸亞鐵上色，以色差值為評價指標(biāo)，對臭豆腐的上色工藝進(jìn)行優(yōu)化，同時對豆腐浸泡鹵水前后的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行比較，為促進(jìn)臭豆腐標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

白豆腐購自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)濱河農(nóng)貿(mào)市場，黑茶葉粉購自長沙火宮殿食品有限公司旁農(nóng)貿(mào)市場（茶多酚含量10.27±0.23 g/100 g）。主要儀器設(shè)備：GC-MS-QP2010氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司），R-400色彩色差計（日本柯尼卡美能達(dá)株式會社），固相微萃取裝置（美國SUPELCO公司），722N可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司），其他常規(guī)儀器設(shè)備由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗室提供。

1. 2 臭豆腐及其鹵水生產(chǎn)工藝流程

1. 2. 1 臭豆腐生產(chǎn)工藝流程 黃豆→豆腐坯→上色（硫酸亞鐵、茶葉等）→臭豆腐鹵水浸泡→臭豆腐片→半成品。

1. 2. 2 鹵水生產(chǎn)工藝流程 豆豉、竹筍、香菇和梅干茶等→粉碎→滅菌→冷卻→混入熱豆腐腦→入罐→發(fā)酵（1～3年）→臭豆腐鹵水。

1. 3 上色優(yōu)化試驗

1. 3. 1 單因素試驗設(shè)計

1. 3. 1. 1 硫酸亞鐵濃度選擇 按照GB 2760—2014中規(guī)定硫酸亞鐵在發(fā)酵豆制品（僅限臭豆腐）中的最大限制使用濃度0.15 g/L上色工藝閾值，分別選擇0.03、0.06、0.09、0.12和0.15 g/L 5個濃度，以色差值為考察指標(biāo)，對硫酸亞鐵濃度進(jìn)行單因素試驗。固定茶葉粉用量6.0 g/L，上色溫度90 ℃，上色時間25 min。

1. 3. 1. 2 茶葉粉用量選擇 選擇添加2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 g/L茶葉粉末，以色差值為考察指標(biāo)，對茶葉粉用量進(jìn)行單因素試驗。固定硫酸亞鐵濃度0.09 g/L，上色溫度90 ℃，上色時間25 min。

1. 3. 1. 3 上色溫度選擇 設(shè)計上色溫度80、85、90、95和100 ℃ 5個水平，以色差值為考察指標(biāo)，進(jìn)行上色溫度單因素試驗。固定硫酸亞鐵濃度0.09 g/L，茶葉粉用量6.0 g/L，上色時間25 min。

1. 3. 1. 4 上色時間選擇 設(shè)計上色時間15、20、25、30和35 min 5個水平，以色差值為考察指標(biāo)，進(jìn)行上色時間單因素試驗。固定硫酸亞鐵濃度0.09 g/L，茶葉粉用量6.0 g/L，上色溫度90 ℃。

1. 3. 2 正交優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計L9（34）正交試驗，進(jìn)一步優(yōu)化臭豆腐上色工藝參數(shù)。正交試驗因素水平見表1。

1. 4 色差值測定

色差計中，L值表示顏色明度，L=0為黑色，L=100為白色;a值表示紅色（+a）和綠色（-a）色值;b值表示黃色（+b）和藍(lán)色（-b）色值。分析時，將色差計的測量頭輕壓豆腐坯樣品，使測量頭邊緣與豆腐坯無明顯縫隙，等待2～5 s后讀數(shù)。每組浸泡后完成上色的豆腐坯試樣測定5次，取其平均值。因臭豆腐的主要顏色是黑色，故本研究主要以Hunter L值為判斷標(biāo)準(zhǔn)。L值越大，臭豆腐顏色越淺，越接近白色;L值越小，臭豆腐顏色越深，越接近黑色。

1. 5 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

將從市場采購的白豆腐坯與浸泡鹵水上色后的臭豆腐坯進(jìn)行揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較，了解其浸泡上色后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的變化。

1. 5. 1 樣品預(yù)處理 采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）對臭豆腐的揮發(fā)性成分進(jìn)行萃取。75 μm Carboxen/PDMS萃取纖維在首次使用時按照廠家推薦的條件進(jìn)行老化，消除干擾峰后萃取樣品。取均一臭豆腐樣品1.0 g置于20 mL頂空固相微萃取瓶中，加超純水4.0 mL搖勻、密封后，在平衡時間20 min、攪拌速度200 r/min、萃取溫度70 ℃、萃取時間40 min的條件下吸附萃取，并于GC進(jìn)樣口240 ℃下解析5 min。

1. 5. 2 GC-MS條件 GC條件：色譜柱為CD-WAX彈性石英毛細(xì)管柱（30 cm×0.25 mm×0.25 μm）;載氣為氦氣（99.999%），流速1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度240 ℃;不分流進(jìn)樣。升溫程序：柱溫50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至200 ℃，保持14 min，再以15 ℃/min升至240 ℃即可。

MS條件：離子源為電子電離（El）源，離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，發(fā)射電流150 μA，倍增器電壓1037 V，接口溫度220 ℃，質(zhì)量掃描范圍45～500 m/z。

1. 5. 3 定性定量分析 總離子流色譜圖經(jīng)美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所NIST 2014s標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索進(jìn)行定性鑒定。采用面積歸一法進(jìn)行相對含量分析。

1. 6 統(tǒng)計分析

采用Excel 2007對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計并制圖，SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1 硫酸亞鐵濃度對臭豆腐上色效果的影響 從圖1可看出，不同硫酸亞鐵濃度對臭豆腐的上色影響顯著（P<0.05，下同），硫酸亞鐵濃度在0.03～0.12 g/L范圍內(nèi)，隨著硫酸亞鐵濃度的升高，臭豆腐坯的L值顯著下降，上色后的臭豆腐坯顏色越黑;當(dāng)硫酸亞鐵濃度為0.12 g/L時，臭豆腐坯的L值下降至最低，且與0.15 g/L的L值無顯著差異（P>0.05，下同）。因此，硫酸亞鐵較適宜的上色濃度為0.12 g/L。

2. 1. 2 茶葉粉用量對臭豆腐上色效果的影響 如圖2所示，不同茶葉粉用量對臭豆腐的上色效果有顯著影響，當(dāng)茶葉粉用量為6.0 g/L（茶多酚含量為0.6162 g/L）時，上色后的臭豆腐坯L值最低，顏色最黑，此時臭豆腐最符合“黑如墨”的品質(zhì)要求。當(dāng)茶葉粉用量超過6.0 g/L后，L值反而快速上升。因此，茶葉粉適宜用量為6.0 g/L。

2. 1. 3 上色溫度對臭豆腐上色效果的影響 如圖3所示，上色溫度對豆腐坯的上色效果有顯著影響，上色溫度從80 ℃升至90 ℃時，上色后的臭豆腐坯L值逐漸降低，臭豆腐顏色越變越黑;當(dāng)上色溫度超過90 ℃后，臭豆腐坯L值的變化曲線緩中略升，臭豆腐顏色無顯著變化。從節(jié)約能源的角度考慮，上色溫度以90 ℃為宜。

2. 1. 4 上色時間對臭豆腐上色效果的影響 從圖4可看出，上色時間對臭豆腐的上色效果有顯著差異，在上色時間15～25 min范圍內(nèi)，隨著上色時間的延長，臭豆腐坯L值逐漸降低，臭豆腐顏色越變越黑;當(dāng)上色時間超過25 min后，臭豆腐坯L值的變化曲線緩中略升，說明硫化鐵的生成和茶多酚的氧化反應(yīng)在浸泡25 min后逐漸達(dá)到飽和。由此可知，最佳上色時間為25 min。

2. 2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，設(shè)計L9（34）正交試驗，考察硫酸亞鐵濃度（A）、茶葉粉用量（B）、上色溫度（C）和上色時間（D）4個因素對臭豆腐上色效果的相互影響，結(jié)果見表2。從表2可知，上色后臭豆腐坯的極差結(jié)果R值排序為B>A>D>C，以茶葉粉用量對上色效果影響最大，上色溫度的影響最小。色差L值越小，臭豆腐顏色越接近黑色，因此取K值最小的水平確定上色工藝最優(yōu)配方為A2B3C3D3，即最佳上色工藝條件為：硫酸亞鐵濃度0.12 g/L、茶葉粉用量7.0 g/L、上色溫度92 ℃、上色時間28 min。

2. 3 驗證試驗結(jié)果

為了驗證正交試驗結(jié)果，按照最佳上色條件對臭豆腐進(jìn)行3次平行試驗，以色差L值為考察指標(biāo)，結(jié)果表明，在硫酸亞鐵濃度0.12 g/L、茶葉粉用量7.0 g/L、上色溫度92 ℃、上色時間28 min的條件下，上色后臭豆腐的色差L值可降至0.90，臭豆腐的顏色黑如墨，受到消費者喜愛。通過正交試驗，可得出臭豆腐的最佳上色工藝，讓臭豆腐安全上色。

2. 4 豆腐浸泡鹵水前后風(fēng)味物質(zhì)的比較

豆腐浸泡鹵水上色前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的結(jié)果如圖5、圖6和表3所示。比較豆腐浸泡鹵水前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)白豆腐坯中具有種類和數(shù)量優(yōu)勢的酯類在豆腐浸泡鹵水后均未檢出;但豆腐浸泡鹵水后的酸類物質(zhì)相對含量大幅增加，尤其是短鏈脂肪酸戊酸，由1.58%增至19.36%;浸泡鹵水后，豆腐的醇類物質(zhì)相對含量有所下降，尤其是正己醇，從49.74%降至25.38%，但總體上，醇類物質(zhì)種類變化不明顯，保證了豆腐浸泡鹵水后的醇香味;浸泡鹵水后，臭豆腐坯的芳香烴類物質(zhì)相對含量增加，且豆腐的4-甲基苯酚和3-甲基吲哚相對含量均有所增加，分別增加5.29%和2.99%（絕對值）。

3 討論

本研究優(yōu)化了臭豆腐上色工藝，通過添加茶葉、合理控制上色溫度和時間，降低了硫酸亞鐵濃度，為臭豆腐的安全上色和生產(chǎn)提供了保障。茶葉上色，主要是由于茶葉中的茶多酚脫氫再逐步聚合而形成茶黃素、茶紅素和茶褐素等色素物質(zhì)（Chen et al.，2001）。由此推測，茶葉水在浸泡臭豆腐坯的過程中發(fā)生氧化，逐步生成茶黃素、茶紅素和茶褐素等，尤其是茶褐素對臭豆腐坯的黑色色澤有重要影響;但當(dāng)茶葉粉用量達(dá)6.0 g/L后，繼續(xù)增加用量，色差L值反而呈上升趨勢，可能與茶葉含量增加，上色過程中茶黃素和茶紅素增加量相對更多而導(dǎo)致色差L值升高，黑色變淺有關(guān)。硫酸亞鐵和茶多酚的上色工藝與上色溫度和時間的關(guān)系密切，上色溫度升高和上色時間延長，使得硫酸亞鐵與發(fā)酵代謝產(chǎn)物生成黑色硫化鐵的作用增強(qiáng)（譚斯亮，2007），茶多酚脫氫再逐步聚合而形成茶褐素的氧化速率加快（Chen et al.，2001），但溫度升高和浸泡時間延長至一定程度（上色溫度達(dá)90 ℃，臭豆腐浸泡時間為25 min時），硫化鐵的生成和茶多酚的氧化反應(yīng)逐漸達(dá)到飽和后，即使繼續(xù)升高上色溫度和延長浸泡時間，臭豆腐坯的上色效果不會再有明顯提升。

比較豆腐浸泡鹵水前后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)差異，發(fā)現(xiàn)在白豆腐坯中具有種類和數(shù)量優(yōu)勢的酯類在豆腐浸泡鹵水后均未檢出，而豆腐浸泡鹵水后的酸類物質(zhì)相對含量大幅增加，可能是由于臭豆腐鹵水中微生物的作用，將酯類代謝為揮發(fā)性脂肪酸等終產(chǎn)物。Abiru等（2013）、Woo等（2015）分別從臺灣臭豆腐鹵水和韓國豆醬中分離鑒定出一些優(yōu)勢細(xì)菌，主要是桿菌、芽孢菌、梭菌及葡萄球菌等，這些優(yōu)勢細(xì)菌也是腸道菌的主要菌種，同時解釋了豆腐浸泡鹵水后酯類物質(zhì)減少，揮發(fā)性脂肪酸類物質(zhì)增加的現(xiàn)象。浸泡鹵水后，豆腐的醇類物質(zhì)相對含量有所下降，但種類變化不明顯，保證了豆腐浸泡鹵水后的醇香味。另外，浸泡鹵水后，豆腐的4-甲基苯酚和3-甲基吲哚相對含量均有所增加。4-甲基苯酚有特殊臭味，有研究表明，臺灣傳統(tǒng)工藝發(fā)酵竹筍的臭味是由4-甲基苯酚產(chǎn)生（Steinhaus and Schieberle，2005;Saito et al.，2018）;3-甲基吲哚又名糞臭素，具有特殊臭味，閾值極低（孫潔雯等，2015;Doemer et al.，2010）。筆者在前期對臭豆腐鹵水的研究中發(fā)現(xiàn)鹵水經(jīng)發(fā)酵后有大量的4-甲基苯酚和3-甲基吲哚產(chǎn)生，推測臭豆腐坯中的4-甲基苯酚和3-甲基吲哚由鹵水中的物質(zhì)（微生物）轉(zhuǎn)移（代謝）所致。這些風(fēng)味物質(zhì)的變化，正賦予了臭豆腐“聞起來臭，吃起來香”的特點。但這些風(fēng)味物質(zhì)如何產(chǎn)生，還需利用現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)進(jìn)一步探究其機(jī)理。

4 結(jié)論

優(yōu)化后的上色工藝可使臭豆腐顏色黑如墨;臭豆腐浸泡鹵水并上色后揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)發(fā)生改變，正是這些風(fēng)味物質(zhì)的變化，賦予了臭豆腐“聞起來臭，吃起來香”的特點。

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（責(zé)任編輯 羅 麗）