乳酸菌復(fù)合制劑對鹽堿地改良及土壤微生物群落的影響

侯景清 王旭 陳玉海 劉逸群 商慶祥 張文羿 孟和畢力格

摘要：【目的】探討乳酸菌復(fù)合制劑對鹽堿地改良、植物生長及土壤微生物群落變化的影響，為利用耐鹽堿的乳酸菌研發(fā)新型微生物制劑及其大面積應(yīng)用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳晕骷t柿為供試作物進(jìn)行田間試驗(yàn)，設(shè)菌劑組（含乳酸菌的菌劑）和對照組（不含乳酸菌的菌劑），兩個處理菌劑用量均為15 L/ha，加水稀釋10倍，在西紅柿種植前1 d噴施于土壤中，并在種植西紅柿后每30 d噴施一次;西紅柿成熟期測定其農(nóng)藝性狀;種植3個月后采集0～30 cm土樣測定土壤的物理性質(zhì)、養(yǎng)分含量及酸堿度，并對土壤樣品進(jìn)行宏基因組測序，分析土壤微生物的多樣性及功能基因的變化?！窘Y(jié)果】與對照組相比，菌劑組的土壤pH顯著下降0.42（P<0.05，下同），銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及有效磷的含量顯著提高，但土壤物理性質(zhì)無顯著變化（P>0.05）;供試西紅柿的各項(xiàng)農(nóng)藝性狀均有所提高。土壤微生物多樣性分析結(jié)果表明，在門分類水平上，共檢測分類122個菌門，其中變形菌門（Proteobacteria）占有明顯優(yōu)勢，相對豐度在50.00%以上，其次為擬桿菌門（Bacteroidetes）和綠彎菌門（Chloroflexi），菌劑組中厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度顯著增加;在屬分類水平上，菌劑組中乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度（4.25%）較對照組（0.01%）明顯增加。功能基因分析結(jié)果表明，菌劑組和對照組的碳水化合物活性酶（CAZy）中，糖苷水解酶（Glycoside hydrolases）的功能基因所占比例最高，分別為35.12%和34.16%，菌劑組6種碳水化合物活性酶基因序列數(shù)目均高于對照組;KEGG功能注釋結(jié)果顯示，菌劑組的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝及輔因子與維他命代謝的基因序列數(shù)目均高于對照組;此外，菌劑組土壤中毒素的基因序列數(shù)目較對照組明顯降低。【結(jié)論】乳酸菌復(fù)合制劑能有效降低鹽堿地的pH并增加養(yǎng)分含量，同時可增加土壤中的放線菌數(shù)量，降低病原微生物數(shù)量，對鹽堿地的改良具有良好效果。

關(guān)鍵詞： 鹽堿地;乳酸菌;微生物菌劑;微生物多樣性;宏基因組學(xué)

中圖分類號： S154.3? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）04-0710-09

Abstract：【Objective】The effects of lactic acid bacteria compound preparation on the improvement of saline-alkali soil，crop growth and soil microbial community change were explore. It provide theoretical basis for the development of new microbial preparations and its large-area application by using salt-tolerant lactic acid bacteria. 【Method】Field experiment was carried out，and the test crops were tomatoes. The tomatoes were divided into treatment group（bacterial agent containing lactic acid bacteria） and control group（bacterial agent without lactic acid bacteria）. The dosage of the two treatment agents was 15 L/ha， diluted 10 times with water， sprayed on the soil 1 d before the planting， and sprayed once every 30 d after planting tomatoes. The agronomic traits were determined at the maturity stage of the tomatoes. After three months of planting， 0-30 cm soil samples were collected to determine the physical properties， nutrient content and pH of the soil， and the soil samples were subjected to metagenomic sequencing to analyze soil microbial diversity and functional gene changes. 【Result】Compared to control， in the treatment group，the pH value of the soil decreased significantly by 0.42（P<0.05， the same below），and the contents of available phosphorus，ammonium nitrogen and nitrate nitrogen were all increased，and the physical properties of the soil were not significantly changed（P>0.05）. The agronomic traits of the tested tomatoes have improved. The soil microbial diversity analysis indicated that， at phylum level，there were 122 bacteria phylum detected and classified，among these，Proteobacteria? had a clear superiority with 50.00% relative abundance，and followed by Bacteroidetes and and Chloroflexi. Significant increase in relative abundance of Firmicutes and Actinobacteria in treatment group was observed. At genus level，the relative abundance of Lactobacillus（4.25%） in the treatment group increased significantly compared to control（0.01%）. The functional gene analysis showed that， as for carbohydrates active enzyme（CAZy） in treatment group? and control group，the? proportion of functional genes of glycoside hydrolases were the highest， and were 35.12% and 34.16% in the two groups respectively.? The number of six carbohydrate active enzyme gene sequences in the treatment group? was higher than the control group. In the KEGG functional annotation results，the number of gene sequences for carbohydrate metabolism，amino acid metabolism，energy metabolism，metabolism of cofactors and vitamins in the treatment group was higher than the control group. In addition，the number of gene sequences of toxin in the soil was significantly reduced in treatment group. 【Conclusion】The lactic acid bacteria compound preparation can effectively reduce the pH value of the saline-alkali soil and increase the nutrient content. At the same time，it can increase the number of actinomycetes in the soil，reduce the number of pathogenic microorganisms. It has a good effect on the improvement of saline-alkali soil.

Key words： saline-alkali soil; lactic acid bacteria; microbial agents; microbial diversity; metagenomics

0 引言

【研究意義】土壤鹽堿化作為我國較嚴(yán)峻的農(nóng)業(yè)問題已受到廣泛關(guān)注，我國鹽堿地面積約9.91×107 ha，約占全國土地面積的十分之一（朱建峰等，2018）。大面積的鹽堿化土壤不僅嚴(yán)重浪費(fèi)土地資源，還會帶來水土流失、土地荒漠化等一系列環(huán)境問題。長期以來，鹽堿地的改良主要通過物理、水利及化學(xué)改良劑等傳統(tǒng)改良方法（馬晨等，2010;呂建東等，2018）。隨著人們對生態(tài)平衡和可持續(xù)發(fā)展的重視，生物改良措施成為鹽堿地改良的重點(diǎn)與熱點(diǎn)，其中微生物復(fù)合制劑在鹽堿地改良中發(fā)揮較大作用。微生物復(fù)合制劑可有效降低鹽堿地的pH及含鹽量，提高土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量，還可提高農(nóng)作物的成活率與產(chǎn)量（Bossuyt et al.，2001;Singh and Reddy，2011）。乳酸菌復(fù)合制劑作為一種新型微生物制劑，在提高土壤肥力、促進(jìn)植物生長及預(yù)防土傳病害等方面具有巨大潛力（高鵬飛等，2014）。因此，探討乳酸菌復(fù)合制劑對鹽堿地改良與土壤微生物群落的影響，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中緩解土壤鹽堿化、減少使用化肥、提高農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，土壤中施用的微生物復(fù)合制劑菌種主要以放線菌、固氮菌、芽孢桿菌、酵母菌、乳酸菌及光合菌為主，諸多研究表明乳酸菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有良好效果。Chen等（2005）從果樹土壤中分離鑒定出植物乳桿菌、乳酸乳球菌乳酸亞種、副干酪乳桿菌及短乳桿菌，并證明其對土壤致病菌的防治有積極作用。Bhakta等（2012）發(fā)現(xiàn)乳酸菌對土壤中的重金屬（鉛、鎘）具有良好的吸附作用。Gajbhiy等（2012）從石榴中分離出200株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)其中有142株對禾谷鐮刀菌有較好的抑制特性。Wang等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌IMAU10014能產(chǎn)生苯乳酸等并抑制炭疽病菌、桔青霉菌、尖孢鐮刀菌等常見的果蔬腐敗菌與病害菌。Zlotnikov等（2013）從不同地區(qū)不同季節(jié)的蒔蘿葉面分離出4株乳酸菌，并證明這些乳酸菌可有效溶解土壤中的磷類礦物質(zhì)。周游等（2017a，2017b）研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌制劑可有效增加草莓的株高、莖粗及葉面積，并顯著改善草莓品質(zhì);對茶樹的生長及茶葉品質(zhì)也具有良好的促進(jìn)作用。黃詩宸等（2018）研究發(fā)現(xiàn)，使用植物乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖浸種可顯著提高水稻幼苗的生長特性及葉綠素含量?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】乳酸菌是一種非致病性、安全級的微生物，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中乳酸菌復(fù)合制劑主要用于降解重金屬和農(nóng)藥殘留，以及抑制致病菌和腐敗菌的增殖，但目前關(guān)于乳酸菌復(fù)合制劑在改良鹽堿地方面的相關(guān)研究相對較少。【擬解決的關(guān)鍵問題】將乳酸菌復(fù)合制劑噴施于蔬菜葉面及根部土壤，結(jié)合土壤理化指標(biāo)及土壤微生物宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)，分析乳酸菌復(fù)合制劑對土壤成分及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響，以期為抗鹽堿乳酸菌制劑在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)菌劑組使用的乳酸菌復(fù)合制劑為益生源生物科技公司（山東青島）生產(chǎn)的農(nóng)豐園微生物菌劑，主要成分為乳酸菌（干酪乳桿菌Zhang、植物乳桿菌P-8和植物乳桿菌PC30301）及其代謝產(chǎn)物（乳酸、甲酸、乙酸、胞外多糖及細(xì)菌素等），活菌數(shù)≥2×108 CFU/mL，同時含有少量的鐵、錳、鋅、銅及黃腐酸。對照組使用不含乳酸菌的菌劑，其中僅有少量的鐵、錳、鋅、銅及黃腐酸，無乳酸菌及其代謝產(chǎn)物，由益生源生物科技公司（山東青島）提供。供試作物為西紅柿。

1. 2 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古呼和浩特市土默特左旗海流圖試驗(yàn)種植基地（東經(jīng)111°22′30″、北緯40°41′30″）。年降水量200～400 mm，年平均氣溫7～8 ℃，土壤鹽分類型以硫酸鈉、氯化鈉和碳酸鈉為主，土壤質(zhì)地為黏土，土壤的三相比（氣相、固相和液相）分別為56.85%、29.45%和13.70%，土壤pH 9.25，有效磷45.3 mg/kg，銨態(tài)氮1.4 mg/kg，硝態(tài)氮23.4 mg/kg，屬于鹽化堿土壤。

1. 3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)設(shè)2個處理：菌劑組，含乳酸菌的菌劑15 L/ha;對照組，不含乳酸菌的菌劑15 L/ha。兩處理均對水10倍稀釋后噴施。每處理重復(fù)6次。小區(qū)為長方形，長寬比約3∶1，面積60 m2。隨機(jī)區(qū)組排列，共12個小區(qū)。

乳酸菌復(fù)合制劑在西紅柿種植前1 d噴施于土壤中，并在種植西紅柿后每30 d噴施一次（根據(jù)產(chǎn)品說明），噴施于西紅柿根部土壤與葉面。土壤采樣時間為西紅柿種植3個月后，采用S形布點(diǎn)采取植株根部土壤，用土鉆采集0～30 cm的土樣，每小區(qū)取5個點(diǎn)的土樣，過篩除去根系及雜物。約500 g的土樣置于滅菌袋，4 ℃冰箱保存，用于土壤三相比測定及土壤DNA提取;300 g土樣進(jìn)行風(fēng)干，用于土壤養(yǎng)分與酸堿度測定。

1. 4 測定項(xiàng)目及方法

1. 4. 1 土壤理化性質(zhì)測定 土壤pH采用5∶1的水土比懸液，使用pH計(jì)測定;土壤三相比和土壤總孔隙度使用土壤三相儀測定;土壤養(yǎng)分（銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和有效磷）使用連續(xù)流動分析儀測定。

1. 4. 2 西紅柿農(nóng)藝性狀測定 在西紅柿成熟后測量各小區(qū)西紅柿的農(nóng)藝性狀，包括株高、莖粗、葉面積、單株果實(shí)數(shù)及單株產(chǎn)量。株高和莖粗分別用卷尺和游標(biāo)卡尺測量，其中，株高為地面到頂端心葉的植株高度，莖粗為距離地面5 cm處主莖的直徑;葉面積為每株西紅柿完全展開的未枯黃葉片面積。

1. 4. 3 宏基因組測序 使用試劑盒（PowerSoil? DNA Isolation Kit）提取土壤宏基因組DNA，在提取過程中將相同處理的土樣合并為一個DNA樣品，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA。合格的DNA樣品進(jìn)行測序，測序平臺為Illumina Hiseq。

數(shù)據(jù)分析從下機(jī)原始序列開始，首先對原始序列進(jìn)行拆分、質(zhì)量剪切及去除污染等優(yōu)化處理，然后使用優(yōu)化序列進(jìn)行拼裝組裝和基因預(yù)測。測序數(shù)據(jù)上傳至NCBI，核苷酸序列登錄號為PRJANA494987。

1. 4. 4 土壤微生物多樣性分析 應(yīng)用QIIME （V1.7.0）平臺對高質(zhì)量序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。首先采用PyNAST將序列校準(zhǔn)排齊后，在97%相似性下進(jìn)行Uclust歸類并劃分分類操作單元（Operational taxonomic units，OUT）;從各OTU中選取1條代表性序列，使用RDP（Ribosomal database project）、Greengenes（V13.8）和Silva（Livingtree project）數(shù)據(jù)庫對其進(jìn)行序列同源性比對，整合3個數(shù)據(jù)的比對結(jié)果確定各OTU的分類學(xué)地位;根據(jù)OTU列表中的各樣品物種豐度情況，應(yīng)用QIIME中的Summarize_taxa.py命令計(jì)算各樣品在門、綱、目、科、屬、種水平的物種組成，根據(jù)研究內(nèi)容需求只繪制門與屬水平上的分類柱狀圖。

1. 4. 5 宏基因組功能預(yù)測 對得到的基因進(jìn)行功能上的注釋及分類，所用到的數(shù)據(jù)庫包括KEGG、CAZy和VFDB，并對比對結(jié)果繪制功能基因的分類柱狀圖。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，利用Origin 2018進(jìn)行方差分析及制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 乳酸菌復(fù)合制劑對土壤理化性質(zhì)的影響

2. 1. 1 乳酸菌復(fù)合制劑對土壤結(jié)構(gòu)的影響 如圖1所示，菌劑組土壤的氣、固、液三相比分別為57.74%、28.90%和13.36%，對照組土壤的氣、固、液三相比分別為58.46%、29.71%和11.83%，二者的土壤總孔隙度分別為71.10%和70.28%，各指標(biāo)在兩處理間均未達(dá)顯著差異水平（P>0.05，下同）。

2. 1. 2 乳酸菌復(fù)合制劑對土壤酸堿度的影響 如圖2所示，菌劑組土壤pH為8.48，較對照組土壤pH下降0.42，二者差異顯著（P<0.05，下同）。說明施用乳酸菌復(fù)合制劑能明顯緩解土壤的鹽堿化程度。

2. 1. 3 乳酸菌復(fù)合制劑對土壤有效氮、磷含量的影響 由表1可知，施用乳酸菌劑后，土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮及有效磷含量較對照組顯著提高，尤其是有效磷含量較對照組增加187.78%。

2. 2 乳酸菌復(fù)合制劑對植物生長的影響

待西紅柿植株成熟后，分別測量兩組西紅柿植株的農(nóng)藝性狀。由表2可知，菌劑組西紅柿成熟期的株高、莖粗、葉面積及單株產(chǎn)量均較對照組顯著增加，增幅分別為14.6%、22.2%、27.3%和25.4%;單株果實(shí)數(shù)也較對照組有所增加，但差異未達(dá)顯著水平。

2. 3 土壤微生物群落多樣性分析結(jié)果

2. 3. 1 門分類水平分析 由圖3可看出，在門分類水平上，共檢測分類122個菌門，其中相對豐度最高的是變形菌門（Proteobacteria），在50.00%以上，表明變形菌門細(xì)菌為優(yōu)勢菌群，在各樣本微生物群落結(jié)構(gòu)中占主導(dǎo)地位;其次是擬桿菌門（Bacteroidetes），相對豐度在12.00%～15.00%;綠彎菌門（Chloroflexi）的相對豐度在5.00%～7.00%;其余如酸桿菌門（Aci-dobacteria）、芽單胞菌（Gemmatimonadetes）、浮霉菌門（Planctomycetes）的相對豐度均小于5.00%。菌劑組中厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度明顯增加，分別為6.12%和6.59%，而對照組厚壁菌門和放線菌門的相對豐度僅為1.59%和3.45%。

2. 3. 2 屬分類水平分析 從圖4可看出，不同土壤樣品中相對豐度占60.00%以上的均為未知菌屬;菌劑組中乳桿菌屬（Lactobacillus）的相對豐度達(dá)4.25%，而對照組中乳桿菌屬的相對豐度較低，僅為0.01%，說明施用乳酸菌復(fù)合制劑可增加土壤中乳桿菌屬的相對豐度;藤黃單細(xì)胞菌屬（Luteimonas）的相對豐度也發(fā)生變化，對照組為1.68%，而菌劑組為0.84%，降低了50.00%;對照組交替赤桿菌屬（Altererythrobacter）的相對豐度為2.56%，菌劑組較對照組有所下降，為1.54%;菌劑組和對照組黏細(xì)菌中堆囊菌屬（Sorangium）的相對豐度均在3.00%～5.00%，其余菌屬的相對豐度無明顯變化。

2. 4 功能基因分析結(jié)果

2. 4. 1 碳水化合物活性酶（CAZy）分析 將宏基因組序列比對結(jié)果輸入到CAZy數(shù)據(jù)庫，共獲得6種碳水化合物活性酶基因類群（圖5），分別為糖苷水解酶（Glycoside hydrolases）、糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyl transferases）、多糖裂解酶（Polysaccharide lyases）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate esterases）、輔助酶（Auxiliary activities）和碳水化合物結(jié)合模塊（Carbohydrate-binding modules）。其中，糖苷水解酶的功能基因序列所占比例最高，菌劑組與對照組分別為35.12%和34.16%;其次是糖基轉(zhuǎn)移酶和碳水化合物結(jié)合模塊，菌劑組與對照組分別為25.98%、19.69%和22.95%、21.28%;菌劑組中6種碳水化合物活性酶的基因序列數(shù)目均高于對照組。

2. 4. 2 VFDB毒力因子分析 為確定乳酸菌復(fù)合制劑對病原微生物的影響，通過VFDB數(shù)據(jù)庫比對得到4種進(jìn)攻性毒力因子（圖6），分別為分泌系統(tǒng)（Secretion system）、粘附（Adherence）、入侵（Invasion）和毒素（Toxin）。其中，分泌系統(tǒng)的基因序列所占比例最高，菌劑組和對照組分別為45.32%和45.28%;其次是粘附，菌劑組和對照組分別為41.17%和42.28%。菌劑組所預(yù)測到毒力因子的基因序列數(shù)均少于對照組，對照組中的毒素基因序列數(shù)為11574，而菌劑組的毒素基因序列數(shù)為8820，即土壤的毒力因子有所降低。

2. 4. 3 KEGG功能分析 使用BLASTP將非冗余基因集序列與KEGG的基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，根據(jù)比對結(jié)果使用KOBAS 2.0進(jìn)行功能注釋，預(yù)測到12種代謝功能的基因序列（圖7）。其中，碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）的功能基因序列占比最高，菌劑組和對照組分別為17.31%和17.12%;其次是氨基酸代謝（Amino acid metabolism）、能量代謝（Energy metabolism）和輔因子與維他命代謝（Metabolism of cofactors and vitamins）。對4種基因序列占比最高的代謝功能基因繪制柱狀圖，如圖8所示，可發(fā)現(xiàn)菌劑組中4種代謝功能的基因序列數(shù)目均較對照組有明顯增加。

3 討論

3. 1 乳酸菌復(fù)合制劑對土壤理化性質(zhì)及植物生長的影響

土壤三相比和總孔隙度作為決定土壤結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo)，在保水保肥、提高土壤養(yǎng)分方面具有重要意義（Vogel and Roth，2001）。研究發(fā)現(xiàn)，可通過施用活性炭、秸稈還田及深耕等理化方法改善土壤物理性質(zhì)，但微生物改良措施對土壤的物理性質(zhì)無顯著影響（丁奠元等，2018;張聰?shù)龋?018）。本研究結(jié)果同樣表明，施用乳酸菌復(fù)合制劑后，土壤的三相比和總孔隙度等物理性質(zhì)與對照組無顯著差異;但與對照組相比，菌劑組土壤pH顯著降低，與王維華（2018）的研究結(jié)果一致，表明乳酸菌可通過產(chǎn)生有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物來降低土壤pH，進(jìn)而改善土壤鹽堿化的情況。

銨態(tài)氮和硝態(tài)氮均是可直接被植物吸收利用的速效性氮素。本研究結(jié)果表明，施用乳酸菌劑后，土壤中兩種速效性氮源均顯著增加，可能是菌劑提高了土壤中脲酶的活性（艾童非等，2016），脲酶將土壤中的尿素分解為CO2、H2O和NH[+4]，NH[+4]通過細(xì)菌作用轉(zhuǎn)化為NO[-3]并釋放出H+，在降低土壤pH的同時可提供氮源。土壤中的有效磷是一種可被植物吸收利用的磷成分，包括所有水溶性磷、部分吸附態(tài)磷及有機(jī)態(tài)磷，有的土壤中還包括某些沉淀態(tài)磷（Selles et al.，2011）。本研究結(jié)果表明，乳酸菌復(fù)合制劑具有良好的解磷效果，可使土壤速效磷含量大幅度增加，與馬海林等（2013）的研究結(jié)果相同。乳酸菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)生多種有機(jī)酸，主要包括乳酸、乙酸、檸檬酸及苯乳酸等，這些酸在降低土壤pH的同時與鐵、鋁、鈣、鎂等離子結(jié)合，從而使難溶性磷酸鹽溶解。也有研究認(rèn)為，微生物解磷機(jī)制是磷酸鹽與質(zhì)子的交換作用，乳酸菌在代謝活動中產(chǎn)生大量質(zhì)子，使介質(zhì)酸度升高從而溶解磷酸鹽。乳酸菌在解磷過程中可能存在酶促作用，Harishankar等（2013）發(fā)現(xiàn)L. fermentum和L. lactis均能產(chǎn)生有機(jī)磷磷酸酶（OPP），該酶可水解有機(jī)磷化合物釋而放出磷酸鹽。本研究中施用菌劑后，西紅柿的各項(xiàng)農(nóng)藝性狀均有所提高，也證明乳酸菌復(fù)合制劑能在有效增加土壤養(yǎng)分含量的同時，改善鹽堿地的不良環(huán)境并促進(jìn)植物生長，與周游等（2017a）的研究結(jié)果一致。

3. 2 乳酸菌復(fù)合制劑對土壤微生物多樣性的影響

本研究中，在門分類水平上，土壤微生物群落的優(yōu)勢菌門與Shen等（2013）研究結(jié)果相似。有研究表明，變形菌門的相對豐度與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)，其較高的相對豐度可能與土壤中有機(jī)質(zhì)含量增加有關(guān)（Zeng et al.，2016）。放線菌門的相對豐度也有明顯提高，放線菌適合在弱堿性土壤中生存，菌劑能有效降低土壤pH，因此放線菌的數(shù)量有所提升;趙卉琳等（2008）研究認(rèn)為土壤中有效氮和有效磷含量與放線菌的數(shù)量和種類呈顯著正相關(guān)。因此，土壤養(yǎng)分含量提高也可能是放線菌數(shù)量增加的原因之一。此外，鹽堿土壤樣品中含有酸桿菌門，這是一類廣泛存在于各種生境內(nèi)的菌，在碳循環(huán)中發(fā)揮重要作用（Lladó et al.，2016），其相對豐度可隨演替時間的增長而增加（Lozano et al.，2014）。

在屬分類水平上，乳桿菌屬的相對豐度有明顯提升，可能是由于菌劑中大量乳桿菌的引入增加了土壤中乳桿菌含量。此外，藤黃單細(xì)胞菌屬、交替赤桿菌屬的相對豐度顯著減少。交替赤桿菌屬是屬于紅細(xì)菌科的一個菌屬，張建峰等（2017）的研究表明該菌屬具有耐鹽堿的能力，適宜在堿性條件下生存，乳酸菌復(fù)合劑具有降低土壤pH的效果，推測乳酸菌抑制了交替赤桿菌屬的生長，因此其相對豐度降低。藤黃單細(xì)胞菌屬是2000年首次發(fā)現(xiàn)的一種菌屬（Finkmann et al.，2000），屬于黃單細(xì)胞科，Narihiro等（2004）發(fā)現(xiàn)從固體肥料堆肥混合物中分離得到的Luteimonas sp. strain TUT1238具有較強(qiáng)的蛋白水解活性，因此推測施用乳酸菌復(fù)合制劑對其具有一定抑制生長的作用。

3. 3 乳酸菌復(fù)合制劑對土壤微生物功能基因的影響

碳水化合物作為土壤中重要成分之一，主要來源于植物和土壤微生物。不僅是有氧呼吸的主要能源物質(zhì)，還具有重要的生理功能（郭景恒等，2000）。本研究結(jié)果表明，施用乳酸菌劑后，土壤中碳水化合物活性酶的含量均顯著升高，既意味著土壤中碳元素的利用率升高，也標(biāo)志著土壤微生物代謝活動的增強(qiáng)，與Andrade等（2017）的研究結(jié)果相似。其中，基因序列數(shù)最高的為糖苷水解酶，該酶具有水解碳水化合物之間糖苷鍵或碳水化合物與非碳水化合物之間糖苷鍵的功能（Davies and Henrissat，1995），糖苷水解酶含量的增加有助于提高土壤中單糖的含量，從而為土壤微生物的活動提供更多的能量。

土傳病害一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中不可忽視的問題，目前生物防治手段已成為防控土傳病害的研究熱點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，施用乳酸菌菌劑后，毒素的基因序列數(shù)目由原來的11574下降到8820，證明土壤中的病原微生物含量有所降低，說明乳酸菌復(fù)合制劑具有抑制病原微生物的作用，與許筱等（2012）發(fā)現(xiàn)乳酸菌對黃瓜炭疽病菌、煙草赤星病菌、玉米大斑病菌及黃瓜灰霉病菌具有良好的抑菌效果，Shrestha等（2009）發(fā)現(xiàn)乳酸菌KLF01對青枯病菌具有良好抑制作用的研究結(jié)果相似。

微生物參與自然界的物質(zhì)與能量循環(huán)，在土壤形成及肥力改善上有至關(guān)重要的作用。對測序結(jié)果進(jìn)行KEGG功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，鹽堿地土壤微生物具有較高豐度的碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝的功能基因類群，與Souza等（2015）的研究結(jié)果類似。眾所周知，微生物在碳循環(huán)過程中既是生產(chǎn)者也是分解者，施用菌劑后微生物的碳水化合物代謝強(qiáng)度明顯提升，有利于分解土壤中腐敗植物的纖維素、半纖維素、淀粉等，加快碳循環(huán)為微生物與農(nóng)作物的生長提供更多的碳源。其次，預(yù)測到的能量代謝基因序列數(shù)目也有明顯增加，說明施用菌劑后土壤中微生物的分解與合成代謝更旺盛，有助于土壤中有機(jī)質(zhì)分解速度加快并釋放出更多養(yǎng)分，同時微生物對逆境脅迫和干擾環(huán)境有較強(qiáng)的適應(yīng)性（Fierer et al.，2012;Tripathi et al.，2017）。此外，微生物代謝旺盛能產(chǎn)生更多的分泌物，降低土壤pH并與金屬離子結(jié)合，活化更多的磷、鉀養(yǎng)分元素。吳雪楠等（2016）研究發(fā)現(xiàn)土壤微生物的能量代謝與土壤理化性質(zhì)顯著相關(guān)，土壤微生物旺盛的能量代謝可提高土壤養(yǎng)分含量;同時發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥用量與土壤微生物的能量代謝呈負(fù)相關(guān)。本研究中所用乳酸菌復(fù)合制劑是一種綠色健康的新型微生物制劑，因此無該副作用。

綜上所述，乳酸菌復(fù)合制劑可有效增加土壤養(yǎng)分、降低土壤pH并改變微生物群落的組成和多樣性。Samad等（2016）的研究結(jié)果表明，土壤pH可控制N2O還原酶的組裝并改變一般表達(dá)模式及選擇性，在影響微生物群落組成變化的同時，間接影響土壤中功能基因的豐度和類型。但乳酸菌作為微生物復(fù)合制劑中的菌種，其作用還較單一。因此，今后還應(yīng)選擇配合其他常用菌種進(jìn)行更深入的研究。

4 結(jié)論

乳酸菌復(fù)合制劑可有效增加土壤養(yǎng)分、降低土壤pH并改變微生物群落的組成和多樣性，適宜在鹽堿地改良中施用，該結(jié)論可為利用耐鹽堿的乳酸菌研發(fā)新型微生物復(fù)合制劑及大面積應(yīng)用提供參考依據(jù)，也為使用生物措施改良鹽堿地提供了新思路。

參考文獻(xiàn)：

艾童非，楊鵬九，費(fèi)洪波，王紫瀅，郭振楠. 2016. 微生物菌劑有機(jī)肥對植煙土壤環(huán)境及烤煙產(chǎn)質(zhì)量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（18）：99-102. [Ai T F，Yang P J，F(xiàn)ei H B，Wang Z Y，Guo Z N. 2016. Effect of applying microbial inoculum organic fertilizer on tobacco growing soil environment and yield，quality of flue-cured tobacco[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，44（18）：99-102.]

丁奠元，趙英，方圓， 馮浩. 2018. 活性炭對農(nóng)田土壤孔隙結(jié)構(gòu)的影響[J]. 干旱地區(qū)農(nóng)業(yè)研究，36（1）：36-42. [Ding D Y，Zhao Y，F(xiàn)ang Y，F(xiàn)eng H. 2018. Effect of addition of activated carbon on soil pore structure[J]. Agricultural Research in the Arid Areas，36（1）：36-42.]

高鵬飛，姚國強(qiáng)，趙樹平，王曉偉，崔景麗，張和平. 2014. 乳酸菌在農(nóng)產(chǎn)品種植及其質(zhì)量安全中的研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，16（6）：143-148. [Gao P F，Yao G Q，Zhao S P，Wang X W，Cui J L，Zhang H P. 2014. Research progress on lactic acid bacteria in agricultural product production and quality safety[J]. Journal of Agricultural Science and Technology，16（6）：143-148.]

郭景恒，樸河春，劉啟明. 2000. 碳水化合物在土壤中的分布特征及其環(huán)境意義[J]. 地質(zhì)地球化學(xué)，28（2）：59-64. [Guo J H，Piao H C，Liu Q M. 2000. The distribution and environmental effect of carbohydrate in soil[J]. Geo-logy-Geochemistry，28（2）：59-64.]

黃詩宸，王清，張文平. 2018. 乳酸菌多糖對水稻種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，30（4）：59-62. [Huang S C，Wang Q，Zhang W P. 2018. Effect of lactic acid bacteria polysaccharide on rice seed germination and seedling growth[J]. Journal of Jiangxi Agricultural Scien-ces，30（4）：59-62.]

呂建東，馬帥國，田蓉蓉，田蕾，胡慧，王娜，陳亞萍，普正菲，董艷，王彬. 2018. 脫硫石膏改良鹽堿土對水稻產(chǎn)量及其相關(guān)性狀的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，47（12）：20-27. [Lü J D，Ma S G，Tian R R，Tian L，Hu H，Wang N，Chen Y P，Pu Z F，Dong Y，Wang B. 2018. Effects of desulfuri-zed gypsum on rice yield and its related traits in saline-alkali soil[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，47（12）：20-27.]

馬晨，馬履一，劉太祥，左海軍，張博，劉寅. 2010. 鹽堿地改良利用技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 世界林業(yè)研究，23（2）：28-32. [Ma C，Ma L Y，Liu T X，Zuo H J，Zhang B，Liu Y. 2010. Research progress on saline land improvement technology[J]. World Forestry Research，23（2）：28-32.]

馬海林，杜秉海，邢尚軍，丁延芹，劉方春，姚良同，馬丙堯，杜振宇. 2013. 解磷、解鉀根際促生菌的篩選與鑒定[J]. 山東林業(yè)科技，43（6）：1-4. [Ma H L，Du B H，Xing S J，Ding Y Q，Liu F C，Yao L T，Ma B Y，Du Z Y. 2013. Screening and identification of plant growth-promoting rhizobacteria with the ability of phosphate-dissolving or potassium-dissolving[J]. Journal of Shandong Forestry Science and Technology，43（6）：1-4.]

王維華，趙金山，劉華偉，李海梅，鄒曉霞. 2018. 乳酸菌肥對不同鹽脅迫下土壤微生物的影響[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，50（4）：48-51. [Wang W H，Zhao J S，Liu H W，Li H M，Zou X X. 2018. Effects of lactic acid bacteria fertilizer on soil microorganisms under different salt stress[J]. Shandong Agricultural Sciences，50（4）：48-51.]

吳雪楠，孫菁菁，羅園園，劉文娟，姚俊. 2016. 草甘膦對土壤微生物能量代謝的影響[J]. 化學(xué)與生物工程，33（4）：18-21. [Wu X N，Sun J J，Luo Y Y，Liu W J，Yao J. 2016. Effect of glyphosate on energy metabolism of soil microorganisms[J]. Chemistry & Bioengineering，33（4）：18-21.]

許筱， 施艷， 高書峰，王振躍. 2012. 拮抗乳酸菌的篩選及其對黃瓜炭疽病的防治效果[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，41（5）：87-91. [Xu X，Shi Y，Gao S F，Wang Z Y. 2012. Screening of antagonistic lactic acid bacteria and its control effect on collectotrchum orbiculare[J]. Journal of Henan Agricultural Science，41（5）：87-91.]

張聰，慕平，尚建明. 2018. 長期持續(xù)秸稈還田對土壤理化特性、酶活性和產(chǎn)量性狀的影響[J]. 水土保持研究，25（1）：92-98. [Zhang C，Mu P，Shang J M. 2018. Effects of long-term continuous straw returning on soil physical and chemical properties，enzyme activities and yield traits[J]. Research of Soil and Water Conservation，25（1）：92-98.]

張建峰，吉麗，王佳琦，田磊，孔鈺鳳，田春杰. 2017. 鹽堿脅迫對大豆根際細(xì)菌群落多樣性的影響[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，39（3）：262-269. [Zhang J F，Ji L，Wang J Q，Tian L，Kong Y F，Tian C J. 2017. Effects of saline alkali stress on diversity of bacterial community inrhizosphere soil of soybean[J]. Journal of Jilin Agricultural University，39（3）：262-269.]

趙卉琳，來航線，馮昌增，田浩. 2008. 新疆部分地區(qū)鹽堿荒漠化土壤養(yǎng)分及放線菌區(qū)系組成[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，17（1）：161-166. [Zhao H L，Lai H X，F(xiàn)eng C Z，Tian H. 2008. Nutrient contents and actinomycetes populations of desert saline-alkali soil in parts regions of Xinjiang[J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica，17（1）：161-166.]

周游，李海梅，趙金山，李士美，鄒曉霞. 2017a. 乳酸菌對草莓生長和品質(zhì)性狀的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，33（5）：1124-1128. [Zhou Y，Li H M，Zhao J S，Li S M，Zou X X. 2017a. Effects of lactic acid bacteria on the growth and quality characters of strawberry[J]. Jiangsu Journal of A-gricultural Sciences，33（5）：1124-1128.]

周游，趙金山，李海梅，李士美. 2017b. 乳酸菌對茶樹生長和品質(zhì)性狀的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，29（10）：31-34. [Zhou Y，Zhao J S，Li H M，Li S M. 2017b. Effects of lactic acid bacteria on growth and quality characters of tea（Camellia sinensis）[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，29（10）：31-34.]

朱建峰，崔振榮，吳春紅，鄧丞，陳軍華，張華新. 2018. 我國鹽堿地綠化研究進(jìn)展與展望[J]. 世界林業(yè)研究，31（4）：70-75. [Zhu J F，Cui Z R，Wu C H，Deng C，Chen J H，Zhang H X. 2018. Research advances and prospect of saline and alkali land greening in China[J]. World Forestry Research，31（4）：70-75.]

Andrade A C，F(xiàn)róes A，Lopes F á C，Thompson F L，krüger R H，Dinsdale E，Bruce T. 2017. Diversity of microbial carbohydrate-active enZYmes（CAZYmes） associated with freshwater and soil samples from Caatinga Biome[J]. Microbial Ecology，74（1）：89-105.

Bhakta J N，Ohnishi K，Munekage Y，Iwasaki K，Wei M Q. 2012. Characterization of lactic acid bacteria-based probio-tics as potential heavy metal sorbents[J]. Journal of Applied Microbiology，112（6）：1193-1206.

Bossuyt H，Denef K，Six J，F(xiàn)rey S D，Merchx R，Paustian K. 2001. Influence of microbial popu-lations and residue quality on aggregate stability[J]. Applied Soil Ecology，16（3）：195-208.

Chen Y S， Yanagida F， Shinohara T. 2005. Isolation and identification of lactic acid bacteria from soil using an enrichment procedure[J]. Letters in Applied Microbiology，40（3）：195-200.

Davies G，Henrissat B. 1995. Structures and mechanisms of glycosyl hydrolases[J]. Structure，3（9）：853-859.

Fierer N， Leff J W， Adams B J，Nielsen U N，Bates S T，Lauber C L，Owens S，Gilbert J A，Wall D H，Caporaso J G. 2012. Cross-biome metagenomic analyses of soil microbial communities and their functional attributes[J]. Pro-ceedings of the National Academy of Sciences of the Uni-ted States of America，109（52）：21390-21395.

Finkmann W， Altendorf K， Stackebrandt E，Lipski A. 2000. Characterization of N2O-producing Xanthomonas-like isolates from biofilters as Stenotrophomonas nitritireducens sp. nov.，Luteimonas mephitis gen. nov.，sp. nov. and Pseudoxanthomonas broegbernensis gen. nov.，sp. nov.[J]. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology，50（1）：273-282.

Gajbhiye M，Prakash D，Jagdale S，Ahiwale S，Patil N，Kapadnis B. 2012. Pomegranate borne fungicidal lactic acid bacteria and their biodiversity[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，India Section B：Biological Sciences，82（3）：413-419.

Harishankar M K，Sasikala C，Ramya M. 2013. Efficiency of the intestinal bacteria in the degradation of the toxic pesticide，chlorpyrifos[J]. 3 Biotech，3（2）：137-142.

Lladó S，?if?áková L，Větrovsky T，Eichlerova I，Baldrian P. 2016. Functional screening of abundant bacteria from acidic forest soil indicates the metabolic potential of Acido-bacteria subdivision 1 for polysaccharide decomposition[J]. Biology & Fertility of Soils，52（2）：251-260.

Lozano Y M，Hortal S，Armas C，Pugnaire F I. 2014. Interactions among soil，plants，and microorganisms drive secon-dary succession in a dry environment[J]. Soil Biology & Biochemistry，78：298-306.

Narihiro T， Takebayashi T， Hiraishi A. 2004. Activity and phylogenetic composition of proteolytic bacteria in mesophilic fed-batch garbage composters[J]. Microbes and Environments，19（4）：292-300.

Samad M S，Biswas A，Bakken L R，Clough T J，de klein C A M，Richards K G，Lanigan G J，Morales S E. 2016. Phylogenetic and functional potential links pH and N2O emissions in pasture soils[J]. Scientific Reports，6：35990.

Selles F，Campbell C A，Zentner R P，Curtin D，James D C，Basnyat P. 2011. Phosphorus use efficiency and long-term trends in soil available phosphorus in wheat production systems with and without nitrogen fertilizer[J]. Canadian Journal of Soil Science，91（1）：39-52.

Shen C C，Xiong J B，Zhang H Y，F(xiàn)eng Y Z，Lin X G，Li X Y，Liang W J，Chu H Y. 2013. Soil pH drives the spatial distribution of bacterial communities along elevation on Changbai Mountain[J]. Soil Biology & Biochemistry，57：204-211.

Shrestha A，Choi K，Lim C K，Hur J H. 2009. Antagonistic effect of Lactobacillus sp. strain KLF01 against plant pathogenic bacteria ralstonia solanacearum[J]. Pesticide Science（Korea），13（1）：45-53.

Singh H，Reddy M S. 2011. Effect of inoculation with phosphate solubilizing fungus on growth and nutrient uptake of wheat andmaize plants fertilized with rock phosphate in alkaline soils[J]. European Journal of Soil Biology，47（1）：30-34.

Souza R C，Hungria M，Cant?o M E，Vasconcelos A T R，Nogueira M A，Vicente V A. 2015. Metagenomic analysis reveals microbial functional redundancies and specifici-ties in a soil under different tillage and crop-management regimes[J]. Applied Soil Ecology，86：106-112.

Tripathi B M， Moroenyane I，Sherman C，Lee Y K，Adams J M，Steinberger Y. 2017. Trends in taxonomic and functional composition of soil microbiome along a precipitation gradient in israel[J]. Microbial Ecology，74（1）：1-9.

Vogel H J，Roth K. 2001. Quantitative morphology and network representation of soil pore structure[J]. Advances in Water Resources，24（3-4）：233-242.

Wang H K，Yan Y H，Wang J M，Zhang H P，Qi W. 2012. Production and characterization of antifungal compounds produced by Lactobacillus plantarum IMAU10014[J]. PLoS One，7（1）：e29452.

Zeng Q C，Dong Y H，An S S. 2016. Bacterial community responses to soils along a latitudinal and vegetation gradient on the loess plateau，China[J]. PLoS One，11（4）：e0152894.

Zlotnikov K M， Zlotnikov A K， Kaparullina E N，Doronina N V. 2013. Phylogenetic position and phosphate solubilization activity of lactic acid bacteria associated with different plants[J]. Microbiology，82（3）：393-396.

（責(zé)任編輯 王 暉）